专利名称：一种重组腺病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种重组腺病毒及其应用。
背景技术：
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性系统紊乱疾病，其临床表现主要为对称性关节肿痛、侵蚀性滑膜炎，甚至进行性关节损伤、畸形、伤残，有时可累及眼、肺等关节外脏器。这种疾病困扰着全世界1-2%的人群，其中大多数是中年妇女，且大多数患者有慢性反复发作的病程。类风湿性关节炎的致残率很高，其治疗一直是人们关注的热点。目前，对类风湿性关节炎的治疗主要包括如非留体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、自体造血干细胞移植以及基因治疗等多种方法。随着对类风湿性关节炎发病机制的深入研究，人们提出了越来越多的治疗类风湿性关节炎的新策略，使许多患者病情得到缓解，但目前尚无根治方法。因此，研究新的治疗类风湿性关节炎的药物势在必行。对于类风湿性关节炎的治疗策略主要是控制相关炎症因子的平衡。目前以抑制促炎因子TNF-α和IL-I β的活性为重点，利用针对这两种促炎因子的抗体和其受体融合蛋白在临床应用上也取得了一定的效果，但是，还有一部分病人对于阻断这两种因子的治疗不敏感。因此，针对这一部分病人的治疗，需要研究其他的药物治疗策略。大量的研究表明，类风湿性关节炎病人的滑膜液中含有大量的Thl7细胞并高表达IL-17，这种促炎因子在关节炎的病理过程的上游起作用，能够刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-I β，也能够诱导滑膜细胞产生IL-6，IL-8，GM-CSF，PSE2 (prostaglandin E2)等因子。已经有研究表明，用 IL-17抗体中和IL-17后，CIA小鼠早期关节炎症减轻或消失，晚期CIA小鼠的骨损伤能够有一定程度的恢复。Thl7细胞分泌的IL-17包括IL-17A和IL-17F。这两个炎症分子都是通过IL-17 受体家族传递信号，从而影响下游基因表达的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组腺病毒及其应用。本发明提供的重组腺病毒，为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞，装配得到的重组腺病毒；所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞是通过重组载体实现的；所述重组载体为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体Ad-Track-CMV的Hind IIII和EcoR V识别位点间得到的质粒。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
所述宿主细胞为真核细胞。所述真核细胞为离体的哺乳动物细胞，优选为HEK-293细胞。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体Ad-Track-CMV的Hind III和EcoR V识别位点间得到的质粒。所述重组腺病毒或所述重组载体在制备预防和/或治疗自身免疫疾病产品中的应用也是本发明保护的范围。所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎。所述产品为药物。本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的疫苗。本发明提供的一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的疫苗，它的活性成分所述重组腺病毒或所述重组载体。本发明的实验证明，本发明构建和纯化Ad/hIL-17RD-E⑶-Fc的腺病毒载体，构建 CIA小鼠模型，用Ad-hIL-17RD-E⑶-Fc对CIA小鼠进行预防和治疗，最后通过He染色评价分析CIA小鼠关节炎症及骨损伤的减轻程度，从而为类风湿性关节炎的治疗提供一种新的有效的方法，并利用腺病毒介导的hIL-17RD受体的显性负突变体Ad/hIL-17RD-E⑶-Fe，开发能够通过抑制IL-17家族信号传导来治疗类风湿性关节炎的新候选药。
图1 为 Ad-hIL-17RD-ECD_Fc 的酶切鉴定图2为重组腺病毒Ad-hIL17RD-E⑶-Fc以及对照腺病毒Ad-GFP在293细胞中的表达图3为Wfestern blot对重组腺病毒表达物进行检测图4为Ad-IL17RD-ECD_Fc对于CIA小鼠关节炎的预防作用图5为Ad-IL17RD-ECD_Fc对于CIA小鼠关节炎的治疗作用
