专利名称：一种肿瘤疫苗及其合成方法
技术领域：
本发明关于ー种肿瘤疫苗及其合成方法，其利用生物信息学的运算方式，设计出肿瘤相关抗原的序列，再据之合成肿瘤抗原，以形成一肿瘤疫苗。
背景技术：
癌症，或称恶性肿瘤，在世界各国均是ー项令人忧心的健康问题，尽管多年来各界已不断发展出新的诊断技术和各类治疗方法，例如外科手术切除、放射性治疗、以及化学治疗，但是和一般常见的糖尿病、心脏病、感染性疾病、和精神性疾病比较起来，癌症依旧是首要的死亡原因。因此，现今医界的首要课题便是研发出更新、更有效、以及能避免肿瘤复发的治疗方法。基于上述理由，科学家将一部份心カ转移到研究免疫系统与癌症之间的关系上，因此肿瘤免疫治疗方法在过去十年中渐渐地发展成为ー项深具潜力的癌症治疗方式， 为人们提供另ー种治疗的选择。所谓癌症免疫疗法，指的是利用人体的免疫系统来对抗肿瘤，通过激发或调控人体专ー性免疫力来杀死癌细胞，以达到治疗癌症的目的。树状细胞(Dendriticcell, DCs)是专门的抗原提呈细胞(Antigen-presentingcell)，近来常常被应用于免疫疗法。树状细胞可以将抗原呈现给未活化的T细胞，进而启动细胞和体液免疫反应。树状细胞会表达大量的细胞表面主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibility complex,以下简称MHC)分子并且辨认多种来自细菌、病毒、其它病原体和内生性肿瘤的抗原。载有肿瘤抗原的树状细胞可以被称作树状细胞疫苗(DCvaccine)，树状细胞疫苗可以引发具有抗原专ー性的免疫反应来对抗肿瘤。然而，树状细胞用于癌症的免疫疗法却有其限制。公知技术中，通常需要将树状细胞与分离自病人体内肿瘤细胞的肿瘤抗原共同培养一段时间后，才能让树状细胞将该肿瘤抗原呈现给T淋巴细胞表面，以引发人体内针对该肿瘤抗原的免疫反应。由于不同个体的树状细胞表达不同的MHC分子，ー种MHC分子只能识别某ー种或某ー类抗原决定子(Epitope)，其称为MHC的限制性反应(MHC restricted response)。因此,仅用一种肿瘤抗原实施免疫治疗,其效果与毒杀对象局限。再者，公知的树状细胞免疫疗法目前仅能针对个别患者当时所患的癌症量身订制，并且制备的过程与技术繁复冗长、花费不赀，就成本考虑而言施行不易。由于免疫系统具有辨识非自体的抗原并加以消灭的能力，肿瘤所表达的抗原(或称肿瘤抗原)已成为可以发展癌症免疫疗法的工具之一。用于免疫疗法的肿瘤抗原可以被区分为两种类型，一类是只有肿瘤细胞会表现的肿瘤特异性抗原(tumor-specificantigen,以下简称TSA);另ー类抗原是在肿瘤细胞的表现量明显高于一般正常细胞表现量的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,以下简称TAA)。然而,要能找到ー个TSA来制备肿瘤疫苗是相当不容易的。另ー方面，由于正常细胞也会表现TAA，所以免疫系统会将TAA视为自体分子，因此使用TAA来制备肿瘤疫苗所能引发的免疫反应和肿瘤毒杀效果非常低。肿瘤相关抗原之所以不能引发强效的免疫反应，是因为免疫系统对于TAA这类自体抗原具有耐受性。免疫系统的ー个特色是它具有耐受性，这在协助免疫系统区分自体与外来分子时扮演很重要的角色。免疫系统的耐受性可以分为两种，ー是中枢耐受性，另ー个是周边耐受性。中枢耐受性表现在胸腺(产生T淋巴球)和骨髄(产生B淋巴球)。以T淋巴球来说，自体抗原与MHC组合而成的复合体和T细胞受器(T cellreceptors,以下简称TCR)之间的亲和カ对于T细胞的免疫耐受性而言相当重要，凡是被MHC识别的自体抗原与T细胞受器有高亲和カ的先驱T细胞都会经由负筛选的作用而被剔除，只留下亲和力低的T细胞，以防止免疫系统对自体细胞组织展开攻击。虽然这个机制在正常情况下可以保护自体的细胞组织，但在癌症发生的时候，无异是给了癌细胞ー个保护伞，让癌细胞躲过人体的保卫系统，在人体内日益壮大形成肿瘤，终致危害健康。