专利名称：一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及融合蛋白表达载体，尤其涉及包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgGl的Fe段的融合蛋白。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackieenterovirus),属小 RNA 病毒科(Picornavirus),为正链RNA肠道病毒(Enterovirus)。常引起小儿腹泻，能导致无菌性脑膜炎、流行性胸痛、心肌炎、心包炎、手足口病等多种疾病,妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变,并致胎儿宫内感染和致畸。目前发现，柯萨奇B组病毒(Coxsackie B enterovirus, CVB)常引发小儿病毒性心肌炎(Viral Myocarditis, VMC)，是小儿及青少年VMC最常见的病原体，约占各种病毒所致心肌炎的50 %。腺病毒(adenovirus, Ad)是一类无包膜双链 DNA(double-stranded DNA, dsDNA)病毒,归属于哺乳动物腺病毒属。在自然界中分布较广，是引起上下呼吸道和眼部疾患的常见病原体；同时可引起人体扁桃体、腺样体和其它淋巴组织的隐性持续性感染；此外，腺病毒也是病毒性心肌炎的常见病原体。柯萨奇病、腺病毒的传染性强，尤其是在人口密集的地方，对免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通过飞沫和接触传染，在同一时期可造成区域性流行或暴发流行。柯萨奇病毒分为A和B两类，共30多个血清型；腺病毒可分为A F 6个亚属，共51个血清型，目前尚无柯萨奇病毒/腺病毒有效疫苗用于预防，针对其特异性药物还有待开发。因此，从新的角度研制安全、可靠的防治柯萨奇病毒/腺病毒的新型药物十分必要。近年来,一些学者提出了 “病毒受体陷讲疗法”(virus receptor trap therapy)这一概念，所谓“病毒受体陷阱疗法”是指利用外源性的可溶性病毒受体来结合病毒，从而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞。由于外源性受体分子与细胞膜上的受体分子有相同或非常相似的空间结构，因此，多次、大剂量使用将不存在机体的免疫反应等问题。病毒受体陷阱疗法拓展了病毒性疾病的治疗策略，可成为急性病毒血症期的一个新的有效治疗手段。研究表明，柯萨奇病毒和腺病毒通过与细胞表面的柯萨奇病毒/腺病毒受体(Coxsackie virus and adenovirus receptor,CAR)特异性地结合完成感染最初的吸附过程，随后通过五邻体蛋白上的精-甘-天门冬氨酸(RGD)序列与细胞表面的整合素α Y β3和α Υ β 5结合经过胞饮作用使病毒进入细胞从而完成内化过程。因此，CAR是绝大部分柯萨奇病毒和腺病毒进入宿主细胞的关键。目前，CAR的基础性研究已非常深入。研究表明，CAR是分子量为46KD的跨膜糖蛋白，编码人源CAR(hCAR)的基因已明确定位于染色体21q 11. 2上，包含7个外显子，365个氨基酸，分3个结构域。①胞外域含两个Ig结构域(I. 2)，Ad通过纤维顶球的三聚体结构与Igl结构域结合。②跨膜段含22个氨基酸，对细胞间相互作用起稳定调节作用。③胞内域含107个氨基酸，其中前两位Cys残基可能是翻译后脂化修饰位点，此外，胞内域可能还存在Tyr磷酸化位点。基于这些已有的基础性研究，如果通过基因工程方法，获得CAR的胞外区蛋白(extracellular region of CAR, exCAR),用于Ad的“受体陷讲疗法”,将能有效的阻止绝大部分型别的腺病毒对人体细胞的感染。目前，在“病毒性疾病的受体陷阱疗法”这一领域已有一些探索性研究，但仅停留在体外细胞实验和动物模型研究的初步阶段。究其原因，最主要的是活性蛋白的高效表达问题。目前的相关研究一是采用大肠杆菌原核表达系统，该系统能获得较高产量的表达蛋白，但其蛋白表达形式多为包涵体，难以获得大量可溶性活性蛋白；二是采用细胞真核表达系统，如CHO细胞和293T细胞等，此类表达系统能解决表达蛋白的正确折叠和糖基化问题，但其产量很低，成本极高，大量制备极为困难。所以，“病毒受体陷阱疗法”将来应用人体治疗，实现的关键是能生产制备大量可纯化的具有高生物活性的病毒受体或其亚单位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白及融合蛋白的表达载体。 本发明所述的融合蛋白，包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgGl的Fe段。所述人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区的基因序列其序列如SEQ IDNO 1所
