专利名称：莲子心或其提取物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及莲子心在制备预防或/和治疗糖尿病肾病药物或保健食品中的用途，属于医药食品领域。
背景技术：
糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一，又是终末期肾病主要原因。随着经济 的发展和生活方式的改变，糖尿病的发病率逐渐升高，目前尚无较好的治疗方法。糖尿病性 肾病其他病理改变特点包括肾小球基膜增厚，肾小球上皮细胞足突融合以及由于细胞外系 膜基质增多所致肾小球增大。疾病晚期可出现肾小管萎缩肾内纤维化。糖尿病病程10年 以上者约50%并发糖尿病肾病。目前，糖尿病的治疗主要在两方面诱发因素的控制和DN 发展中关键环节的阻断。目前，糖尿病肾病的发病机理虽尚未完全清楚，但肾小球基膜增厚，肾小球上皮细 胞足突融合及肾小球机械屏障和电荷屏障受损，导致尿蛋白的漏出是其主要原因。肾小球 滤过屏障是肾小球的重要结构，从内向外依次为内皮窗孔层，肾小球基底膜(GBM)、足细胞 及其裂孔隔膜(GPSD)，其中GBM和GPSD是阻止蛋白漏出最主要的两层。GBM主要起电荷屏 障作用，GPSD主要发挥机械屏障作用，它们的结构和功能的任何改变均可破坏肾小球滤过 屏障的完整性，导致蛋白漏出。肾组织足细胞相关分子nephrin、podocin和GBM上相关分 子乙酰肝素酶(heparanase，HPA)的变化可以反映机械屏障和电荷屏障的变化。因此，如能 减轻肾小球基膜增厚，减少肾小球上皮细胞足突融合，恢复肾小球机械屏障和电荷屏障是 最终减少尿蛋白漏出的关键，也是治疗糖尿病肾病的重要靶点。莲子心(PLUMULANELUMBINIS)，又名莲心，为睡莲科Nelumbo nuciferaGaertn.多 年生水生草本植物莲的成熟种子中的青嫩胚芽。《中国药典》2005版一部收载，具有清心安 神，交通心肾，涩精止血。据报道，莲子心中主要含有莲子心碱(liensinine)、甲基莲子心 碱(neferine)、异莲子心碱(isoliensinine)等生物碱及木犀草素、芦丁等黄酮类化合物。 莲子心的药效主要为降压和抗心律失常等作用。文献潘扬，等，莲子心及Nef对实验性糖 尿病及肥胖大鼠模型的影响，《南京中医药大学学报》，2003年19卷4期，公开了莲子心及甲 基莲心碱(neferine，Nef)对链脲佐菌素(str印tozotocin，SIZ)和高糖高脂制作的大鼠糖 尿病及肥胖模型的影响，并与二甲双胍(metformin，Met)作对照。结果表明，莲子心及Nef 对实验性糖尿病及肥胖大鼠有一定的降低血糖及调节血脂作用。目前尚有关于莲子心及提 取物用于预防或/和治疗糖尿病肾病的相关报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了莲子心或其提取物的新用途。本发明提供了莲子心或其提取物在制备预防或/和治疗糖尿病肾病的药物或保 健食品中的用途。其中，所述的莲子心提取物为莲子心的水或有机溶液提取物或酸碱提取物。其中，所述的莲子心提取物是莲子心水或有机溶剂提取物。所述的莲子心提取物，可以是用莲子 心的水提物，如水煎，水煎液的浓缩液，或莲子心水提醇沉后经喷雾干燥得到的粉剂；可以 是以乙醇或其他有机溶剂对莲子心进行提取；可以是以酸液渗漉对莲子心进行提取；可以 是以离子交换树脂对莲子心进行提取；可以是以膜分离技术对莲子心进行提取等。其中，所述的莲子心提取物为莲子心总生物碱。其中，所述的药物是减轻肾小球基膜增厚，减少肾小球上皮细胞足突融合，恢复肾 小球机械屏障和电荷屏障的药物。其中，所述的莲子心总生物碱中总生物碱的百分含量为5% 95%，含有莲子心 碱的重量百分含量为 80%。进一步优选地，所述的莲子心总生物碱提取物中总生物 碱的重量百分含量为30% 70%，含有莲子心碱的重量百分含量为10% 30%。本发明的活性成分莲子心总生物碱的含量以莲子心碱为标准计算。含量测定采 用紫外分光光度法测定莲子心碱含量，莲子心碱在处有最大吸收，根据莲子心碱的 含量计算总生物碱的含量，也可采用HPLC法测定。(参考文献郭毛娣，李兰贵.中国大 陆产莲子心中生物碱成分的研究[J].中草药，1984，15 (7) 3.袁小红.莲子心微囊中总 生物碱的含量测定[J].时珍国医国药，2006，17(7) :1141-1142 ；柳伟，王宏洁，司南等.莲 子心总生物碱滴丸的制备工艺及含量测定[J].中国中药杂志，2007,32(7) :581-584;陈锦 容.HPLC法测定不同炮制工艺莲子心中生物碱的含量[J].海峡药学，2009，21 (9) :33-36)本发明还提供了一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，它是由有效量的莲子心或其 提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。其中，所述的制剂是口服制剂、注射制剂。本发明莲子心及其活性成分制成的药剂、保健食品和食品添加剂中，可以是临床 上能够使用的各种不同剂型。如片剂、口服液、丸剂、胶囊剂、注射剂(包括静脉输液剂)、膏 剂、酊剂、散剂、冲剂、栓剂、霜剂、透皮制剂等。也可添加到食品、饮料等保健食品中。当然 也可以将莲子心原药直接制备成单方或复方的制剂、保健食品和食品添加剂。本发明莲子心用于预防或/和治疗糖尿病肾病，药效明确，且用药安全，为临床提 供了一种新的用药选择。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式实施例1本发明莲子心总碱的制备取莲子心，粉碎，加水2 6倍，煎煮3次，每次0. 5 池，合并滤液，回流浓缩，过 滤，加入2 8倍乙醇，使水提溶液中乙醇浓度达50 60%。静置12 Mh，过滤，滤液减 压回收乙醇至尽，并浓缩之相对密度为1. 20 1. 40，减压干燥，得莲子心提取物，即得莲子 心总碱。含量测定采用紫外分光光度法，结果总生物碱的重量百分含量为70%，以莲子心 碱计，重量百分含量为30%。