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、重组腺病毒的构建1、人白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白基因的形成人工合成序列1 作为模板，以 Sense primer 5，-ATAAAGCTTATGGCCCCGTGGCTGC-3， Antisense primer :5，-ATTCTCGAGTCATTTACCCGGGAGACAG_3，为引物，用Hind III和EcoRV对其进行酶切，胶回收1536bp的目的条带，将回收的片段连接到用同样限制性内切酶双酶切的 Ad-Track-CMV (购自 Stratagene，产品目录号 #240009)中，转化细菌 ToplO (invitrogen Catalog#C404003)，得到转化子。将转化子提取质粒，送去测序，结果为含有序列表中序列1所示核苷酸(hIL-17RD-ECD-Fc的核苷酸)的为阳性质粒，该质粒为将序列表中的序列1插入AcKTrack-CMV的Hind III和EcoR V酶切位点间得到的载体，将该载体命名为Ad-Track-CMV-hIL17RD-ECD_Fc。2、构建含人白介素17受体D胞外区Fc的腺病毒穿梭载体用Pmel 在 37 °C 下酶切载体 Ad-Track-CMV-hIL17RD-ECD_Fc 6h，然后转化进入含有Ad-Easy的BJ5183感受态细胞中(Ad-Easy购自Stratagene，产品目录号#240009 ； BJ5183感受态购自上海杰美基因医药科技有限公司，产品号GMS12205. 3 ；含有Ad-Easy的 BJ5183感受态细胞为将Ad-Easy电转化到BJ5183感受态细胞得到的细胞。)，170rpm37°C 培养池，涂卡纳抗性的LB平板，使其在37°C培养16h。挑取单克隆，170rpm 37°C培养20h。提取待定阳性克隆的质粒，Pacl酶切后用0. 8%的DNA跑胶鉴定，得到4. 5kb片段为阳性质粒。将阳性质粒转入TOP 10感受态，170rpm 37°C培养18小时，提取质粒，用Riiel 酶验证，结果如图1所示，其中1为质粒，2为酶切产物回收后小片段，从图中可以看出，得到 1536bp hIL-17RD-ECD-Fc片段，证明该质粒为阳性质粒。再次送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1通过同源重组到Ad-easy上得到的载体，记作Ad-hIL-17RD-ECD-Fc。采用同样的方法将空载体Ad-Track-CMV转化进入含有Ad-Easy的BJ5183感受态中，培养，提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将空载体Ad-Track-CMV通过同源重组到 Ad-easy上得到的载体，记作重组空载体Ad-Track_CMV。3、表达人白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的重组腺病毒用I^acl酶切Ad-hIL-17RD-ECD_Fc，乙醇沉淀回收并在当天转染HEK-293细胞 (北京协和医科大学)，收细胞，在液氮中反复冻融4次裂解，用裂解液感染IOOmm培养皿 (dish)融合度达到80%的细胞扩增病毒，至细胞变圆呈葡萄串状时收集所有细胞，500g转速离心，弃上清。以灭菌PBS重悬沉淀，在液氮中4次冻融裂解细胞，收集上清液，即为Ad/ hIL-17RD-ECD-Fc。以重组空载体Ad-Track-CMV为对照，收集上清液，即为Ad/GFP。在转染第10天后在荧光显微镜下观察，结果如图2所示，其中左图为 Ad-hIL-17RD-ECD-Fc 转染 HEK-293 细胞，右图为 Ad-Track-CMV 转染 HEK-293 细胞，可以看出，细胞出现绿色荧光(腺病毒载体Ad-easy上自带的荧光蛋白，重组好以后，会出现载体上GFP)，说明病毒包装成功，Ad-hIL-17RD-ECD-Fc转染HEK-293细胞得到病毒Ad/ hIL-17RD-ECD-Fc,重组空载体 Ad-Track-CMV 转染 HEK-293 细胞得到病毒 Ad/GFP。用试剂盒BIOMIGAViraTrapTM Adenovirus Purification Miniprep Kit (VI160) (购自BIOMIGA及产品目录号(V1160))纯化Ad/hIL-17RD-ECD_Fc和Ad/GFP，得到纯化后 Ad/hIL-17RD-ECD-Fc 和纯化后 Ad/GFP。