在公知的以肿瘤抗原作为免疫疗法的技术中，仅能针对单ー种类的肿瘤进行治疗，或者仅能引发细胞性免疫反应而无法刺激体液性免疫反应，效果局限且不能防止癌细胞复发，并且由于无法突破人体免疫系统的耐受性机制，因此所能引发的免疫效カ不够强，导致治疗徒劳无功。 综上所述，免疫疗法固然对于癌症的治疗而言，提供了一种新的可能，但是公知的癌症免疫疗法却存在着如只能针对单ー个体内的特定肿瘤抗原进行毒杀、只能攻击某ー种肿瘤、费用昂贵又费时、无法突破自体免疫耐受性、甚至引发副作用、与无法防止复发等问题尚待克服。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种可以不受限于免疫系统耐受性和MHC的限制性，能够针对多种不同癌细胞进行毒杀攻击、且可以防止癌症复发的肿瘤疫苗。本发明的另一目的在于提供ー种合成方法，以制备可不受限于免疫系统耐受性、能够针对多种不同癌细胞进行毒杀攻击、且可以防止癌症复发的肿瘤疫苗。虽然T细胞受器对于MHC的辨认具有很强的专ー性，但有初歩的研究结果显示，当有不同的抗原和ー个或多个MHC分子结合时，会驱使TCR的抗原辨识能力下降，导致T细胞对自体抗原产生交叉反应，显示TCR的辨识能力具有可变性。现有的ー种假说是，源于寄生虫、细菌和病毒这类具传染性的病原体抗原，可能会因为病原体和宿主自体抗原间的某些微差异而导致免疫系统降低对于自体抗原的免疫耐受性的限制。因此推估，只要改变依照TAA所产生的抗原的氨基酸序列，便可以透过树状细胞协助活化可毒杀肿瘤的T细胞，而引发针对表达TAA的肿瘤细胞发生自体免疫反应。根据这个理论，发明人等决定以氨基酸序列为基础来设计肿瘤疫苗以弓I发免疫系统对癌细胞的攻击。大多数的肿瘤疫苗是依据其和人类主要组织相容性复合体(HLA)的结合力设计的。含有8至10个氨基酸的单ー胜肽抗原决定子(single-peptide epitope)可以和树状细胞上的第一型细胞表面主要组织相容性复合体(MHCI)结合而引发细胞毒杀T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的反应,而可以和第二型细胞表面主要组织相容性复合体(MHCII)结合的胜肽类抗原决定子可以活化辅助T细胞(Helper T cell)，以协助CTL的反应和抗体的产生。MHCII不同于MHCI的地方在于，MHCII的抗原结合区可以容纳不同长度的胜肽链，通常介于13至25个氨基酸序列的长度。由于活化后的辅助T细胞也可以协助活化记忆T细胞(Memory cytotoxic T cells),因此和MHCII相关的肿瘤疫苗可以有效的防止癌症在治疗后再度复发。是故，发明人决定着手研发对于MHCII具有专ー性的肿瘤疫苗，以用来制备可不受限于免疫系统耐受性、又能够针对多种不同癌细胞进行毒杀攻击的肿瘤疫苗。
本发明采用表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor,以下简称EGFR或ERBB)与上皮黏蛋白I (Mucinproteintypel，MUCI)作为肿瘤疫苗的候选基因。表皮生长因子受体是受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases)家族的ー员，是ー种穿膜醣蛋白，具有ー细胞外的配位子结合区、一穿膜亲脂性片段、以及ー细胞内蛋白质激酶(protein kinases)功能区。目前在人体共发现有四种EGFR亚型，包括ERBB1，ERBB2，ERBB3和ERBB4。EGFR在多种不同的实体肿瘤中高度表现，其中包括结肠直肠癌、乳癌、膀胱癌、肾脏癌、肺癌、胰脏癌、前列腺癌以及头颈癌等。上皮黏蛋白1(以下简称MUC1)是一种穿膜醣蛋白(glycosylatedtransmembraneprotein), MUCl在一些常见的上皮恶性肿瘤中会大量表达，例如胰脏癌、乳癌、前列腺癌和大肠癌等。由于MUCl和恶性细胞的快速增生有夫，因此MUCl已被视为ー个在功能上具有显著意义的致癌基因，且被归类为ー种肿瘤相关抗原而将之应用于癌症免疫疗法。