实施例2本发明莲子心总碱的制备取莲子心，粉碎，用2 5倍量70 85 %乙醇回流提取2 4次，每次回流提取 0. 5 1. 5h，滤过合并滤液，减压回收乙醇，浓缩之相对密度为1. 01 1. 10的浓缩液。浓 缩液用硫酸调pH至2. 0 4. 0，静置，离心，离心液用10 20%氨碱化调pH至8 10，静 置，过滤取沉淀，加乙醇加热溶解，静置，过滤，滤液减压回收乙醇至尽，并浓缩之相对密度 为1. 20 1. 40，减压干燥，得莲子心提取物，即得莲子心总碱。总生物碱含量50%，以莲子 心碱计占10%。含量测定采用紫外分光光度法。实施例3本发明莲子心总碱的制备取莲子心，粉碎，放入渗漉器中，加入2 6%。HCl浸渍膨胀M 48h，然后不断添 加新的2 6%。HC1，自上而下使其渗透过药材，从渗漉器下部流出并收集浸出液，合并所有 滤液，用10 20%氨碱化至pH值为8 10，过滤得到沉淀，减压干燥，即得莲子心总碱，总 生物碱含量30%，以莲子心碱计占15%。含量测定采用紫外分光光度法。实施例4莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子心碱可从莲子心总碱通过如下方式提取路线制备。莲子心总碱一用制备高效液相分离莲子心总碱一胶束电动色谱分离其中，莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子心碱三个化合物分离纯化方法可参考如下 文献朱金花，李德亮.胶束电动色谱中大体积进样法分离测定莲子心中的莲子心碱、异 莲子心碱和甲基莲子心碱.分析化学，2009，37 (10) :126;陈昌国.大孔吸附树脂分离纯 化莲子心中莲子心总碱的研究.时珍国医国药2009,20(4) :981-983 ；张先洲，胡学民，罗 顺德等.高效液相色谱法测定莲子心中3种生物碱的含量.药物分折杂志，1997，17 O) 110-112，或直接通过市售购买化合物标准品。这里所说的活性成分主要为双苄基异喹 啉-(7-0-1Γ )-单醚键生物碱衍生物及类似物，主要为莲子心碱、异莲子心碱、甲基莲子 心碱，可从睡莲科植物的不同部位，如莲子心、莲须、荷叶等或通过全合成或半合成方法制 备。以下通过具体药效学试验或临床试验进一步证明本发明的有益效果。试验例1本发明提取物的药效学实验1材料与方法1. 1实验材料1. 1. 1动物清洁级健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠100只，体重180 200g，购 自四川大学华西实验动物中心。在室温(22士 1)°C、相对湿度(55士5)%、光照周期12h 12h环境中适应饲养Iwk后试验。1. 1. 2药物莲子心提取物，由实施例1方法制备，使用时用生理盐水配制灌胃；开 博通(卡托普利)片，上海中美施贵宝药业有限公司生产，批号1003052。1. 1. 3主要试剂链脲佐菌素(Str印tozotocin，STZ)，Sigma公司，临用前溶解在 0. 01mol/L枸橼酸缓冲液中，pH 4. 5 ；兔抗大鼠η印hrin、podocin与HPA多克隆抗体，武汉 博士德；生物素标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及山羊血清封闭 液，北京博奥森生物科技有限公司；动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)及RT-PCR试剂盒，天根生化科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程技服务有限公司。1. 2 方法1. 2. 1动物模型的建立及分组大鼠单次腹腔注射1 % STZ 65mg/kg, 72h后尾静 脉采血，血糖仪测定全血血糖，以空腹1 后血糖> 11. lmmol/L者入选糖尿病大鼠模型。正 常对照组(n = 10，)单次腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。选取造模成功后的大鼠随机分为莲 子心提取物高剂量组(n = 10)，含莲子心提取物^ig .kg—1，莲子心提取物中剂量(n = 10)， 含莲子心提取物2mg · kg、莲子心提取物低剂量(n = 10)，含莲子心提取物Img · kg—1，开 博通组(n = 10)，含开博通3. 6mg/kg(按照人与鼠体表面积换算，相当于成人37. 5mg/d)灌 胃，糖尿病肾病模型组(n = 10)，正常对照组(n = 10)，正常对照组和模型组口服等量生理 盐水。每天给药一次，持续8wk。