/Jn ο所述人IgGl的Fe段的基因序列其序列如SEQ ID NO 2所示。所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO :4所
/Jn ο本发明所述的融合蛋白可用于制备治疗柯萨奇病毒和/或腺病毒的药物。本发明提供的融合蛋白表达载体，包含上述的融合蛋白基因序列和pPIC3. 5K质粒基因序列。其中所述融合蛋白基因序列如SEQ ID N0:2所不。本发明还提供一种宿主菌，其含有上述的融合蛋白表达载体。本发明将人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区(extracelIularCoxsackievirusand adenovirus receptor, exCAR)基因编码序列与人IgGl的Fe段基因编码序列根据毕赤酵母遗传密码偏嗜性进行了密码子优化，对框连接而成为融合蛋白eXCAR:Fc编码基因，该融合蛋白既具有与柯萨奇病毒/腺病毒的高结合力，又能利用抗体Fe端与吞噬细胞的Fe受体结合，加速对结合病毒的吞噬和清除效率。利用毕赤酵母pPIC3. 5K/GS115表达系统，完成融合蛋白eXCAR:Fc的高效可溶性表达，获得大量可纯化的且具有高生物活性的可溶性exCAR:Fe蛋白。毕赤酵母表达系统是一种成熟的真核表达系统，具有强启动子可严格调控目的蛋白的表达；并可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。此外，其营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产及高密度发酵培养。本发明选择了毕赤酵母PPIC3. 5K/GS115表达系统表达目的蛋白，以实现目的蛋白具有与天然蛋白相似生物学活性的可溶性、高效表达。所述融合蛋白能与柯萨奇病毒/腺病毒产生高亲和力的结合，阻止柯萨奇病毒/腺病毒对机体细胞特别是表达CAR的细胞如心肌细胞的感染，本融合蛋白可用于柯萨奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治疗。本发明将人源性柯萨奇病毒/腺病毒受体的胞外区与IgGl的Fe段构建为融合蛋白，使融合蛋白即具有与病毒的高结合力，又能有效地与吞噬细胞膜上的抗体Fe受体结合，介导吞噬细胞对病毒的吞噬杀伤，能加速病毒在体内的清除效率。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I是重组工程菌pPIC3. 5K-exCAR/DH5 α的PCR鉴定结果，其中Μ泳道DNAmarker ;1、2泳道exCAR PCR阴性对照;3、4、5泳道exCAR PCR鉴定结果； 图2 是重组质粒 pPIC3. 5K_exCAR:Fc PCR鉴定结果，其中M泳道DNAmarker ;1、3泳道exCAR PCR结果；2泳道exCAR PCR阴性对照；4泳道exCAR:Fe PCR阴性对照；5泳道exCAR:Fe PCR结果；6泳道Fc PCR结果；7泳道Fc PCR阴性对照；图3是重组质粒pPIC3. 5K-exCAR:Fc/SnaB I、Not I双酶切后电泳图；其中M泳道DNA marker ；1泳道阳性重组质粒pPIC3. 5K_exCAR:Fc/SnaB I、Not I双酶切，可见切出约 1350bp DNA 条带；2 泳道pPIC3. 5K/SnaB I、Not I 双酶切；图4是重组质粒pPIC3. 5K-exCAR:FC测序图谱(结果部分截图)，图中标注起始密码和SnaB I酶切位点；图5是阳性转化子pPIC3. 5K_exCAR:Fc/GS115PCR鉴定图，其中M泳道DNAmarker ；1泳道pPIC3. 5K/GS115基因组DNA采用酵母阳性转化子鉴定引物扩增结果；2泳道pPIC3. 5K-exCAR:FC/GS115基因组DNA采用酵母阳性转化子鉴定引物扩增结果；3，6泳道exCAR:Fc PCR阴性对照；4泳道pPIC3. 5K/GS115基因组DNA采用exCAR:Fe上下游引物扩增结果；5泳道pPIC3. 5K-exCAR:Fc/GS115基因组DNA采用exCAR:Fe上下游引物扩增结果；图6是exCAR:Fe蛋白的表达情况，其中M泳道蛋白Marker ；1, 2泳道PPIC3. 5K/GS115空载体菌经甲醇诱导96h后表达蛋白；3，4泳道pPIC3. 5K_exCAR:Fc/GSl 15经甲醇诱导96h后表达蛋白；图7是exCAR:Fe蛋白纯化情况,其中M泳道蛋白Marker ；1, 2泳道exCAR:Fc经ProteinA亲和层析及凝胶层析纯化后结果；3,4泳道exCAR:Fc经ProteinA亲和层析纯化后结果；图8 是 exCAR:Fc 蛋白 Western-blot 结果图，其中M泳道蛋白 Marker (170,130,95，72，55，43，34，26，17，IOKDa) ； I 泳道pPIC3. 5K/GS115 表达蛋白与一抗孵育结果；2 泳道pPIC3. 5K-exCAR:Fc/GS115表达蛋白与一抗孵育结果；图9A至图9C分别是是eXCAR:Fc蛋白阻断前、BSA对照组、阻断后的阻断腺病毒adEasy-Ι株感染Hela细胞结果图，其中图9A:100M0I adEasy-1株感染Hela细胞48h图；图9B :终浓度2ug/ml BSA对照阻断adEasy-Ι株感染Hela细胞48h ;图9C :终浓度2ug/mlexCAR:Fe蛋白阻断adEasy-Ι株感染Hela细胞48h图；图10是exCAR:Fe蛋白质N端测序结果；