本发明人通过生物信息学方法，找出和人类白血球组织(Humanleukocyteantigen,HLA) ニ类抗原(即人类的细胞表面主要组织相容性复合体MHCII)具有较高亲和 力的序列，经过设计改良，而研发出能与HLA ニ类抗原分子专ー性结合的ERBB1、ERBB2和MUCl抗原序列，共得到14种，井分为野生型和突变型两组，每组各含7种抗原。这些序列可为大多数的HLA ニ类抗原所辨认。这些HLA分子的分布可覆盖99%以上的华人群体(HanChinese population)。该 14 种抗原序列如 SEQ NO. I 至 SEQ NO. 14 所不。本发明实施例提供ー种肿瘤疫苗，其包括至少ー肿瘤抗原，其中，该肿瘤抗原的序列选自SEQ NO. I至SEQ NO. 14的群组，其中各抗原序列以道尔顿为单位的分子量分别为SEQ NO. I :3693 ；SEQ NO. 2 :4121 ；SEQ NO. 3 :3729 ；SEQ NO. 4 :3842 ；SEQ NO. 5 :4003 ；SEQ NO. 6 :3818 ；SEQ NO. 7 :3901 ；SEQ NO. 8 :3954 ；SEQ NO. 9 :3885 ；SEQ NO. 10 :4010 ；SEQNO. 11:3927 ；SEQ NO. 12 :3866 ；SEQ NO. 13 :3641 ；SEQ NO. 14 :3629。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，该肿瘤抗原序列由至少30个氨基酸组合而成。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，该肿瘤抗原以化学法或基因工程法合成。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，该肿瘤抗原具有专ー性的一表皮生长因数受体与一上皮黏蛋白的抗原决定子，且是人类白血球组织ニ类抗原分子的限制性抗原。本发明实施例提供一种肿瘤疫苗的合成方法，其包含以下步骤(a)根据一人类白血球组织抗原DR、DQ和DP各亚型分子在华人群体中的分布，选择ー表皮生长因子受体I、一表皮生长因子受体2以及ー上皮黏蛋白I的氨基酸序列上可被这些人类白血球组织ニ类抗原分子所识别的抗原决定子；(b)以生物信息学方法分析抗原决定子与各人类白血球组织ニ类抗原分子之间的亲和力，并挑选出合适的肿瘤抗原氨基酸序列；(c)根据步骤(b)的结果设计出14种包含至少30个氨基酸的ー肿瘤抗原序列；(d)以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原；(e)将这些合成的14种肿瘤抗原分别与ニ甲基亚砜混合，使每ー种肿瘤抗原混合液的最终浓度为20mg/mL至40mg/mL，并将这些肿瘤抗原混合液分为野生型和突变型两组，每组包括7种肿瘤抗原混合液；(f)将同一组中的肿瘤抗原混合液分别取出相同体积，并充分混合在一起，而得到一包含7种野生型或突变型肿瘤抗原的肿瘤疫苗，并使其中每种肿瘤抗原的最終浓度为2mg/mL 4mg/mL。作为本发明实施例的一种优选方案，其中，这些肿瘤抗原的抗原决定子能被人类白血球组织ニ类抗原中分子所识别。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图I为本发明中，肿瘤疫苗合成方法的流程图。
