专利名称：快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及人胰岛素类似物，具体地讲，涉及一种能快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物，以及包含该胰岛素类似物的药物组合物和药物制剂。
背景技术：
糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。而在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趋势，在2010年中国糖尿病患者总数已突破9000万人，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。正常人体的生理胰岛素分泌由餐时刺激相和基础平稳相组成，即人们进餐后外周血糖增高，刺激胰脏中贮存和新生的胰岛素释放，而平时为了维持机体的正常血糖水平，胰腺分泌少量基础胰岛素。因此，为了使糖尿病患者的餐时和基础血糖都得到良好控制，患者需要在每日餐前注射速效胰岛素(每日三次)，并在每日早晨和睡前各注射一次中或长效胰岛素。这样， 糖尿病患者必须承受每天4-5次的注射次数。为此，人们开发了在同一制剂中即有起速效作用的可溶胰岛素又有起延缓作用的结晶胰岛素(胰岛素-鱼精蛋白结晶)的预混胰岛素制剂(参见《百明顿制药科学》(Remington，s Pharmaceutical Sciences)，第17版，第 973-977页，1985年)。但是，这些预混胰岛素制剂仍然存在以下问题1.制剂中含有外源蛋白一鱼精蛋白，易产生免疫反应；2.药效在注射后持续时间不足M小时，患者仍需每日注射两次；3.药效仍存在峰值，每天两次药效峰叠加，易造成午餐前和睡前低血糖；4.现有预混胰岛素制剂均为混悬液，如果患者注射前混合不均勻，易造成药液中可溶相和结晶相比例的持续差异，影响血糖控制。目前，市场上还有一种长效胰岛素类似物一甘精胰岛素，其由于能够模拟生理基础胰岛素分泌，平稳无峰，在血糖轻易控制达标的同时，几乎没有低血糖风险，且持续时间为M小时左右，符合人类生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和医生所青睐。但是，甘精胰岛素在临床应用时也存在一些问题1.起效慢(起效时间约为1.5小时)，对餐时血糖过高的患者，或偶尔进餐较多的患者无法有效降低其餐后血糖；2.不能与其他胰岛素混合使用，这是由于各种胰岛素的等电点不同，甘精胰岛素在酸性条件下稳定，而天然胰岛素及现有速效胰岛素类似物在中性条件下稳定，如果将甘精胰岛素与其他胰岛素直接混合，会导致甘精胰岛素在注射前发生沉淀而不能施用，而其他胰岛素在混合后也由于受混合物酸碱度变化的影响，稳定性降低，安全性也随即降低。因此，在甘精胰岛素的包装说明书上，生产商特别注明不要将甘精胰岛素与其他任何类型的胰岛素混合。在中国专利申请200780019450. 3中，提出通过添加特定的酸性稳定剂和螯合剂， 将常规人胰岛素制剂VIAjectTM在低pH的条件下与甘精胰岛素混合，以实现共同使用人胰岛素与甘精胰岛素。但是，该方法一方面需要在制剂中额外添加有机酸、螯合剂等辅料；另一方面，在低PH的条件下，胰岛素A链21位的Asn非常容易脱氨降解(参见《胰岛素的稳定性》(Stability of insulin), Jens Brange，1994年)，使得产品极不稳定，而该专利申请并未对低PH条件下人胰岛素的稳定性、以及联合制剂的稳定性进行系统研究，产品的安全性数据不全。此外，该专利申请也没有从胰岛素的分子结构方面解决产品稳定性和保持产品临床特性的问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有上述胰岛素预混制剂所存在的问题，提供一种在酸性条件下稳定且快速起效的胰岛素类似物或其可药用盐，使其能够与甘精胰岛素等长效胰岛素类似物混合，制成澄清制剂，该制剂在使用前无需混勻即可注射使用，同时具有速效降糖和平稳长效降糖两种功能，每天只需注射一次，即可模拟生理胰岛素的分泌模式，在血糖安全达标的同时可更大程度减少低血糖风险，并且不含外源蛋白和额外的辅料，安全性更高。