专利名称：一种冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物及其在制备抗疲劳产品的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种冬虫夏草菌丝体发酵提取物，具体来说是涉及一种冬虫夏草 (Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)菌丝体固体发酵提取物，另外还涉及这种固体发酵提取物在抗疲劳方面的应用。
背景技术：
近年来，研究开发抗疲劳的天然药物已成为国内外的关注热点。冬虫夏草作为一种滋补中药，具有保肺益肾、止咳化痰、治阳痿遗精及腰膝酸痛等功效，是最贵重的一种药用真菌，其重要的药用价值和广泛的药理作用享誉全世界。现代研究表明，冬虫夏草在消除运动性疲劳和增强运动能力方面有其独特的优势，不仅能增加运动员体内的能量物质，而且有调节神经内分泌、加强代谢等作用，并可刺激体内激素的分泌释放，增强心血管系统、 消化系统以及造血系统、骨骼系统等功能，延缓过度疲劳的产生。目前有关于天然冬虫夏草、冬虫夏草头孢虫草(即冬虫夏草菌种，是冬虫夏草的无性型)液体培养菌丝体及其滤液的抗疲劳效果研究(郑伟等。三种冬虫夏草制剂抗疲劳作用的比较。航空军医，2003，31 O) :49-50)，发现菌液组对增强小鼠记忆力效果最好。还有关于蝙蝠蛾拟青霉发酵所产生的冬虫夏草菌丝体的抗疲劳作用的研究(陈新霞等。冬虫夏草菌丝体的抗疲劳作用研究。中国生化药物杂志，2009，30 (5) :321-323)，结果表明冬虫夏草菌丝体能显著延长小鼠负重游泳时间(P < 0. 05)，增加小鼠肝糖原储备量(P < 0. 01)， 降低运动后小鼠血乳酸含量(P <0.01)，具有明显的抗疲劳作用。因此现在开发出很多冬虫夏草菌丝体的保健品，但大多数是以液体深层发酵的方法来获得菌丝体的，如中国专利 200810167083. 8披露了一种冬虫夏草菌丝体饮料及其制备方法，中国专利200910110525. X披露了一种人工发酵培养冬虫夏草在制备抗疲劳、耐缺氧保健品或药品中的应用。此外， 也有研究表明人工固体发酵培养的冬虫夏草菌丝体虫草多糖含量明显高于天然虫草(刘仲敏等。人工固体发酵培养冬虫夏草菌丝体的研究。河南科学，1994，12 ) :335-338)，以及冬虫夏草菌丝体固体发酵粉中3’ -脱氧腺苷，甘露醇的含量明显高于冬虫夏草子实体相应的成分的研究(王尊生，等。冬虫夏草菌丝体固体发酵粉化学成分的分析。天然产物研究与开发，2005，17 (3) :331-336)。但还没有利用冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物来开发抗疲劳产品的报道或相关的技术专利。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物，另外还开发出这种冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物在抗疲劳方面的用途。我们将野生冬虫夏草(Cordyc印s sinensis (Berk. ) Sacc.)子实体通过菌种收集、 保藏与复壮，母种、一级液体种和二级生产种的制作，固体发酵物的制备，固体发酵提取物的提取等步骤，得到的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物能够有效提高负重游泳小鼠的游泳时间，从而实现了本发明的目的。本发明的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物，其特征是由包括以下步骤的方法制备得到(1)将野生冬虫夏草(Cordyc印s sinensis (Berk. ) Sacc.)子实体进行组织分离， 于冬虫夏草斜面培养基上培养，获得纯菌株，并进行复壮，所述的冬虫夏草斜面培养基按其总质量分数100%计，由葡萄糖 2%，蛋白胨0. 5% 1%，麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%, 酵母浸膏0. 3% 0. 5%，琼脂2%和余量的水组成；(2)将步骤(1)的纯菌株接入无菌的冬虫夏草斜面培养基中，10 15°C下，暗培养 30 35天后，光照4 6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种，所述的冬虫夏草斜面培养基组成与步骤(1)相同；(3)将母种经复壮挑选后接至无菌冬虫夏草液体培养基中，振荡培养10 20天， 选取菌丝球大小均勻一致、直径为2 3mm的菌种作为一级液体菌种，所述的冬虫夏草液体培养基PH 6.0 6. 5，按其总质量分数100%计，由葡萄糖^ ？^，蛋白胨化5% 1%， 麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%，酵母浸膏0. 3% 0. 5%和余量的水组成；(4)将步骤C3)得到的一级液体菌种接入冬虫夏草液体培养基中进行培养，一级液体菌种体积是冬虫夏草液体培养基体积的3% 10%，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2 3mm的菌种作为二级生产种，所述的冬虫夏草液体培养基及培养方法与步骤(3)相同；(5)在无菌的环境下，将二级生产种用无菌水按体积比1 1 1. 