测定病毒滴度将供试样品和BUFFER (BIOMIGA ViraTrapTM AdenovirusPurification Miniprep Kit (V1160)试剂盒中的 Elution Buffer 溶液。)用裂解液在56°C水浴裂解10分钟，放置至室温(25°C )，以BUFFER为空白对照，测定腺病毒样品的0拟60、0拟80，按以下公式计算滴度VP 滴度VP = 0D260X样品稀释倍数X 1. IXlO12, 得到的数值为VP浓度(每ml)。结果为纯化后Ad/hIL-17RD-ECD-Fc 滴度为 1. 3 X 1012v. p/ml，纯化的 Ad/GFP 的滴度为 1. IXlO12V. p/ml。分装保存于_80°C冰箱备用。4、用 Western blot 检测 Ad/hIL-17RD-ECD_Fc收集上述Ad-hIL-17RD_E⑶-Fc感染细胞的裂解液(重组腺病毒Ad/hIL-17RD-ECD-Fc的表达物)，经SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，应用hIL_17RD单抗(小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma)CGMCC No. 4576，扩大细胞培养获得。)(1 10000) 稀释和HRP标记的羊抗鼠IgG(bse-(^96G上海硕盟生物科技公司)检测。结果如图3所示，1为Ad-hIL-17RD-ECD-Fc感染细胞的裂解液，2为阳性对照Ad/hIL_17RD感染细胞的裂解液，从图中看出该抗体特异性良好，可以检测到Ad/hIL17RD-ECD-Fc表达，并且为预期的120kd的二聚体结构，Ad/hIL-17RD感染细胞的裂解液与Ad_hIL-17RD-ECD-Fc感染细胞的裂解液制备方法基本相同，其中，Ad/hIL-17RD构建方法和上面的Ad/hIL17RD-E⑶-Fc 基本相同，不同的是将hIL17RD-ECD-Fc替换成IL-17RD，hIL_17RD的核苷酸序列为 GenbankNMJ) 17563. 3 的第 1-2220 位核苷酸。。实施例2、重组腺病毒的应用1、CIA小鼠的构建取40只雄性DBA-I小鼠(中国科学院上海实验动物中心DBA-1小鼠)(10-12周龄)按照 Erik Lubberts (IL-l-Independent Role of IL-17 in Synovial Inflamation andjoint Destruction During Collagen—Induced Arthritis, J. Immunol. 2001,167 1004-1013)等的方法进行致敏抗原 Bovine type II collagen(CII)(牛二型胶原 SIGMA C7806-10MG)用0. 05M醋酸稀释至浓度为2mg/ml，然后将该浓度的CII用等体积的佛氏完全佐剂(CFA)进行乳化。乳化后在小鼠尾部皮下注射IOOul的CII/只(每只小鼠体重约为25g。)，得到过敏后的小鼠。在注射后21天即可观察到关节炎的发生，小鼠膝关节和踝关节处会出现明显的发红或肿胀。关节炎的评分通常根据测量鼠掌厚度，用0-3的评分进行评价0分< 3，0. 5分 3-3. 3，1 分 3. 4-3. 5。1. 5 分 3. 6-3. 8，2 分 3. 9-4. 1，2. 5 分 4. 1-4. 3，3 分> 4. 3mm)，采用双
盲实验。2、Ad/hIL-17RD-ECD-Fc对于CIA小鼠关节炎的预防和治疗将过敏后的小鼠分为如下两组处理，每组8只小鼠预防小组21天后，在小鼠腹腔注射注射弗氏不完全佐剂乳化的终浓度为lmg/ml 的CII，同时腹腔注射IO8Pfu的Ad/hIL-17RD-ECD-Fc，每3天注射1次共4次，预防阴性对照小组21天后，在小鼠腹腔注射注射弗氏不完全佐剂乳化的终浓度为lmg/ml的CII，同时腹腔注射108pfu的Ad/GFP，每3天注射1次共4次；实验重复三次，结果取平均值。注射后在第27、29、32、34天观察预防对照小组每只小鼠在第27、四、32、34天的鼠掌厚度分别为2. 6mm、3. 1mm、 3. 7mm,3. 8mm ；关节炎评分分别为 0、0. 6、1. 3,1. 5 ；预防小组每只小鼠在第27、四、32、；34天的鼠掌厚度分别为2. 6mm,2. 6mm,2. 7mm、 2. 8mm ；关节炎评分分别为0、0、0. 6、0. 5。