在低pH的条件下，胰岛素A链A21位的Asn (天冬酰胺)非常容易发生脱氨降解反应，使得胰岛素分子在酸性条件下极不稳定。本发明人通过大量研究发现，将胰岛素A链 A21位的Asn替换为Gly (甘氨酸)，所得到的全新序列的胰岛素类似物在酸性pH值时具有出人意料的稳定性，并且在酸性和中性PH值时都具有较高的溶解度，从而解决了上述问题。因此，为了实现本发明的目的，本发明提供一种胰岛素类似物或其可药用盐，其在酸性条件下稳定且能快速起效，所述胰岛素类似物为至少将其A链A21位的天冬酰胺(Asn) 突变为甘氨酸(Gly)的人胰岛素，其中人胰岛素的结构如图1所示，人胰岛素A链序列为 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，人胰岛素B链序列为SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。优选地，所述胰岛素类似物为仅在A21位上的Asn被Gly取代的人胰岛素，即 GlyA21人胰岛素，其A链序列为SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，B链序列为SEQ ID NO 4 所示的氨基酸序列。优选地，所述胰岛素类似物为A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Lys 取代，并且B^位上的Lys被Pro取代的人胰岛素，即GlyA21-LySB28-Pr0B29人胰岛素，其A链序列为SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，B链序列为SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。优选地，所述胰岛素类似物为A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Asp 取代的人胰岛素，即GlyA21-AspM人胰岛素，其A链序列为SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列， B链序列为SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。本发明还包括上述胰岛素类似物的可药用盐，所述可药用盐包括但不限定于锌盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐。本发明胰岛素类似物或其可药用盐可以采用任何一种公认的肽合成技术制备，例如溶液法、固相合成法(J. Mewart等，《固相肽合成》，Freeman and Co.，San Francisco, 1969)、半合成法、基因工程法、DNA重组法等。上述结构优化过的胰岛素类似物或其可药用盐从分子结构上消除了胰岛素在酸性条件下不稳定的因素，使得本发明胰岛素分子在酸性条件下不易发生脱氨基反应，具有非常高的稳定性。因此该胰岛素类似物或其可药用盐可以与长效胰岛素类似物例如甘精胰岛素一起组成药物组合物，或制成澄清的酸性预混胰岛素制剂。因此，本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明胰岛素类似物或其可药用盐，以及长效胰岛素类似物或其可药用盐，其中所述本发明胰岛素类似物为至少在其A 链A21位突变为甘氨酸(Gly)的人胰岛素。优选地，所述本发明胰岛素类似物选自GlyA21人胰岛素、GlyA21-LysB28-proB29人胰岛素或GlyA21-AspB28人胰岛素，所述长效胰岛素类似物选自甘精胰岛素。优选地，在上述药物组合物中，本发明胰岛素类似物和长效胰岛素类似物的含量百分比为30 70-70 30，更优选为50 50。本发明另一方面提供一种包含上述药物组合物的胰岛素药物制剂，优选地，该药物制剂的PH为3. 5-4. 5，更优选为3. 8-4. 2。上述药物制剂还可进一步包含一种或多种可药用辅料，例如等渗剂、缓冲剂、增溶剂、防腐剂等。其中等渗剂包括但不限于甘油、氯化钠等；缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等；增溶剂包括但不限于生理可接受酸如盐酸、乙酸、柠檬酸等；防腐剂包括但不限于苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯等。