3稀释后接入无菌的固体发酵培养基中，进行避光培养9 14天至菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强 400 ΙΟΟΟΙχ，空气相对湿度80% 90%，10 15°C，经7 12天后得到冬虫夏草菌丝体固体发酵物，所述的固体发酵培养基是按Ikg大米和1 1. 3L营养液的比例配制而成，所述的营养液pH6. 0 6. 5，按总质量分数100%，由葡萄糖1% 2(%，蛋白胨0.5(% 1(%， 麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%，酵母浸膏0. 3% 0. 5%和余量的水组成；(6)将步骤(5)得到的冬虫夏草菌丝体固体发酵物在40 60°C的温度下烘干，粉碎，再加入10 50倍体积的蒸馏水，通过80 90°C的热水回流提取1 3次，趁热抽滤， 合并滤液，浓缩至滤液体积的30% 50%，得到冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物。上述所用的麦芽提取粉和酵母浸膏都是市售品。步骤(1)所述的组织分离可采用常规的方法进行，步骤(1)和步骤C3)所述的复壮是为了防止菌株退化，可以采用常规方法进行。本发明的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物的制备方法和优化条件同上所述。本发明的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物可用于制备抗疲劳产品。本发明制备冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物的方法与常用的液体发酵法相比较具有工艺简单，环保，无废液排放，成本低廉等特点，因此具有广泛的实用性和可操作性。经实验证明由本发明方法制备的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物能显著延长小鼠负重游泳时间，因此具有良好的抗疲劳作用。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1 将收集到的野生冬虫夏草(Cordyc印s sinensis (Berk. ) Sacc.)子实体通过常规方法进行组织分离，按0. 3cmX0. 5cm大小的量接于冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数 100%计，由葡萄糖1%，蛋白胨0. 5%，麦芽浸出粉0. 3%，酵母浸膏0. 3%，琼脂2%和余量的水组成)上培养，获得纯菌株，为防止菌株退化，按照常规方法(选取新鲜子实体，在无菌条件下进行组织分离，接种至冬虫夏草斜面培养基上，置于15°C下，遮光培养5 7d。以出发菌株为对照，比较所得菌株的生长能力，主要观察菌丝的生长速度、转色速度和原基形成数量等情况。最后，对斜面生长情况较好的菌株进行试验。)对菌种进行复壮。将原始菌株按0. 3cmX0. 5cm大小的量接入无菌的冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数100%计，由葡萄糖1%，蛋白胨0. 5%，麦芽浸出粉0. 3%，酵母浸膏0. 3%，琼脂 2%和余量的水组成)中，10°C下，暗培养30天后，光照4天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种。取葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出粉3g，酵母浸膏3g，溶解于无菌水979g，调整 PH至6. 0，得到冬虫夏草液体培养基。将母种经复壮挑选(选取新鲜子实体，在无菌条件下进行组织分离，接种至冬虫夏草斜面培养基上，置于15°C下，遮光培养5 7d。以出发菌株为对照，比较所得菌株的生长能力，主要观察菌丝的生长速度、转色速度和原基形成数量等情况。最后，对斜面生长情况较好的菌株进行试验。)后接至无菌冬虫夏草液体培养基中，振荡培养10天，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2mm的作为一级菌种。将一级液体菌种3mL接入IOOmL冬虫夏草液体培养基中，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2毫米的作为二级生产种，用于虫草的固体发酵生产。将葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出粉3g，酵母浸膏3g，无菌水979g混合，调节pH 至6.0，得到营养液。将大米Ikg和营养液IL配制成固体发酵培养基，经高压灭菌，冷却后即可用于接种。在无菌室内，将二级生产种用无菌水按体积比1 1稀释后接入无菌的固体发酵培养基中，每瓶接入17mL。再进行避光培养9天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强 4001x，空气相对湿度80%，10°C，7天后得到冬虫夏草菌丝体固体发酵物。