具体实施例方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。I.肿瘤疫苗设计与实施首先，以人类表皮生长因子受体I (ERBBl)、表皮生长因子受体2 (ERBB2)以及上皮黏蛋白l(Human mucin type I protein, MUC1)作为癌症肿瘤疫苗候选基因,将这些候选基因所转译的氨基酸序列与华人(Han Chinese)的HLA ニ类抗原序列进行比对。接着，利用生物信息学方法找出与这些华人的HLA ニ类抗原之间亲和力高的肿瘤抗原氨基酸序列。其中，所谓生物信息学方法包含利用计算机与软件等辅助工具进行数据库检索、运用计算机运算法对检索到的序列数据进行比对与分析、使用计算机运算法预测HLA ニ类抗原和ERBBU ERBB2与MUCl肿瘤抗原氨基酸序列之间的亲和力等。根据前述生物信息学方法预测的结果，挑选出适合的肿瘤抗原序列，组合成含有至少30个氨基酸的肿瘤疫苗，其中较佳的实施态样为含有33个氨基酸(33-mer)。依照上述方法，可以得到较佳的14种肿瘤抗原序列，最后再以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原(实际合成时并不需要使用实体的ERBB1、ERBB2、MUCl等，而用生物信息学方法得到即可)。前述的14种ERBB1、ERBB2与MUCl肿瘤抗原可通过化学方法或基因工程方法合成而得，每种合成的肿瘤抗原以适量的ニ甲基亚砜(DMSO)溶解，并将最终浓度分别调整为20mg/mL至40mg/mL。之后将14种肿瘤抗原的混合液分为野生型和突变型两组，每组7种。将每组(野生型组或突变型组)7种ERBB1、ERBB2与MUCl肿瘤抗原混合液以等体积的比例混合在一起后成为ー肿瘤疫苗，其中姆种肿瘤抗原的最终浓度调整为2mg/mL至4mg/mL。取出50μ I至200μ I的肿瘤疫苗与树状细胞进行混合。其中较佳的实施态样为ImL的树状细胞(每毫升约含I至2百万个树状细胞)加5 μ 1-10 μ I的肿瘤疫苗，并使肿瘤抗原的最终浓度成为20 μ g/mL至40 μ g/mL,而得到一包含ERBBl、ERBB2与MUCl的树状细胞肿瘤疫苗，请參照图I。该肿瘤疫苗可以利用体外培养的树状细胞携帯方式或用皮下多点注射方式施打于人体，而携带ERBBl、ERBB2与MUCl肿瘤抗原的树状细胞可以活化辅助T细胞，引发其针对ERBBl、ERBB2与MUCl的免疫反应，包括分泌特异性的抗ERBBl、ERBB2与MUCl肿瘤抗原的抗体。因此该肿瘤疫苗可以用于治疗大多数的实体肿瘤，并且可以引发免疫作用的记忆性，以防止癌症的复发，例如预防经过初步治疗(如外科手术切除与放射性治疗)后的肿瘤复发。2.树状细胞体外培养2. I.树状细胞的制备所有操作均严格遵守标准操作规程(SOP)的程序。采集患者外周血100毫升(含2-3X108 个单个核细胞)，肝素抗凝血。经 Ficoll-Paque (GE Health care Life Sciences)分离单个核细胞，制备自体血浆，离心洗涤两次，用无血清RPMI164 0重悬 ，调整细胞浓度为2-4X 106/ml,铺入6孔板,置于37°C>5% CO2培养箱中，孵育两小时后，轻晃6孔板,收集悬浮细胞至另ー个50ml离心管，用无血清RPMI1640培养液洗板1_2次，加入含1%自体血浆的AIM-V培养液继续培养；第三天补加树状细胞培养液2-3ml/孔(Claison，Shanghai,China);第五天加入肿瘤特异性抗原(终浓度为O. 02-0. 04mg/ml)，诱导后12-16小时，カロ入树状细胞成熟因子(Claison, Shanghai, China);第8天收集细胞,离心,生理盐水洗漆3次，用含有10%患者自体血浆的生理盐水重悬，总体积为100ml。2. 2.细胞学分析分别在细胞采集当天及注射后第一周和第四周采集患者外周血10ml，分别用⑶3，HLA ニ类抗原和⑶4单克隆抗体进行荧光双标记(FITC和PE或APC)，分析检测T细胞亚群的百分比值(％ )。如果DR+⑶3+和⑶4+⑶3+T细胞百分比值随时间上升，表明T细胞已被肿瘤抗原启动。此时可输入自然杀手细胞(Natural killer cell, NK cells) 02. 3.抗体分析分别在细胞采集当天及注射结束第1、3、6、12和24个月采集患者外周血5ml，离心分离血衆或血清。采用酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血中抗ERBB1、ERBB2与MUCl肿瘤抗原的抗体水平。