上述药物制剂为澄清液体制剂，其可通过注射、口服、口腔、舌下、阴道、直肠或鼻腔施用的方式来施用。优选的，该药物制剂是通过注射来施用的。在施用时，患者可以根据自身生活习惯选择在每日主餐前或主餐后注射一次。在本发明酸性预混胰岛素制剂中，两种胰岛素类似物都有很好的溶解度，并且物理化学稳定性不变、临床作用特点也不变。在皮下注射后，长效胰岛素可在皮下注射后形成微小沉淀起长效作用，而本发明速效胰岛素类似物在体内中性PH下仍可保持较高的溶解度而发挥速效作用。本发明预混胰岛素制剂具有以下优点1.制剂澄清，因而在使用前无需混勻即可抽取准确剂量注射；2.临床作用时间上兼有现有速效胰岛素起效快、长效胰岛素平稳降糖的优点；3.患者可以根据自身生活习惯选择在每日主餐前或主餐后注射一次，即可模拟生理胰岛素的分泌模式；4.既能解决每日主餐后高血糖，又不易在其他时间特别是夜间出现低血糖，使血糖维持在一个相对平稳的状态，在使血糖安全达标的同时最大程度减少低血糖风险，保护糖尿病患者的微血管，防止或延缓糖尿病并发症的发生，进一步提高糖尿病患者的生活质量。本发明胰岛素类似物在动物体内未见明显毒性反应。药效学评价结果显示，本发明预混胰岛素制剂在注射后10分钟开始起效，1-8小时内一直有平稳的降糖作用，12小时时作用仍明显，能满足临床糖尿病患者要求注射次数少、起效快、持续时间长、降糖平稳、低血糖发生率低的需求。
图1 人胰岛素的结构。图2 重组甘赖脯胰岛素各时点电泳表达检测图谱。图3 重组甘赖脯胰岛素RP-HPLC检测图谱。图4:重组甘赖脯胰岛素与甘精胰岛素以50 50的百分比预混后的高效液相色谱的保留时间测定图谱。
图5 不同胰岛素对四氧嘧啶高血糖大鼠作用的降糖百分率(％ )。
具体实施例方式实施例1本发明胰岛素类似物的制备和确认材料菌株克隆菌coli (DH5a)是基因工程常用工具菌种，表达菌种hcherichia coli (3110)购于美国模式培养物集存库(ATCC)。酶和试剂分子克隆工具酶和试剂购于北京经科宏达公司。质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购于北京天根公司(TianGen)。定点突变试剂盒(Fast Mutagenesis System)购于全式金公司CTransGene)。培养基LB培养基、氨苄抗性LB培养基、M9培养基和富集培养基为基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆第三版下册附录2。方法质粒提取扩增、聚合酶链反应、PCR产物纯化、质粒回收、连接和转化大肠杆菌， 这些在基因工程研究领域都是常规操作方法，可参见Sambrook J，Fristsh EF, Maniatis T. MolecularCloning ；A Laboiatory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Piess,1989，pp.16—340。1. GlyA21-LysB28-ProB29人胰岛素(甘赖脯胰岛素)的制备(1)重组甘赖脯胰岛素质粒的构建赖脯胰岛素质粒的扩增将根据现有LysB28-Pr0B29人胰岛素(赖脯胰岛素)序列制得的赖脯胰岛素质粒转入到hcherichia coli (DH5a)中，然后加入到氨苄抗性LB培养基中，在摇床中225rpm，37°C培养16小时，对赖脯胰岛素质粒进行扩增，然后用质粒抽提试剂盒提取质粒。PCR定点突变使用定点突变试剂盒(Fast Mutagenesis System)，将扩增的赖脯胰岛素质粒稀释60倍作为定点突变的模板，以设计的两条引物为上下游引物，进行PCR扩
+曰O其中引物序列如下N-Gf :CTCGAGAACTACTGCGGCTAATGAAGCTTGATCN-Gr CCGCAGTAGTTCTCGAGCTGGTACAGGCTGPCR 体系为质粒模板(5ng)lul，上游引物N-Gf(IOuM)O. 5uL,下游引物N-Gr(IOuM)O. 5uL,5 倍 Trans Start 快速 Pfu 缓冲液 5uL，dNTPs (IOmM) IuL,TransStart 快速 Pfu DNA 聚合酶 0. 7uL,