将冬虫夏草菌丝体固体发酵物在40°C的烘箱内烘干，并将其粉碎，再加入10倍体积的蒸馏水，通过80°C的热水回流提取1次，趁热抽滤，浓缩至滤液体积的30%，得到冬虫夏草固体发酵提取物。实施例2 将收集到的野生冬虫夏草(Cordyc印s sinensis (Berk. ) Sacc.)子实体通过常规方法进行组织分离，按0. 3cmX0. 5cm大小的量接于冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数 100%计，由葡萄糖1. 5%，蛋白胨0. 8%，麦芽浸出粉0. 4%，酵母浸膏0. 4%，琼脂2%和余量的水组成)上培养，获得纯菌株，为防止菌株退化，按照实施例1的常规方法对菌种进行复壮。将原始菌株按0. 3cmX0. 5cm大小的量接入无菌的冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数100%计，由葡萄糖1. 5%，蛋白胨0. 8%，麦芽浸出粉0. 4%，酵母浸膏0. 4%，琼脂 2%和余量的水组成)中，13°C下，暗培养33天后，光照5天，选取转色较快且菌丝生长整齐
5的菌种，作为母种。取葡萄糖15g，蛋白胨8g，麦芽浸出粉4g，酵母浸膏4g，溶解于无菌水969g，调整 PH至6. 3，得到冬虫夏草液体培养基。将母种按照实施例1的常规方法复壮挑选后接至无菌冬虫夏草液体培养基中，振荡培养15天，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2mm的作为一级菌种。将一级液体菌种7mL接入IOOmL冬虫夏草液体培养基中，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2mm的作为二级生产种，用于虫草的固体发酵生产。将葡萄糖19. 5g，蛋白胨10. 4g，麦芽浸出粉5. 2g，酵母浸膏5. 2g，无菌水1259. 7g 混合，调节PH至6. 3，得到营养液。将大米Ikg和营养液1. 3L配制成固体发酵培养基，经高压灭菌，冷却后即可用于接种。在无菌室内，将二级生产种用无菌水按体积比1 1.2稀释后接入无菌的固体发酵培养基中，每瓶接入19mL。再进行避光培养12天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养， 光强7001x，空气相对湿度85%，12°C，10天后得到冬虫夏草菌丝体固体发酵物。将冬虫夏草菌丝体固体发酵物在50°C的烘箱内烘干，并将其粉碎，再加入30倍体积的蒸馏水，通过90°C的热水回流提取2次，趁热抽滤，浓缩至滤液体积的40%，得到冬虫夏草固体发酵提取物。实施例3 将收集到的野生冬虫夏草(Cordyc印s sinensis (Berk. ) Sacc.)子实体通过常规方法进行组织分离，按0. 3cmX0. 5cm大小的量接于冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数 100%计，由葡萄糖2%，蛋白胨1%，麦芽浸出粉0. 5%，酵母浸膏0. 5%，琼脂2%和余量的水组成)上培养，获得纯菌株，为防止菌株退化，按照实施例1常规方法对菌种进行复壮。将原始菌株按0. 3cmX0. 5cm大小的量接入无菌的冬虫夏草斜面培养基(按其总质量分数100 %计，由葡萄糖2 %，蛋白胨1 %，麦芽浸出粉0. 5 %，酵母浸膏0. 5 %，琼脂2 % 和余量的水组成)中，15°C下，暗培养35天后，光照6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种。取葡萄糖20g，蛋白胨10g，麦芽浸出粉5g，酵母浸膏5g，溶解于无菌水960g，调整 PH至6. 5，得到冬虫夏草液体培养基。将母种按照实施例1常规方法复壮挑选后接至无菌冬虫夏草液体培养基中，振荡培养20天，选取菌丝球大小均勻一致、直径为3mm的作为一级菌种。将一级液体菌种IOmL接入IOOmL冬虫夏草液体培养基中，选取菌丝球大小均勻一致、直径为3mm的作为二级生产种，用于虫草的固体发酵生产。将葡萄糖Mg，蛋白胨12g，麦芽浸出粉6g，酵母浸膏6g，无菌水1152g混合，调节 PH至6. 5，得到营养液。将大米Ikg和营养液1. 2L配制成固体发酵培养基，经高压灭菌，冷却后即可用于接种。在无菌室内，将二级生产种用无菌水按体积比1 1.3稀释后接入无菌的固体发酵培养基中，每瓶接入22mL。再进行避光培养14天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养， 光强ΙΟΟΟΙχ，空气相对湿度90%，15°C，12天后得到冬虫夏草菌丝体固体发酵物。将冬虫夏草菌丝体固体发酵物在60°C的烘箱内烘干，并将其粉碎，再加入50倍体积的蒸馏水，通过90°C的热水回流提取3次，趁热抽滤，浓缩至滤液体积的50%，得到冬虫夏草固体发酵提取物。实施例4 取经检疫后的SPF级KM雄性小鼠作为实验动物，以每组10只/笼，群养，自由进食饮水为条件进行实验。实验组用实施例1的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物 1. 