专利名称：鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防由1、2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎的油 乳剂疫苗制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA))引起鸭 的一种呼吸系统重要传染病。鸭传染性浆膜炎anfectious serositis)是由鸭疫里默氏 杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鸭的一种慢性或急性败血性接触性传染性疾 病，又称鸭疫里默氏杆菌病、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症。主要侵害雏鸭、雏鹅、以及雏火 鸡等多种雏禽，以2 7周龄鸭最易感，主要表现为浆膜炎、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊 炎、脑膜炎等。由于本病的高死亡率和高淘汰率目前已经成为严重危害养鸭业的疾病之一。对鸭疫里默氏杆菌的血清型分类始于1969年，Harry采用试管凝集试验鉴定出16 个血清型(A P)，几年后美国国立动物疾病中心采用沉淀试验鉴定出7个血清型，以阿拉 伯数字命名为1 7型，考虑到命名的标准化以及将来新型的增加，1982年Bisgarrd建议 用阿拉伯数字对血清型进行命名，将已有的血清型命名为1 13型。在此基础上Sandhu 和Leister对血清型重新进行整理，加上新发现的血清型取名为1 17型，加上后来Lon 等报道的18、19型和I^athansophon等报道的20、21型，至此世界上报道的RA血清型共有 21型。2003年我国四川农业大学程安春教授等报道了 22 25四个新的血清型，进一步丰 富了该病的病原学的研究。由于各型毒力有所差异，型间交叉保护性极差或缺少，因此对某 地区本病的预防，最好方法是制备与当地相关型疫苗，才能获得最佳的免疫效果。(1、程安 春，等.我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现[J].中国畜牧兽医学会禽病学 分会第十一次学术研讨会论文集，2004，453-457.)。
发明内容
本发明的目的是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型TOSD株分 别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预 防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。一、生产用菌株1.菌株来源制造和检验用鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型TOSD株由本发明人分离、鉴定、保 存和供应，该两株已于2011年2月25日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号YBSD株 为 CGMCC No. 4614，YBYN 株为 CGMCC No. 4615。2.毒株特点(1)形态本菌为革兰氏阴性(G-)小杆菌，有荚膜、无芽孢、无鞭毛，常单个存在， 少数呈双排列，偶见呈长丝状排列，涂片经瑞氏染色，可见部分菌体两端浓染。
(2)生化特性过氧化氢酶、氧化酶、精氨酸脱羧酶试验为阳性，能缓慢液化明胶， 靛基质、VP、甲基红、柠檬酸利用、硝酸盐还原试验为阴性，不产生硫化氢，不发酵葡萄糖、蔗 糖、乳糖、麦芽糖。(3)培养特性本菌在普通琼脂培养基和麦康凯培养基上不生长。初次分离培养， 需要供给5% 10%的C02。将本菌接种于巧克力琼脂、含3%小牛血清的胰蛋白胨大豆琼 脂(改良TSA配方见附注2)，置5% 10% C02、37°C培养M 48小时，可生长出圆形微 隆起、表面光滑、直径1 2mm无色素菌落。在5%绵羊鲜血琼脂平板上生长但不溶血。在 含有3%小牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，37°C培养M小时，呈上下一致轻微浑浊， 管底有少量沉淀，无菌膜。(4)血清型YBYN株为鸭疫里默氏杆菌1型JBSD株为鸭疫里默氏杆菌2型。(5)最小致病菌量能使10只1月龄健康易感鸭至少7只发病的最小致病菌量分 别为YBYN 株为 1 X IO9CFU, YBSD 株为 2X l(fCFU。(6)免疫原性用鸭疫里默氏杆菌YBYN JBSD株灭活菌液按水相油相=1 2的 比例分别制备单价油乳剂灭活疫苗(灭活前各型活菌含量约为lX109CFU/ml)，分别颈部皮 下注射3-7日龄健康易感鸭10只，0.3ml/只，另设两个非免疫对照组，每组各10只。免疫 后14日，连同相同饲养条件下的对照鸭各一组，分别用相应的YBYN株JBSD株新鲜菌液腿 部肌肉注射攻毒Iml (TOYN株活菌含量约为2X 109CFU/ml，TOSD株活菌含量约为4X IO8CFU/ ml)，观察10日，每株菌攻毒后对照组应至少8只发病(发病判定标准详见附注1)，免疫组 应至少8只保护。二、鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗的生产方法，主要是1.采用发酵罐分别培养YBYN菌株JBSD菌株。先将半合成肉汤培养基(胰蛋白胨 大豆肉汤粉5g、氯化钠5g、牛肉浸膏5g、水解乳蛋白5g、7水硫酸镁0. 5g、琼脂粉12g、溶于 IOOOml无离子水中，加热溶化后调pH至7. 0 7. 2，121°C高压20min后，待冷却至55°C左 右，按无菌要求加入经抽滤无菌的维生素&lml。对发酵罐进行灭菌，待温度降至37 38°C时，将2 8°C保存的二级种子液分别按2% 2. 5%加入到发酵罐内。培养温度控制 在37 38°C，搅拌转速为100 200r/min，pH为7. 2，罐压为0. 03 0. 05Pa，容氧量为 40%，培养9 10小时收获，留样检验，置2 8°C保存，不超过5日。2.根据活菌计数结果，将灭活的鸭疫里默氏杆菌1、2型菌液均稀释成约 6X109CFU/ml后等量混合。