无菌水 16. 3uL,总体积25uL。扩增条件为94°C4min ；94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 2. 5min 25 个循环；72°C IOmin。PCR产物的纯化和消化将上述PCR产物用TianGen公司的PCR纯化试剂盒进行纯化，然后将Iul DMT酶加于40ul PCR纯化产物中，混勻，37°C孵育1小时进行消化。甘赖脯胰岛素质粒的构建和确认将2ul的DMT酶消化产物加到50ul的DMT感受态细胞中(来自定点突变试剂盒 (Fast Mutagenesis System)，在感受态细胞刚刚解冻时加入消化产物)，轻弹混勻，冰浴30 分钟；于42°C准确热激45秒，立即置于冰上2分钟；加到250ul室温的LB培养基中，在摇床中225rpm，37°C培养1小时。然后取200ul菌液铺于氨苄抗性LB培养基上，培养过夜。挑选10个长出的转化子，分别接入氨苄抗性LB培养基中，培养过夜。第二天再从这10个过夜培养物中用质粒抽提试剂盒提取质粒；把提取的10个质粒送到北京诺赛公司进行序列测定，以鉴定突变基因的正确性。 选出载有正确突变基因的重组甘赖脯胰岛素质粒。(2)重组甘赖脯胰岛素表达工程菌的构建将2ul筛选出来的载有正确突变基因的重组甘赖脯胰岛素质粒加入到IOOul Escherichia coli(3110)的感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入产物)，轻弹混勻，冰浴30分钟；于42°C准确热激90秒，立即置于冰上2分钟；加到300ul室温的LB培养基中，在摇床中225rpm，37°C培养1小时，然后取50ul菌液铺于氨苄LB培养基上，培养过夜。从表达菌种hcherichia coli (3110)的培养平板上挑取单菌落，接种于5ml氨苄LB培养基中，在摇床中225rpm，37°C培养8小时，再从中吸取IOOul菌液接种于IL含有 20%富集培养基的M9培养基中，在摇床中225rpm，37°C培养16小时，制成大量甘赖脯胰岛素的表达工程菌。(3)重组甘赖脯胰岛素工程菌的发酵表达将上述合格的工程菌接种至2L氨苄LB液体培养基中，在摇床中32°C，250rpm培养约6小时，转种到5L发酵罐中，培养至菌密度为0D600值为1. 5-2. 0时，再转接入250L 发酵罐中，并在以下条件下进行发酵培养pH控制在约7. 0 ；溶氧控制在7-65%之间，温度前期控制在32°C，待0D600到20以后升温至35°C，保持2小时后升温至37°C，直至发酵结束。发酵过程中PH值靠补加氨水量控制；溶氧靠补料、通入压缩空气和调整搅拌速度控制。 图2为所得重组甘赖脯胰岛素在250L发酵罐中的各时点电泳表达检测图谱。由电泳图谱可以看出甘赖脯胰岛素在发酵15小时后，13kDa处可见明显的目的蛋白表达条带，26小时电泳扫描表达量为27. 37%。(4)甘赖脯胰岛素原的复性与转化将诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体洗涤液(pH 8. 0，50mM Tris-Cl)中，4-15°C搅拌洗涤1小时，再次离心回收菌体，然后将菌体悬浮在冰水中，在高压勻浆机中进行细胞破碎(750-800个大气压)，通过离心收集甘赖脯胰岛素包涵体，包涵体再通过洗涤(pH8. 0,50mM Tris-Cl，0. 2% Triton X_100)，离心回收沉淀。而后将所得包涵体在高浓度尿素(8M)下进行蛋白质变性，低浓度尿素(1.6M)下进行蛋白质复性，得到有正确构象的甘赖脯胰岛素原。将甘赖脯胰岛素原溶液除盐后用50mM Tris调pH至10. 0，按质量比 1 500-1 1000(E/S，即酶/前体胰岛素原)分别加入胰蛋白酶和羧肽酶B，37°C反应 30min，得到有正确构象的甘赖脯胰岛素。(5)甘赖脯胰岛素的纯化及确认转化后的甘赖脯胰岛素经阳离子交换层析(CM)纯化，层析用缓冲液包含pH5. 0， IOmM柠檬酸，梯度洗脱用0-0. 8M NaCl梯度进行，甘赖脯胰岛素层析后纯度在90%以上。再经反相高压液相层析后，经RP-HPLC检测纯度达到99. 77% (参见图幻，符合国内外药典重组人胰岛素项下的标准要求。将所得重组甘赖脯胰岛素经氨基酸序列分析，所得结构与预