根据抗体水平决定是否需要再次注射疫苗。3.皮下多点注射3. I.疫苗注射剂量与使用方式该肿瘤疫苗可以利用皮下多点注射的方式使用。每次治疗需要注射700-1400微克(μg/次)肿瘤抗原混合液(每种抗原量为100-200微克)，注射前应与loo微克佐剂如颗粒-巨卩遼细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)混合。每个月注射一次，共连续注射4-6个月。以后根据血中抗ERBB1、ERBB2与MUCl肿瘤抗原的抗体水平决定是否需要再次注射疫苗。3. 2.抗体水平分析分别在首次注射和毎次再注射时及治疗结束后每隔6个月采集患者外周血5ml，离心分离血衆或血清。采用酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血中抗ERBB1、ERBB2与MUCl肿瘤抗原的抗体水平。根据抗体水平决定是否需
要再次注射疫苗。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
权利要求
1.ー种肿瘤疫苗，其包括至少ー肿瘤抗原，其中，该肿瘤抗原的序列选自SEQ NO. I至SEQ NO. 14的群组，其中各抗原序列以道尔顿为单位的分子量分别为SEQ NO. I :3693 ；SEQNO. 2 :4121 ；SEQ NO. 3 :3729 ；SEQ NO. 4 :3842 ；SEQ NO. 5 :4003 ；SEQ NO. 6 :3818 ；SEQ NO. 7 3901 ；SEQ NO. 8 :3954 ；SEQ NO. 9 :3885 ；SEQ NO. 10 :4010 ；SEQ NO. 11 :3927 ；SEQ NO. 12 3866 ；SEQ NO. 13 :3641 ；SEQ NO. 14 :3629。
2.根据权利要求I所述的肿瘤疫苗,其中，该肿瘤抗原序列由至少30个氨基酸组合而成。
3.根据权利要求I所述的肿瘤疫苗，其中，该肿瘤抗原以化学法或基因工程法合成。
4.根据权利要求I所述的肿瘤疫苗，其中，该肿瘤抗原具有专ー性的一表皮生长因数 受体与一上皮黏蛋白的抗原决定子，且是人类白血球组织ニ类抗原分子的限制性抗原。
5.一种肿瘤疫苗的合成方法，其包含以下步骤 (a)根据一人类白血球组织抗原DR、DQ和DP各亚型分子在华人群体中的分布，选择ー表皮生长因子受体I、一表皮生长因子受体2以及ー上皮黏蛋白I的氨基酸序列上可被这些人类白血球组织ニ类抗原分子所识别的抗原决定子； (b)以生物信息学方法分析抗原决定子与各人类白血球组织ニ类抗原分子之间的亲和力，并挑选出合适的肿瘤抗原氨基酸序列； (c)根据步骤(b)的结果设计出14种包含至少30个氨基酸的ー肿瘤抗原序列； (d)以化学法或基因工程法合成这些肿瘤抗原； (e)将这些合成的14种肿瘤抗原分别与ニ甲基亚砜混合，使每ー种肿瘤抗原混合液的最终浓度为20mg/mL至40mg/mL，并将这些肿瘤抗原混合液分为野生型和突变型两组，每组包括7种肿瘤抗原混合液； (f)将同一组中的肿瘤抗原混合液分别取出相同体积，并充分混合在一起，而得到一包含7种野生型或突变型肿瘤抗原的肿瘤疫苗，并使其中每种肿瘤抗原的最終浓度为2mg/mL全 4mg/mL。
6.根据权利要求5所述的肿瘤疫苗的合成方法，其中，这些肿瘤抗原的抗原决定子能被人类白血球组织ニ类抗原中分子所识别。
全文摘要
本发明关于一种肿瘤疫苗及其合成方法，其以表皮生长因子受体1(ERBB1)、表皮生长因子受体2(ERBB2)、以及上皮黏蛋白1(MUC1)作为候选基因，再利用生物信息学的运算方式，设计出可以不受限于免疫系统耐受性、能够针对多种不同类型的肿瘤进行毒杀攻击、并且可以防止癌症复发的一种肿瘤疫苗。
文档编号A61K39/00GK102716472SQ20111007987
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者李光辉 申请人:李光辉