图11是exCAR:Fc蛋白阻断CoxB3病毒感染Hela细胞MTT实验结果图。
具体实施例方式一、材料与方法(一 )菌株、质粒、病毒株和细胞株大肠杆菌DH5a由本实验室保存；毕赤酵母(Pichia pastoris)表达质粒pPIC3. 5K、菌株 GS115 及 pPIC3. 5K/GS115 购自美国 Invitrogen 公司；腺病毒 adEasy-Ι 株由重庆医科大学儿科医院分子诊断室黄轶博士惠赠；柯萨奇病毒(CoxB3病毒)m株购自中科院武汉病毒所；Hela细胞株由本实验室保存。
( 二)主要试剂
KOD plus Taq DNA聚合酶及PCR试剂日本TOYOBO公司 Ligation high日本 TOYOBO 公司
SnaB I日本Takara公司EcoR I日本Takara公司
Not I日本Takara公司
Sal IId 本 Takara 公司
DL2000 DNAMarker天根生物有限公司
质粒提取试剂盒北京博人泰克生物公司
凝胶回收试剂盒北京博大泰克生物公司
EB美国Amresco分装
琼脂糖美国BBI
酵母粉英国Oxoid
胰蛋白胨英国Oxoid
YNB北京鼎国
琼脂成都天泰牛物公司
SDS美国BBI
DTT上海生工
生物素上海生工
蜗牛酶北京鼎国
D-山梨醇北京鼎国
丙烯酰胺美国BBI
N,N'-亚甲双丙烯酰胺加拿大BBI
过硫酸铵加拿人BBI
TEMED上海生丄
Tris加拿大BBI
Sephadex G-250美国 Amersham Pharmacia
DMEM/F12(DF)培养基HighClone
胎牛血清四季青生物有限公司
蛋白质分子量标准天根生物有限公司
葡萄球菌A蛋白层析柱加拿大BBI公司
山羊抗人CAR抗体美国Santa公司
HRP-兔抗羊IgG中杉金桥公司(三)主要仪器设备
ISO 9001电子天平德国Sartorius公司
Milli-Q Elix纯水器美国Millipore公司
PB-20 pH计德国 Sartorius公司
TH2大振幅恒温摇床江苏太仓市实验设备厂
DU800分光光度计美国Beckman公司
ERC-4型净化工作台艺思特净化有限公司
PTC-100 PCR 仪美国MJ Research 公司
Gene Pulse 电转化仪美国Bio-Rad公司
湿转印仪美国Bio-Rad公司
DYY-II型电泳仪北京六一仪器厂
MDF-382E(N)超低温冰箱日本Sanyo公司
Mini PROTEAN 3 cell电泳装置美国Bio-Rad公司
Chemimager 5500凝胶成像仪美国Bio-Rad公司
PK-8B电热恒温水浴箱上海精宏实验设备公司
PYX-DHS-50x64S隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂
D-37520型低温高速离心机德国Hemeus公司
TGL-16G型台式离心机上海安享科学仪器厂
UltrasonicsVCX-750超声仪美国 SonicsC02培养箱德国Heraeus公司
突光显微镜德国Leica(四)主要溶液及试剂配制I. LB液体培养基称取胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加800ml ddH20溶解，用NaOH调pH值至7.4，补加(1(1!120至10001111，高压灭菌201^11，41保存备用。配制含AMP培养基则在使用前加入终浓度为100 μ g/ml的AMP。2. LB固体培养基在LB液体培养基的基础上，加入终浓度为15g/L的琼脂，高压灭菌20min，倾倒平 板，凝固后用塑料袋封装，4°C保存备用。配制含AMP培养基则需待温度降至65°C后，加入终浓度为100 μ g/ml的AMP，摇匀后倾倒平板。3. 100mmol/L CaCl2 溶液称取14. 7g CaCl2 · 2H20溶解于1000ml ddH20中，过滤除菌，4°C保存备用。 4. TAE电泳缓冲液(50 X贮存液，pH约8. 5)称取Tris 碱 242g, Na2EDTA · 2H20 37. 2g,加 Λ 57. Iml 冰乙酸，补加 ddH20 至1000ml，使用时稀释50倍。5.1%琼脂糖凝胶称取Ig琼脂糖，加入100ml I XTAE缓冲液中，用微波炉加热溶解，待温度降至65 C后，加入10mg/ml的ElB 10 μ 1，混勾后倾入|旲具中，插入梳子，凝固后使用。6. 