期一致。2. GlyA21人胰岛素(甘胰岛素)和GlyA21-AspB28人胰岛素(甘门冬胰岛素)的制备甘胰岛素和甘门冬胰岛素的制备过程与甘赖脯胰岛素的制备过程一致，只是在质粒构建的步骤中，分别用现有的人胰岛素质粒和门冬胰岛素质粒代替赖脯胰岛素质粒进行。实施例2本发明胰岛素类似物在酸性条件下的稳定性将通过实施例1方法制备得到的本发明胰岛素类似物分别置于pH值为4. 0士0. 2 的溶液中，所得溶液为澄清状态。将上述溶液在2_8°C贮存9个月后，各种胰岛素类似物溶液中的相关蛋白的总增加量不超过1. 26% ；高分子蛋白的增加量不超过0. 55% ；效价的降低量不超过1%，都在95% -105%的范围内。上述结果说明，由于本发明胰岛素类似物将酸性条件下易脱氨的A21位天冬酰氨替换为甘氨酸，因此在酸性条件下表现出了较好的稳定性。实施例3本发明药物制剂的制备方法及成分分析1.本发明药物制剂的制备方法< 原料 > 甘赖脯胰岛素通过实施例1的方法制备得到。甘精胰岛素甘李药业有限公司提供，批号GLGB09001。盐酸(批号2007080 、氢氧化钠(批号20090804)购自湖南尔康制药有限公司； 氯化锌(批号20090522)、间甲酚(07496PK)购自上海京华有限公司；甘油购自浙江遂昌惠康药业有限公司，批号20090921。<制备步骤> 胰岛素母液的制备分别精密称取甘赖脯胰岛素和甘精胰岛素各50万单位，加入到3升蒸馏水中，搅拌混悬均勻，滴加3M盐酸使其完全溶解后，补入适量氯化锌溶液，使最终胰岛素混合液中每毫升含锌量约为30ug，然后补水至5L。其他辅料母液的制备精密称取甘油160克，间甲酚27. 0克，放于适量注射用水中，搅拌至全部溶解后补水至4升。混合方法将其他辅料母液加入到胰岛素母液中，再用10%氢氧化钠或10%盐酸调溶液的PH值至4. 0士0. 2，补水至终体积10升，贮存于2-8°C的条件下。最终所得澄清溶液中甘赖脯胰岛素和甘精胰岛素的浓度各为50IU/ml，总活性胰岛素成分的浓度为100IU/ml。2.本发明药物制剂的成分分析分析方法高效液相色谱法分析条件使用烷基硅烷键合硅胶为填充物的C4柱(3. 5μπι，15(3πιχ4.6πιπι I. D.)，用高氯酸钠盐缓冲液(精密称取无水磷酸二氢钠5. 9998g，加水900ml溶解，再加高氯酸钠14. 046g溶解，混均，用高氯酸调其pH值为2. 5，加水至1L，过滤)为流动相A ；再取高氯酸钠盐缓冲液-乙腈(50 50)为流动相B，流速为l.Oml/min，柱温为40°C，检测波长为214nm。洗脱梯度为60% B平衡，初始状态为60% B，然后在49分钟内将B%增至74%， 50分钟时为100% B，持续10分钟，61分钟时为60% B，持续5分钟。分析结果图4为本发明甘赖脯胰岛素与甘精胰岛素以50 50的百分比预混后的高效液相色谱的保留时间测定图谱。从图4可以看出，在pH4. O时，速效和长效胰岛素类似物的含量比例基本为50 50，且两样品峰之间的分离度大于2.0，说明两种类似物在该条件下可以得到充分的分离，即可以进行有效含量分析，保证生产过程中各组份的含量准确控制。本发明实施例1中所制备的GlyA21人胰岛素、GlyA21_ASpB28人胰岛素也可按上述方法与甘精胰岛素混合，并可按照需要以不同比例投料，制成含量百分比为30 70-70 30 的混合药物制剂。所制得制剂通过高效液相色谱法分析也可以在PH4. O时得到充分的分离，即可以进行有效含量分析，保证生产过程中各组份的含量准确控制。实施例4本发明药物制剂的安全性评价试验<试验药品 > 实施例3制备的本发明药物制剂。<试验动物> Wistar大鼠，体重200 220g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号 SCXK-(吉)2003-0007。昆明种小白鼠，体重18 22g，由长春生物制品研究所提供，许可证号 SCXK-(吉)2006-0001。豚鼠，体重300 350g，吉林大学实验动物中心，许可证号SCXK-(吉)2008-0004。家兔，体重2. O 3. Okg,吉林大学实验动物中心，许可证号 SCXK-(吉)2008-0004。〈试验方法和结果>:1.急性毒性研究按照现有药物急性毒性研究方法(参见徐叔云，《药理实验方法学》第二版，人民卫生出版社，第201页)，观察小鼠禁食后皮下注射本发明药物制剂引起的急性毒性反应，记录14日内试验动物的活动情况及死亡数，计算LD50。所得计算结果为雄性小鼠LD50 = 3. 346U/Kg，其 95%的可信限为 2. 372 4. 719U/kg ；雌性小鼠LD50 = 4. 767U/kg，其 95%的可信限为 3. 556 6. 391U/kg ；雄性大鼠LD50 = 7. 447U/kg，其 95% 的可信限为 6. 159 9. 004U/kg。