3.按常规方法制备成油乳剂灭活疫苗。本发明的详细描述一、疫苗制备1.生产用种子制备(1) 一级种子繁殖与鉴定将YBYN株、YBSD株的冻干菌种分别接种于巧克力琼脂 平板上，置5 % 10 % CO2、37 °C培养20小时，选典型菌落接种于含3 %小牛血清的TSA琼脂 斜面，37°C培养M小时，然后接种于TSA肉汤，37°C振荡培养M小时，按15%加入灭菌甘油 混勻，定量分装，注明菌株名称、装量、分装日期，经纯粹检验合格后，作为一级种子，"200C 保存，保存期不超过3个月。(2) 二级种子繁殖将一级种子划线接种到3%小牛血清的TSA琼脂平板，37°C培养M小时，挑选典型菌落(或菌苔)接种于TSA肉汤，37°C振荡培养M小时，经纯粹检验 后，作为二级种子。在2 8°C保存，应不超过48小时。2.菌液培养采用发酵罐分别培养YBYN菌株JBSD菌株。先将半合成肉汤培养基 进行灭菌，待温度降至37 38°C时，将2 8°C保存的二级种子液分别按2% 2. 5%加入 到发酵罐内。培养温度控制在37 38°C，搅拌转速为100 200r/min，pH为7. 2，罐压为 0. 03 0. 05Pa,容氧量为40%，培养9 10小时收获，留样检验，置2 8°C保存，不超过5曰。3.活菌计数取培养9 IOh的菌液1ml，按(中国兽药典委员会.中华人民共和 国兽药典二〇〇五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)附录 方法进行活菌计数，各型活菌含量均应不低于6 X 109CFU/ml。4.灭活将检验合格的菌液导入灭活罐中，按菌液体积的0.3%加入甲醛溶液， 37°C搅拌灭活20小时，置2 8°C保存，不超过7日。5.疫苗制备(1)水相配制取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的菌液96份，导入配液罐中， 开启搅拌电机，勻速搅拌至吐温-80完全溶解。(2)油相制备取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1份加入油相制备罐 中，开启搅拌电机，勻速搅拌，同时开启导热油开关，125°C加热30min，冷却后，导入贮油罐 中备用。(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份， 再以4000r/min乳化30min。乳化后，取样IOml,以3000r/min离心15min，应不分层；若有 分层现象，应重新乳化1次。(4)分装定量分装，加盖密封。二、疫苗的安全试验1.鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗对靶动物的一次单剂量接种的安全性试验用本 发明人按本法试制的200801、200802、200803三批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗对3 7 日龄健康易感鸭(购自青岛平度)进行一次单剂量接种安全性试验，0. :3ml/只，观察14日， 记录疫苗接种对试验鸭的安全性。试验结果表明，本实验室试制的200801、200802、200803 批疫苗接种后，试验鸭的精神、饮食与对照鸭无明显差异，接种后14日疫苗吸收良好。说明 我们试制的疫苗一次单剂量接种3 7日龄健康易感鸭是安全的(详见表1)。表1试验鸭一次单剂量接种安全性试验结果
权利要求
1.一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗，其特征是该疫苗含有经甲醛溶液灭活的鸭疫里 默氏杆菌1型YBSD株菌、2型YBYN株菌及常规的矿物油佐剂，该两株已于2011年2月25日 送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏编号YBSD株为CGMCC No. 4614，TOYN株为CGMCCNo. 4615。
2.一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法，其特征在于(1)采用机械搅拌发酵罐分别培养1、2型鸭疫里默氏杆菌菌液采用发酵罐分别培养 YBYN菌株JBSD菌株。先将半合成肉汤培养基进行灭菌，待温度降至37 38°C时，将2 8°C保存的二级种子液分别按2% 2. 5%加入到发酵罐内。培养温度控制在37 38°C，搅 拌转速为100 200r/min，pH为7. 2，罐压为0. 03 0. 05Pa，溶氧量为40%，培养9 10 小时收获，留样检验，置2 8°C保存，不超过5日；(2)根据活菌计数结果，将灭活的1、2型鸭疫里默氏杆菌菌液均稀释成约6XIO9CFU/ ml后等量混合；(3)按常规方法制备成矿物油佐剂灭活疫苗。
3.按照权利要求2所述的一种鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗的生产方法，其特征在于 其中所使用半合成肉汤培养基是胰蛋白胨大豆肉汤粉5g、氯化钠5g、牛肉浸膏5g、水解乳 蛋白5g、七水硫酸镁0. 5g、溶于IOOOml无离子水中，加热溶化后调pH至7. 0 7. 2，121°C 高压20分钟后，待冷却至55°C左右，按无菌要求加入经抽滤无菌的维生素B1Iml1全文摘要
本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的生产方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌1型YBYN株、2型YBSD株分别接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防由1型和2型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。
文档编号A61K39/02GK102125687SQ20111005425
公开日2011年7月20日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者杜元钊, 申洪银, 程增青, 胡潇, 范根成, 郭玉广, 马爽 申请人:青岛易邦生物工程有限公司