专利名称：微管蛋白配基亲和材料的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及的是亲和色谱技术领域，具体涉及微管蛋白-壳聚糖微球亲和材料的制备及利用该亲和材料作为填料制备固相萃取柱，分离、纯化中药提取物中的抗肿瘤活性成分的方法。
背景技术：
(1)恶性肿瘤是当今人类主要的死亡原因之一。目前治疗肿瘤的方法主要有手术、 放射、药物和免疫疗法。化学药物治疗是肿瘤治疗中发展最快的一个领域，但大部分的抗肿瘤活性成分由于来源极为有限、含量很低且在其提取液中含有大量的杂质及各种衍生产物，难以获得纯净的产物，因此在杀死肿瘤细胞的同时对正常组织、细胞存在着严重的毒副作用，影响了临床上的应用。因此建立高效、靶向地分离富集抗肿瘤活性成分的方法是减少抗肿瘤药物毒副作用，提高药效的有效途径之一，也是目前抗肿瘤药物研究领域的热点之
ο(2)微管(microtubulin)是由α、β -微管蛋白(tubulin)异源二聚体及少量微管结合蛋白聚合而成的亚稳定的动态结构，其在细胞中具有诸多功能，特别是以纺锤体的形式参与细胞的有丝分裂过程，这一功能使之成为抗癌药物的重要靶点。由于很多抗肿瘤的活性成分与微管蛋白的结合是高效、专一且可逆的，如长春花碱在微管蛋白亚单位上的结合是快速可逆的；紫杉醇在微管蛋白亚单位上的结合部位隐蔽在微管内表面，结合后的紫杉醇又可微管小孔道出入或从网格结构的振动中解离出来。因此若将微管蛋白应用于这些活性成分的分离富集将会大大的提升提取效率、降低成本并且得到更为纯净的产物。然而这种方法具体实施起来尚存在很多问题，如微管蛋白易流失和微管蛋白不能反复利用等。因此这就急需寻找一种合适的载体将微管蛋白与其结合，从而制成一种亲和材料方便将其作为填料装入亲和色谱柱中，这样就能克服微管蛋白作为提取介质的种种不足，从而实现对抗肿瘤活性成分的靶向提取分离。但是，作为载体的材料需要具备能与微管蛋白结合、外形为均勻的微球便于填充色谱柱中。(3)壳聚糖(chitosan)是虾、蟹和昆虫骨架中提取物甲壳素的N-脱乙酰基衍生物。它来源丰富，是一种可再生的天然高分子材料，具有良好的生物相容性、易生物降解、无毒、良好的成模性等特性。另外，其分子中富含的游离氨基和羟基，能与微管蛋白表面相应的配基或抗体进行连接，这就有利于将其制备成微管蛋白的载体。因此，用壳聚糖制成的微球是理想的载体材料。目前制备壳聚糖微球主要有以下几种方法1)乳化交联法该法是先将壳聚糖溶于醋酸溶液中，再加入含表面活性剂(如 Tween类)的油相中，经搅拌或超声处理，形成乳剂(W/0型)，再加入交联剂交联，过滤或离心后用适宜的溶剂冲洗，干燥，即可制得微球。2)液中干燥法该方法是将壳聚糖的醋酸溶液加入到含表面活性剂的液体石蜡中，形成W/0型乳剂；然后升温使壳聚糖交联；最后减压干燥除去溶剂，分离得到微球。
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3)复乳法该法是先将一定量有机溶剂分散于壳聚糖的醋酸溶液中，形成0/W型初乳；再将此初乳滴于油相中制成0/W/0型复乳，经化学交联再离心、纯化、干燥，从而得到疏水性药物的壳聚糖微球。4)沉淀/凝聚法该法是在搅拌条件下将壳聚糖的稀醋酸溶液用注射器缓缓滴入含不同浓度的阴离子胶凝剂水溶液中；然后将所得沉淀过滤后，再洗净干燥即得壳聚糖微球。此法的特点是不使用有机溶剂和戊二醛、甲醛等化学交联剂，残留少、毒性小等。我们拟采用乳化法制备壳聚糖微球载体，这种方法制备简单，后处理亦方便。然后在缓冲盐介质条件下，加入微管蛋白经搅拌反应后，得到微管蛋白亲和介质材料，微管蛋白构象不会发生改变，并将其填充于亲和色谱柱中对中药提取液中抗肿瘤活性成分进行靶向 m集分1 ο
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备微管蛋白-壳聚糖微球亲和材料的方法，并提供利用该亲和材料作为固相萃取柱的填料从中药粗提物中分离、富集、纯化抗肿瘤活性成分的方法。本发明通过以下的技术方案实现的，具体包括步骤如下1.壳聚糖微球的制备(1)精密称取Ig壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液，作为水相；(2)精密量取4. 5mLTween 80倒入装有于225mL的太阳油的烧杯中，混勻，作为油相；(3)将15mL水相逐滴加入到225mL油相中，以450rpm的转速搅拌lh，形成W/0型乳液；(4)向W/0型乳液中，逐滴加入25%戊二醛lmL，以450rpm的转速搅拌证，进行交联固化；(5)将所得产物离心，洗涤，放置于磷酸缓冲盐中。(6)加入1.6mg/ml微管蛋白适量，搅拌反应3小时后，置于0°C保存。2.制备固相萃取柱对中药提取液进行富集(1)提取中药中的活性部位称取药材粉末适量，加入溶剂适量，采用超声提取方法，过滤，浓缩定容，备用；(2)将上述得到的微管蛋白亲和介质材料填充到固相萃取柱中，并用适当溶液平衡柱子；取中药材提取液5mL上样后，用适当溶剂进行洗脱，收集并浓缩、定容，采用HPLC/ MS法进行定性分析。