对死亡动物解剖肉眼观察，主要脏器无异常。2.长期毒性研究试验方法分别给大鼠皮下注射3.72U/kg(LD50的1/2)、2. OU/kg(大鼠药效剂量)、1.0U/kg(LD50的1/8)剂量的本发明药物制剂，以及生理盐水(对照组)，每日1次，连续5周，再停药观察2周。试验结果在给药期间、停药恢复期间，本发明药物制剂各剂量组大鼠的体重、饮食量、饮水量及一般活动等与生理盐水组(对照组)比较均无明显差异。给药5周、停药2 周时，本发明药物制剂各剂量组大鼠血常规指标、凝血项指标、血生化指标、血清抗体、脏器系数及脏器组织病理学检查等指标与生理盐水组(对照组)比较均无明显差异。3.免疫毒性试验按照现有动物免疫毒性试验方法(参见《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光敏反应)研究的技术指导原则》，国家药监局，2005年)进行豚鼠的主动全身过敏试验(ASA) 和大鼠的被动皮肤过敏试验(PCA)。①主动全身过敏试验(ASA)-豚鼠试验将本发明药物制剂0. 87U/kg(豚鼠药效剂量的1/ 、3. 48U/kg(豚鼠药效剂量的 2倍)经皮下注射于豚鼠，隔日1次，共5次，末次致敏后的第10天由静脉注射上述药物制剂的2倍量进行激发，观察并记录激发注射后30分钟内豚鼠有无过敏症状两个剂量组的结果皆呈阴性。②被动皮肤过敏试验(PCA)-大鼠试验将本发明药物制剂1. OU/kg(大鼠药效剂量的1/ 、4. OU/kg(大鼠药效剂量的2 倍)经皮下注射于大鼠，隔日1次，共5次，于末次致敏后第11天，腹主动脉采血，制备抗体血清。将上述抗体血清用生理盐水稀释后，在大鼠皮内注射0. Iml，48小时后，静脉注射与致敏剂量相同的抗原(内含0. 75%的伊文思蓝染料)激发，30分钟后测量皮肤内侧的蓝色反应斑直径并判定阴阳性蓝色反应斑直径大于5mm者判定为阳性，本发明药物制剂两个剂量组的结果皆呈阴性。4.刺激性、溶血性试验按照现有动物刺激性、溶血性试验方法(参见《中药、天然药物刺激性、溶血性研究的技术指导原则》，国家药监局，2005年)对家兔进行刺激性试验和溶血试验。①刺激性试验将本发明药物制剂0. 5U/kg(家兔药效剂量的1/ 、2. OU/kg(家兔药效剂量的2 倍)单次经皮下注射于家兔，从注射时至72h，注射局部没有红斑、水肿、充血等反应症状， 其组织病理学检查结果也表明本发明药物制剂的两个剂量组对家兔皮下组织无刺激性。②溶血试验本发明药物制剂在3小时内都没有发生溶血和凝聚现象。由以上安全性评价试验结果可以看出本发明药物制剂对动物均未见明显毒副作用影响，没有过敏现象，注射部位无刺激反应，药物制剂本身无溶血现象。说明本发明药物制剂具有很高的安全性。实施例5本发明药物制剂的药效学试验1、试验药品
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实施例3制备的本发明药物制剂；重组赖脯胰岛素注射液(100IU/ml，批号22080301，由甘李药业有限公司提供)；重组甘精胰岛素注射液(100IU/ml，批号12080303，由甘李药业有限公司提供)。2、试验动物=Wistar大鼠，雄性，50只，体重250 280g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号SCXK-(吉)2003-0007。3、试验试剂葡萄糖试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号 081251. 200802。4、试验仪器GF_D800型半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司。 