10XD即20%葡萄糖(Dextrose)溶液。称取200g葡萄糖溶于IL ddH20中，滤过除菌，4°C保存。7. 10XM即5%甲醇(Methanol)溶液。取5ml甲醇加入95ml ddH20中，滤过除菌，4°C保存。8. 10XGY即10%甘油(Glycerol)溶液。取IOOml甘油加至900ml ddH20中，15磅高压灭菌 20min，4°C 保存。9. 10XYNB称取34g YNB, IOOg硫酸铵，加ddH20溶至1L，加热溶解，滤过除菌，4°C保存。10. 500X B即0. 02%的生物素(Biotin)溶液。称取20mg生物素，溶于100ml ddH20中，滤过除菌，4 °C保存。11. IM磷酸钾缓冲液(pH 6. 0)量取132ml IM K2HPO4,868ml IM KH2PO4, ρΗ6· O ±0. I (如 pH 需调，用磷酸或 KOH 调整)，高压灭菌后，置4 °C或室温保存。12. YPD液体培养基取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml双蒸水中，121°C，30min高压灭菌，冷却后加入20ml 10XD。
13. YPD固体培养基取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml双蒸水中，加入终浓度为20g/L的琼月旨，121°C，30min高压灭菌，冷却后加入20ml 10XD。 14. BMGY液体培养基取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去离子水700ml，121 °C，20min高压灭菌，而后加入无菌的10XGY，10XYNB，10X磷酸盐缓冲液各100ml，冷至室温后补加500XBiotin2ml即配成BMGY培养基。15. BMMY液体培养基取蛋白胨20g，酵母提取物10g，加入去离子水700ml，121 °C, 20min高压灭菌，而后加入无菌的10XM，10XYNB，10X磷酸盐缓冲液各100ml，冷至室温后补加500XBiotin2ml即配成BMGY培养基。 16. MD固体培养基在160ml水中加入3. Og琼脂，高压灭菌，冷却至60°C后，依次加入20mll0XYNB，20ml 10XD，0.4ml 500XBiotin，立即铺板。17. MM固体培养基在160ml水中加入3. Og琼脂，高压灭菌，冷却至60°C后，依次加入20mll0XYNB，20ml 10XM,O. 4ml 500XBiotin，立即铺板。18.酵母感受态处理液IOOmM LiAc, IOmM DTT, O. 6M 山梨醇，and IOmM Tris-HCl，ρΗ7· 519. G418-YPD 平板取2. Og酵母提取物，4. Og蛋白胨溶于180ml双蒸水中，加入终浓度为20g/L的琼脂，12rC，30min高压灭菌，冷却后加入20ml 10XD和不同浓度的G418(0、0. 25,0. 5、1· O、I. 5、2· 0,4. Omg/ml)，充分摇匀铺板，4°C备用。20.洗膜液(PBST)称取NaCl 8. 0g,KCl O. 2g,KH2PO4 O. 2g,Na2HPO4 · 12Η202· 9g 溶于 800ml ddH20 中，加入 500ul Tween-20 后 ddH20 定容至 1L。21.转膜缓冲液(ρΗ8· 3)称取Tris3. 0g、甘氨酸11. 3g,加入甲醇200ml后ddH20定容至1L。22. CAPS电转缓冲液称取CAP2. 2g溶于800ml ddH20中，加入IOOml甲醇，NaOH调PH至11并定容至IL023.丽春红S染色液称取I 春红S O. 5g,加入冰乙酸lml, ddH20定容至100ml。24.封闭液/ 一抗、二抗稀释液称取脱脂奶粉5g溶于100ml PBST中。25.柠檬酸三钠底物缓冲液称取柠檬酸O. 51g、Na2HPO4. 12H20 I. 84g 加入 ddH20 定容至 100ml。26.显色液称取DAB 15mg，加入甲醇5ml、30% H2O215uI和柠檬酸三钠底物缓冲液25ml。
27. O. Olmol/L PBS (pH 7. 4)溶液配置NaCl 8. OOg, KCl 0. 20g, KH2PO4 0. 20g, NaH2PO4 · H2O I. 56g, 1000ml ddH20 溶解，高温高压灭菌，4°C保存。实施例I :基因及引物的合成I. IexCAR 和 IgGl Fe 基因的合成根据GenBank中人源性CAR胞外区基因编码序列(exCAR)(AccessionNumber:NM_001338)和 IgGlFc 段基因编码序列(Accession Number AF237583)，同时依据毕赤酵母遗传密码偏嗜性将exCAR和IgGl Fe段基因序列进行了密码子优化，由上海生工分别合成exCAR和IgGl Fe基因并构建工程菌PUC_exCAR/DH5a、PUC-Fc/DH5a，密码子优化后的核酸序列如下exCAR (65 lbp) SEQ ID NO :1 ttgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgagtactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggctIgGlFc (696bp) SEQ ID NO :2gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaag毕赤酵母表达的融合蛋白exCAR-Fc核酸序列(框内为加入的EcoR I酶切位点，atg为起始密码子，tga为终止密码)SEQ ID NO 3