附图1是微管蛋白亲和介质结合性能考察色谱图和前沿色谱图Ia是经亲和吸附并洗脱之后洗脱液色谱图，Ib是初始的供试品溶液，比较两者差异，很明显Ia中没有穿心莲内酯色谱峰，显然这一成分未能与微管蛋白亲和介质结合，这表明该亲和材料有良好的生物专一性。图Ic和Id分别为秋水仙碱和紫杉醇与微观蛋白亲和介质结合的前沿色谱图。图2是微管蛋白亲和介质的形态电镜扫描图，放大6000倍，粒径在5 μ m左右。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1 提取宽叶金粟兰中的抗肿瘤活性成分(1)壳聚糖微球的制备精密称取Ig壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液，作为水相；再精密量取4. 5mLTween 80倒入装有于225mL的太阳油的烧杯中，混勻，作为油相；将15mL水相逐滴加入到225mL油相中，以450rpm的转速搅拌lh，待此悬浊液形成W/ 0型乳液后，往其中逐滴加入ImL 25%戊二醛，以450rpm的转速搅拌证，进行交联固化。之后，将所得产物离心，洗涤，干燥即得到壳聚糖微球。(2)微管蛋白-壳聚糖微球的制备取一定量壳聚糖微球，加入1. 6mg/ml微管蛋白溶液，按质量体积比1 10加入，搅拌反应3小时后，置于0°C保存，过滤，即得。(3)固相萃取分离纯化中药粗提取液中的抗肿瘤活性成分称取宽叶金粟兰药材 0. 5g研磨成细粉(过四号筛)，加人40 %甲醇溶液25mL，放入超声波中超声40min后，提取液旋转蒸发除去溶剂后得到中药宽叶金粟兰粗提物，再用甲醇溶解并定容至25mL。称取 200mg制备好的微管蛋白-壳聚糖微球，采用干法装柱，依次加入甲醇和40%甲醇溶液平衡固相萃取柱后，取宽叶金粟兰粗提取液2mL，上样，往柱中加压，控制流速为0. 5mL/min,再用5mL甲醇溶液洗脱保留在萃取柱上的物质。经HPLC检测，洗脱液含有4四个色谱峰，从光谱图显示为倍半萜内酯类成分。实施例2 提取苦参中的抗肿瘤活性成分(1)微管蛋白-壳聚糖微球的制备同前。(2)固相萃取分离纯化中药粗提取液中的抗肿瘤活性成分称取苦参药材0. 5g研磨成细粉(过四号筛)，加人0.2%醋酸甲醇溶液25mL，放入超声波中超声40min后，提取液旋转蒸发除去溶剂后得到中药苦参粗提物，再用甲醇溶解并定容至25mL。称取200mg制备好的微管蛋白-壳聚糖微球，采用干法装柱，依次加入甲醇平衡固相萃取柱后，取苦参粗提取液2mL，上样，控制流速为0. 5mL/min，再用5mL甲醇溶液洗脱保留在萃取柱上的物质。 经HPLC检测，洗脱液中含有5个的生物碱类的活性成分。
权利要求
1.本发明的目的在于提供一种微管蛋白-壳聚糖微球亲和材料的制备方法，并以该亲和材料作为填料制备固相萃取柱从中药粗提物中分离、富集、纯化抗肿瘤活性成分的方法。
2.权利要求1所述微管蛋白-壳聚糖微球亲和材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液，作为水相；(2)将含有乳化剂的太阳油，作为油相；(3)将水相逐滴加入到油相中，搅拌，形成W/0型乳液；(4)向W/0型乳液中，逐滴加入交联剂搅拌，进行交联固化；(5)将所得产物离心，洗涤，放置于磷酸缓冲盐中。(6)加入微管蛋白，搅拌反应，置于0°C保存。
3.根据权利要求2的要求，所述的壳聚糖醋酸溶液的浓度，按质量体积比为1%。
4.根据权利要求2的要求，水相和油相按体积比为1 15，水相和油相的用量分别为 15mL 禾口 225mL。
5.根据权利要求2的要求，油相中，按体积百分比，乳化剂的含量为2%，乳化剂是 Tween80o
6.根据权利要求2的要求，交联剂是25%戊二醛，用量为lmL。
7.根据权利要求2的要求，步骤(3)中，搅拌的转速为450rpm，搅拌时间为1小时。
8.根据权利要求2的要求，步骤中，搅拌的转速为450rpm，搅拌时间为5小时。
9.根据权利要求2的要求，步骤(6)中，反应时间为3小时。
全文摘要
本发明公开了从中药材中靶向分离富集抗肿瘤活性成分的微管蛋白配基亲和材料的制备及其应用方法。该方法包括两步骤(1)制备微米级壳聚糖微球，以此作为载体将微管蛋白通过交联吸附固定于其上制成亲和材料。(2)将该材料作为填充料制备固相萃取柱，对具有抗肿瘤药效的中药提取物进行靶向分离富集。这种亲和材料性能稳定、生物专一性好，能实现低含量复杂结构抗肿瘤活性成分的富集，与传统的吸附材料C18相比，对目标成分的靶向富集率高30％，且通用性好，可以应用于各类具有抗肿瘤药效药材中活性成分的富集筛选。该方法筛选准确度高，灵敏度高，适用范围广，且操作过程简单、减少了溶剂使用量，提取更为安全、环保，能够达到去除杂质、纯化及富集抗肿瘤活性成分的目的。
文档编号A61P35/00GK102234376SQ201110054020
公开日2011年11月9日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者尹小英, 江一帆, 罗杠, 罗永明, 肖青, 马兴霞 申请人:江西中医学院