将各组取1只小鼠采用断颈处死后，将其膝关节和踝关节分离并用10% (质量百分含量)福尔马林固定4天，用5% (质量百分含量)的甲酸脱钙后，样本进行石蜡包埋，组织切片(7um)根据HE染色分析CIA小鼠关节炎的预防结果，结果如图4所示，A为鼠掌厚度 (将上述数值作图)，B为关节炎评分(将上述数值作图)，从图C，D中可看出，预防组Ad/ IL-17RD-E⑶-FcHE染色中炎症细胞(蓝紫色，箭头所指的区域)明显少于预防对照组Ad/GFP，说明预防组病情好于预防对照组，预防组的小鼠炎症程度明显低于对照组。将上述二次致敏后产生关节炎的D B A-I小鼠根据其病情分组，进行如下分组处理，每组小鼠8只(1. 25分病情的小鼠进行注射108pfuAd/IL-17RD-E⑶-Fc治疗)治疗组将1. 25分病情小鼠腹腔注射IO8Pfu的Ad/IL-17RD_E⑶-Fc进行治疗，每 3天注射1次，共5次，治疗对照组将1. 25分病情小鼠腹腔注射IO8Pfu的Ad/GFP进行治疗，每3天注射1次，共5次，治疗对照小组每只小鼠在注射病毒后的第46、49、52、M、59、61天的鼠掌厚度分别为 3. 6mm、4. 25mm、4. lmm、4. 2mm、4. 15mm、3. 9mm ；关节炎评分分别为 1. 25,2. 25、2、2、 2. 25,1. 7 ；治疗小组每只小鼠在注射病毒后第46天、49天、52天、54天、59天、61天的鼠掌厚度分别为 3. 6mm、3. mm、3. 4mm,3. 35mm,3. 25mm、3. 2mm ；关节炎评分分别为 1. 25、1. 3、1. 1、 0. 9、0· 9、0· 8。将各组取1只小鼠采用断颈处死后，将其膝关节和踝关节分离并用10% (质量百分含量)福尔马林固定4天，用5% (质量百分含量)的甲酸脱钙后，样本进行石蜡包埋，组织切片(7um)根据HE染色分析CIA小鼠关节炎的治疗结果，作图如图5所示，A为鼠掌厚度 (将上述数值作图)，B为关节炎评分(将上述数值作图)，从C，D图中可看出，治疗组Ad/ IL-17RD-E⑶-FcHE染色中炎症细胞(蓝紫色，箭头所指的区域)明显少于治疗对照组Ad/ GFP,说明治疗组病情好于治疗对照组。
权利要求
1.一种重组腺病毒，为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞，装配得到的重组腺病毒；所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞是通过重组载体实现的；所述重组载体为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体 Ad-Track-CMV的多克隆位点间得到的质粒。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组病毒，其特征在于所述宿主细胞为真核细胞。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组病毒，其特征在于所述真核细胞为离体的哺乳动物细胞，优选为HEK-293细胞。
6.一种重组载体，为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体 Ad-Track-CMV的多克隆位点间得到的质粒。
7.权利要求1-5中任一所述重组腺病毒或权利要求6所述重组载体在制备预防和/或治疗自身免疫疾病产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
10.一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的疫苗，它的活性成分权利要求1-5中任一所述重组腺病毒或权利要求6所述重组载体。
全文摘要
本发明公开了一种重组腺病毒及其应用。本发明提供的重组腺病毒，为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞，得到的重组腺病毒；所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞通过重组载体实现；本发明的实验证明，本发明构建和纯化Ad/hIL-17RD-ECD-Fc的腺病毒载体，构建CIA小鼠模型，用Ad-hIL-17RD-ECD-Fc对CIA小鼠进行预防和治疗，最后通过He染色评价分析CIA小鼠关节炎症及骨损伤的减轻程度，从而为类风湿性关节炎的治疗提供一种新的有效的方法。
文档编号A61K48/00GK102168074SQ20111003973
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者任芳丽, 夏永静, 孙小军, 常智杰, 杨世高, 王银银 申请人:清华大学