atggtgtccatcactactccagaagagatgattgagaaggctaagggtgagactgcctacttgccatgtaagttcactttgtctccagaagaccaaggtccattggacatcgagtggttgatttccccagctgacaatcagaaggttgatcaagtcattattttgtactctggtgacaagatttacgacgactactacccagacttgaagggtagagttcacttcacctccaatgacttgaagtctggtgatgcttctatcaatgtcaccaatttgcaattgtctgacattggtacttaccagtgtaaggtcaagaaggctccaggtgttgctaataagaagattcacttggtcgttttggttaagccatccggtgctagatgttacgttgacggttctgaggaaattggttccgacttcaagatcaagtgtgagccaaaggaaggttccttgccattgcagtacgagtggcaaaagttgtctgactcccagaagatgccaacttcttggttggctgagatgacttcctctgttatttctgtcaagaatgcttcttctgag
tactctggtacttactcctgtaccgtcagaaacagagtcggttctgaccagtgtttgttgagattgaacgttgtcccaccatccaataaggct gaallq gagccaaagtcttgtgacaagactcacacctgtccaccatgtccagctccagagttgttgggtggtccatccgtcttcttgttcccaccaaagccaaaggacaccttgatgatctccagaaccccagaggtcacctgcgtcgttgtcgacgtctcccacgaggacccagaggtcaagttcaactggtacgtcgacggtgttgaggtccacaatgctaagaccaagccaagagaggagcagtacaactccacctacagagtcgtctctgtcttgaccgtcttgcaccaggactggttgaatggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaggctttgccagctccaatcgagaagaccatctccaaggctaagggtcagccaagagagccacaggtctacaccttgccaccatccagagaggagatgaccaagaaccaggtctccttgacctgcttggtcaagggtttctacccatccgacatcgctgtcgagtgggagtctaatggtcagccagagaacaactacaagaccaccccaccagtcttggactccgacggttccttcttcttgtactccaagttgaccgttgacaagtctagatggcagcagggtaacgtcttctcctgctccgtcatgcacgaggctttgcacaaccactacactcagaagtccttgtccttgtccccaggtaagtga毕赤酵母表达的融合蛋白exCAR-Fc氨基酸序列(45IAA, M. W 50. 3kD，ρΙ6· 43)SEQ ID NO 4VSITTPEEMIEKAKGETAYLPCKFTLSPEDQGPLDIEWLISPADNQKVDQVIILYSGDKIYDDYYPDLKGRVHFTSNDLKSGDASINVTNLQLSDIGTYQCKVKKAPGVANKKIffl,WLVKPSGARCYVDGSEEIGSDFKIKCEPKEGSLPLQYEWQKLSDSQKMPTSWLAEMTSSVISVKNASSEYSGTYSCTVRNRVGSDQCLLRLNWPPSNKA @ EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK1. 2引物合成及PCR反应体系exCAR 的扩增引物上游引物 5’ -tatatacgta Jaccatg)gtgtccatcactactccag-3’ -SEQID NO :5 (下划线部分为 SnaB I 位点，框内为 Kozak 序列)；下游引物 5’ -tatagaattcagccttattggatggtg-3J -SEQ ID NO :6(下划线部分为 EcoR I 位点)。