82g · kg-1 · Cf1为剂量，每天按0. 2mL/10g体重灌胃给予相应小鼠；蒸馏水对照组给予等量的蒸馏水；安神补脑液(来源吉林敖东延边药业股份有限公司，编号MC10008，批号 1003012，主要成份鹿茸、何首乌、淫羊藿、干姜、甘草、大枣、维生素Bi，购自市场)组按 0. 2mL/10g体重给予安神补脑液；每天1次，连续给药30天。30天后进行负重游泳实验， 实验结果表明本发明提取物能显著延长小鼠负重游泳时间(P < 0. 05)(试验结果对照组的游泳平均时间是25. 5567分钟，标准差是6. 795029835 ；安神补脑液组的游泳平均时间 34. 0083分钟，标准差8. 782526428, ρ值0. 027044024 ；实验组的游泳平均时间41. 0034分钟，标准差 20. 45147758，ρ 值 0. 035974568)。
权利要求
1.一种冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物，其特征是由包括以下步骤的方法制备得到(1)将野生冬虫夏草Cordyc印ssinensis (Berk. ) Sacc.子实体进行组织分离，于冬虫夏草斜面培养基上培养，获得纯菌株，并进行复壮，所述的冬虫夏草斜面培养基按其总质量分数100%计，由葡萄糖 2%，蛋白胨0. 5% 1(%，麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%，酵母浸膏0.3% 0.5%，琼脂2%和余量的水组成；(2)将步骤(1)的纯菌株接入无菌的冬虫夏草斜面培养基中，10 15°C下，暗培养 30 35天后，光照4 6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种，所述的冬虫夏草斜面培养基组成与步骤(1)相同；(3)将上述母种经复壮挑选后接至无菌冬虫夏草液体培养基中，振荡培养10 20天， 选取菌丝球大小均勻一致、直径为2 3mm的菌种作为一级液体菌种，所述的冬虫夏草液体培养基PH 6.0 6. 5，按其总质量分数100%计，由葡萄糖！^ ？^，蛋白胨化5% 1%， 麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%，酵母浸膏0. 3% 0. 5%和余量的水组成；(4)将步骤C3)得到的一级液体菌种接入冬虫夏草液体培养基中进行培养，一级液体菌种体积是冬虫夏草液体培养基体积的3% 10%，选取菌丝球大小均勻一致、直径为2 3mm的菌种作为二级生产种，所述的冬虫夏草液体培养基及培养方法与步骤C3)相同；(5)在无菌的环境下，将上述二级生产种用无菌水按体积比1 1 1. 3稀释后接入无菌的固体发酵培养基中，进行避光培养9 14天至菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强 400 ΙΟΟΟΙχ，空气相对湿度80% 90%，10 15°C，经7 12天后得到冬虫夏草菌丝体固体发酵物，所述的固体发酵培养基是按Ikg大米和1 1. 3L营养液的比例配制而成，所述的营养液PH6. 0 6. 5，按总质量分数100%，由由葡萄糖 2%，蛋白胨0. 5^-1%, 麦芽浸出粉0. 3% 0. 5%，酵母浸膏0. 3% 0. 5%和余量的水组成；(6)将步骤( 得到的冬虫夏草菌丝体固体发酵物在40 60°C的温度下烘干，粉碎， 再加入10 50倍体积的蒸馏水，通过80 90°C的热水回流提取1 3次，趁热抽滤，合并滤液，浓缩至滤液体积的30% 50%，得到冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物。
2.权利要求1所述的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物在制备抗疲劳产品方面的用途。
全文摘要
本发明涉及一种冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物及其在制备抗疲劳产品方面的用途。其特征是通过将野生冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.子实体通过菌种收集、保藏与复壮，母种、一级液体种和二级生产种的制作，固体发酵物的制备，固体发酵提取物的提取等步骤制备得到本发明的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物。本发明制备冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物的方法与常用的液体发酵法相比较具有工艺简单，环保，无废液排放，成本低廉等特点，因此具有广泛的实用性和可操作性。经实验证明由本发明方法制备的冬虫夏草菌丝体固体发酵提取物能显著延长小鼠负重游泳时间，因此具有良好的抗疲劳作用，可用于制备抗疲劳产品。
文档编号A61P39/00GK102174417SQ20111004348
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者劳景辉, 姜子德, 宋斌, 李挺, 李泰辉, 林群英, 沈亚恒, 闫文娟 申请人:广东省微生物研究所