TGL-16B台式离心机。5、试验设计，具体方法参见徐叔云，《药理实验方法学》第三版，人民卫生出版社， 1517 页①动物分组和建模将50只Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组(不建立高血糖模型，给药生理盐水)；模型组(建立高血糖模型，给药生理盐水)；赖脯胰岛素组(建立高血糖模型，给药赖脯胰岛素)；甘精胰岛素组(建立高血糖模型，给药甘精胰岛素组)；本发明药物制剂组(建立高血糖模型，给药本发明药物制剂)。其中高血糖模型通过以下方法建立先令Wistar大鼠禁食不禁水M小时，尾部静脉注射四氧嘧啶60mg/kg，48小时后形成永久性高血糖模型。②给药和采血高血糖模型建立后，令所有Wistar大鼠禁食不禁水16h，并在给药前先采血测药前血糖，然后对赖脯胰岛素组、甘精胰岛素组、本发明药物制剂组的动物皮下注射相应胰岛素，剂量均选为2. 0IU/kg ；对模型组、正常对照组的动物皮下注射等体积生理盐水。然后于给药后 10min、30min、lh、2h、3h、4h、8h、12h、16h 眼眶采血，3000rpm/min 离心 5min，取血清， 终点法测血糖。③数据处理降糖百分率通过以下公式计算降糖百分率(％)=((药前血糖值-药后血糖值)/药前血糖值)X 100%试验结果采用表示，相同时间点血糖及降糖百分率进行组间t检验。计算结果见表1、表2和图5。表1不同胰岛素对四氧嘧啶高血糖大鼠血糖值(mmol/L)的影响，n = 10)
权利要求
1.一种胰岛素类似物或其可药用盐，其特征在于，所述胰岛素类似物为至少将其A链 A21位的天冬酰胺(Asn)突变为甘氨酸(Gly)的人胰岛素。
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物或其可药用盐，其中胰岛素类似物为A21位上的Asn被Gly取代的人胰岛素。
3.根据权利要求1所述的胰岛素类似物或其可药用盐，其中胰岛素类似物为A21位上的Asn被Gly取代，B^位上的Pro被Lys取代，并且B^位上的Lys被Pro取代的人胰岛ο
4.根据权利要求1所述的胰岛素类似物或其可药用盐，其中胰岛素类似物为A21位上的Asn被Gly取代，B28位上的Pro被Asp取代的人胰岛素。
5.一种胰岛素药物组合物，包含权利要求1-4中任一项所述的胰岛素类似物或其可药用盐，以及长效胰岛素类似物或其可药用盐。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述长效胰岛素类似物选自甘精胰岛素。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的药物组合物，其中所述胰岛素类似物和长效胰岛素类似物的含量百分比为30 70-70 30。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述胰岛素类似物和长效胰岛素类似物的含量百分比为50 50。
9.一种胰岛素药物制剂，包含权利要求5-8中任一项所述的药物组合物和可药用辅料。
10.根据权利要求9所述的药物制剂，该药物制剂的pH为3.5-4. 5。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，该药物制剂的pH为3.8-4. 2。
全文摘要
本发明涉及一种快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物及其药物组合物和药物制剂。该胰岛素类似物的A链A21位的天冬酰胺(Asn)突变为甘氨酸(Gly)，并可以与长效胰岛素类似物如甘精胰岛素混合，制成同时具有速效降糖和平稳长效降糖两种功能的预混制剂，解决现有天然胰岛素(猪、牛、人)和速效胰岛素类似物在酸性环境下不稳定，以及现有胰岛素预混制剂不澄清，需引入外源蛋白(例如鱼精蛋白)作缓释剂而易产生免疫反应，每日需早、晚注射两次的问题，使制剂安全性更高。
文档编号A61P3/10GK102199206SQ201110064530
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者彭毅, 王大梅, 金太河 申请人:甘李药业有限公司