IgGlFc 的扩增引物上游引物 5’ -tatagaattcgagccaaagtcttgtgac-3’ -SEQ ID NO :7 (下划线部分为 EcoRI 位点)；下游引物5’ -atttattgcggccgctcacttacctggggacaagg-3’ -SEQ ID NO :8 (下划线部分为Not I位点)。酵母阳性转化子鉴定引物上游引物5’ -gactggttccaattgacaagc-3’ -SEQ ID NO :9 ;下游引物5，-gcaaatggcattctgacatcc-3’ -SEQ ID NO :10。引物由上海生工合成。①exCAR或Fe基因PCR反应体系如下
exCAR或F c基因模板1.0 μ I
10X缓冲液5.0 μ I
MgCl22.0 μ I
dNTPs4.0 μ I
KOD-plusTaq 酶1.0 μ I
上游引物(10 μ Μ)2.0 μ I下游引物(10 μ Μ)2.0 μ I ddH2033.0 μ I 总体系50.0 μ I热循环参数94°C3 分钟；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C60 秒)X 32 循环；72°C5分钟。②exCAR-Fc基因或酵母阳性转化子鉴定的PCR反应体系如下
exCAR-Fc基因模板或酵母基因组DNA1.0 μ I
10X缓冲液5.0 μ I
MgCl22.0 μ I
dNTPs4.0 μ IKOD-plus Taq 酶1.0 μ I上游引物(10 μ Μ)2.0 μ I下游引物(ΙΟμΜ)2.0 μ IddH2033.0 μ I总体系50.0 μ I热循环参数94°C3 分钟；(94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 90 秒)X 32 循环；72°C5分钟。实施例2 :重组工程菌pPIC3. 5K-exCAR/DH5a的构建及鉴定2. IexCAR 基因 EcoR I/SnaB I 酶切将实施例I. 2中构建的PUC-exCAR/DH5a菌液接种于LB (AMPlr)培养基中，37°C、180rpm过夜培养，质粒提取试剂盒提取TOC-exCAR质粒，并作EcoR I、SnaB I分步酶切。①EcoR I酶切反应体系如下
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgGl的Fe段。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区的基因序列，其序列如SEQ ID N0:1所不。
3.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgGl的Fe段基因序列如SEQID NO 2 所示。
4.根据权利要求I至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的基因序列如 SEQ ID NO 3 所示。
5.根据权利要求I至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
6.权利要求I所述的融合蛋白在制备治疗柯萨奇病毒和/或腺病毒的药物中的应用。
7.一种融合蛋白表达载体，其特征在于，包含权利要求I所述的融合蛋白基因序列和pPIC3. 5K质粒基因序列。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白表达载体，其特征在于，所述融合蛋白基因序列如SEQ ID NO 2 所示。
9.一种宿主菌,其特征在于,含有权利要求7所述的融合蛋白表达载体。
全文摘要
本发明提供一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体。该融合蛋白包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段。该融合蛋白基因序列经密码子优化。该融合蛋白表达载体包含上述的融合蛋白优化后的基因序列和pPIC3.5K质粒基因序列。该融合蛋白能与柯萨奇病毒/腺病毒产生高亲和力的结合，阻止柯萨奇病毒/腺病毒对机体细胞特别是表达CAR的细胞如心肌细胞的感染，本融合蛋白可用于柯萨奇病毒和/或腺病毒感染性疾病的治疗。
文档编号A61P31/14GK102816240SQ20111005491
公开日2012年12月12日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者张克斌, 钱桂生, 周世文, 黄春基, 余华, 吕胜青, 盛哈蕾, 何晓梅, 熊竣智 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院