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食，自由饮水，不应用 胰岛素，保持垫料干燥，定期断尾取血监测血糖，观察8wk。1. 2. 2标本收集处死前准确收集24h尿液，离心分装后保存于_20°C冰箱中待测尿 蛋白和尿白蛋白含量。尾静脉采血，血糖仪测定空腹1 后的全血血糖水平。称量体重。末 次给药μ小时后颈椎脱白处死大鼠，迅速取出双侧肾脏，用4°c预冷的生理盐水反复清洗， 去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重(KW)和体质量的比值作为肾脏指数(KI)的指标。 右肾纵剖为二，一半用10%中性福尔马林固定，留做病理学，免疫组织化学研究。另一半用 2. 5%戊二醛固定，留做透射电镜研究。左肾置于DEPC水处理过的冻存管中，液氮冻透后转 入-70°C冰箱待测RT-PCR。1. 2. 3测定方法M小时尿蛋白定量(Upro)，采用考马斯亮兰法；尿白蛋白测定，采用放射免疫法， 由北京北方生物技术研究所提供大鼠专用尿蛋白试剂盒，用SN-682型自动γ免疫计数器 检测。1.2. 4病理学检查光镜标本制作肾组织经常规脱水、包埋、切片厚4 μ m，进行HE染色。电镜标本制作样品经3%戊二醛预固定，四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水， Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，日立H-600IV型 透射电镜观察。1.2.5免疫组化研究采用SP法，石蜡切片厚4 μ m，常规脱蜡至水，3% H2O2阻断内 源性过氧化物酶后，在柠檬酸钠溶液中微波抗原修复，10%正常山羊血清封闭。滴加一抗 nephrin(l 100)、podocin(1 120)和 HPA(1 100)，4°C冰箱过夜。PBS 洗片后滴加山 羊抗兔IgG工作液，37 °C孵育20min ；辣根酶标记链霉卵白素工作液37°C孵育20min ；DAB 显色，复染、脱水、透明、封片。每例切片随机选取10个不重复的肾小球视野(X400)，应用 Image Proplus 6. 0软件，检测肾小球内阳性信号的平均光密度和面积，用阳性指数(PI) 表示阳性物质的相对含量，计算公式为PI =阳性信号平均光密度X阳性信号面积/肾小 球面积。1. 2. 6RT-PCR研究由基因库分别查得大鼠η印hrin、podocin、HPA及β -actin的 mRNA核苷酸序列，PCR引物用ft~imer引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成，见表1。表 1 大鼠 η印hrin、podocin、HPA 及 β—actin 引物序列
权利要求
1.莲子心或其提取物在制备预防或/和治疗糖尿病肾病的药物或保健食品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物是减轻肾小球基膜增厚，减少 肾小球上皮细胞足突融合，恢复肾小球机械屏障和电荷屏障的药物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的莲子心提取物为莲子心的水、 有机溶液提取物或酸碱提取物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的莲子心有机溶液提取物为乙醇提 取物。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的莲子心提取物为莲子心总生 物碱提取物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的莲子心总生物碱提取物中总生物 碱的重量百分含量为5% 95%，含有莲子心碱的重量百分含量为 80%。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的莲子心总生物碱提取物中总生物 碱的重量百分含量为30% 70%，含有莲子心碱的重量百分含量为10% 30%。
8.一种治疗糖尿病肾病的药物组合物，它是由有效量的莲子心或其提取物为活性成 分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂是口报制剂、注射制剂。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂为片剂、口服液、丸 剂、胶囊剂、注射剂、膏剂、酊剂、散剂、冲剂、栓剂、霜剂、透皮制剂。
全文摘要
本发明提供了莲子心或其提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的用途。莲子心及提取物用于防治糖尿病肾病主要通过减轻肾小球基膜增厚，减少肾小球上皮细胞足突融合，恢复肾小球机械屏障和电荷屏障，从而减少蛋白的漏出。剂型可以是口服、舌下、鼻粘膜、经皮、直肠等不同给药的固体制剂和液体制剂等。
文档编号A61P3/10GK102091131SQ201110056788
公开日2011年6月15日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者刘冬恋, 尤思路, 李宏, 邓晶晶, 马松涛 申请人:成都医学院