专利名称：一种siRNA序列化学修饰的方法、产品及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA序列修饰的方法，特别涉及一种通过引入异核苷酸对其进行化学修饰的方法，产品及其在疾病治疗特别是肿瘤治疗中的应用，特别是通过本发明的方法获得的siRNA及其在黑色素瘤治疗方面的应用。
背景技术：
黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率比较低，一般为全部恶性肿瘤的1%~3%,但恶性度高，是一种临床治疗上颇为棘手的恶性肿瘤黑色素瘤，大多源于皮肤，也可以是眼和鼻腔等处。黑色素瘤病人的早期治疗效果佳，如果瘤直径< 2_时被诊断出，手术治愈率可达到90%。但是它生长迅速，早期筛查效果确实率差，并且早期病发就会发生肝脏、肺、骨和脑等部位的转移，恶化快速。目前恶性黑色素瘤的治愈率极低，五年的存活率 低于5%，大多病人会在诊断数月后死亡。各种常规的癌症治疗方法(如手术、放疗、化疗以及生物疗法等)都无多大明显的效果。其中，化学治疗是恶性肿瘤综合治疗中必不可缺少的重要手段。但是恶性黑色素瘤对各种化学治疗药物不敏感，而且通常表现出较强的耐药性。一些常规有效的化疗药物，如烷化剂类达卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺(TMZ);钼类顺钼(DDP)、卡钼；亚硝基类卡莫司汀、洛莫司汀；微管蛋白抑制剂长春碱类、紫杉醇类药物等，无论是单药治疗还是联合化疗对提高肿瘤缓解以及延长生存都没有显著的疗效。白细胞介素2(InterleUkine-2)对恶性黑色素瘤病人有一定的疗效，但是毒性大、费用高，应用受到限制。目前对于转移性恶性黑色素瘤的治疗还没有建立标准的治疗手段，仍然是一个非常棘手的问题，迫切需要研发新的化疗药物、靶向药物和其他治疗手段。同其他肿瘤一样，黑色素瘤的发生是环境因素(日光暴晒等)与遗传基因相互作用的结果，这些因素相互关联决定了肿瘤的发生和发展进程。普遍适用的Clark模型将黑色素瘤细胞恶性转化过程分为良性痣、构建不良痣、放射生长期、垂直生长期、和转移性黑色素瘤等5步。在各个恶性转化阶段，都出现了多种癌基因、抑癌基因、细胞周期调节蛋白、凋亡调节蛋白、细胞黏附分子、生长因子的异常变化，例如RAS、RAF、⑶K、p53、AKT、MITF,av^3> EGF、VEGF等等。这些变异的基因和蛋白可能成为黑色素瘤恶性化程度的指标，更可能逐渐成为不同阶段肿瘤进行有效治疗的药物靶标。从分子机制角度研究这些变化基因和蛋白对黑色素瘤细胞组织的恶性化程度和转移率的影响，为揭示黑色素瘤潜在生物学病因，有效地进行疾病治疗，提供理论基础。其中G蛋白RAS和RAF丝/苏氨酸蛋白激酶是ERK (extracellularsignal-regulated kinase :细胞外信号调节激酶)级联信号通路中重要的成员，由于RAS和BRAF激酶的变异造成肿瘤细胞中ERK通道被异常激活，导致肿瘤细胞的无限增殖、存活、迁移和侵袭。但是大于90%的恶性黑色素瘤组织中发现N-RAS(RAS的一类亚型，占15% )或BRAF (RAF的一类亚型，占60-80% )的变异，导致ERK信号通路异常无控激活，是造成黑色素瘤细胞的无限增殖和快速迁移的重要原因之一。ERK信号通道是被最早发现的一个促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联信号通路。正常情况下，只有当细胞膜受体与胞外配体(生长因子、激素、细胞黏附分子等)配位结合后，细胞内膜的G蛋白Ra s才会交换结合GTP被激活，经过RAF、MEK1/2、和ERK1/2等激酶的逐级磷酸化激活，最后活化的ERK1/2蛋白激酶跨膜进入细胞核内，调控例如细胞增殖、存活、迁移、恶化、以及血管生成等一系列的细胞生命过程。ERK通道是正常细胞维持其正常生命过程重要的必不可少的信号通道，但是通道的异常激活(配体非依赖性)也是导致细胞癌变的主要原因之一(占30%的人类肿瘤)。除黑色素瘤外，原发性肝肿瘤、结肠肿瘤、黑色素瘤、甲状腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢癌等，特别是侵袭、转移、恶性肿瘤组织中均检测到ERK信号通道的过度活化(图I)。ERK通道上下游各种激酶一直是肿瘤靶向药物设计的重要靶标，特别是黑色素瘤的药物设计。针对ERK信号传导通道的小分子药物，一直是黑色素瘤药物研发的重点。临床研究结果显示，靶向突变N-RAS、MEK1/2同源蛋白的小分子药物能有效抑制黑色素瘤进程，却有较大的毒副作用。60-80%黑色素瘤发现BRAF激酶600位的突变，BRAFvkicie是重要的药物靶标。目前最为有效的临床研发药物PLX4032选择性抑制BRAFv6cicie的活性是天然蛋白激酶的3倍。2010年的III期临床实验显示此药物对恶性黑色素瘤有非常好的疗效，能够抑 制大约80%的ERK通道活性，但同时也存在激活通道的药物危害。靶向ERK通道的小分子药物对恶性黑色素瘤的增殖抑制效果显著，这足以证明突变NRAS、BRAF，和MEK1/2等靶标对于抑制黑色素瘤的有效性。它们的毒性是由于对通道靶标的专一丨I"生识别差造成的。RNA干扰(RNA interference,简称RNAi)技术高选择性地降解靶mRNA，沉默相应蛋白的表达，已经被普遍用于基因和蛋白功能的研究以及疾病的诊断治疗研究。随着RNA干扰技术的成熟发展，将siRNA技术运用于肿瘤治疗，从而达到抑制肿瘤的生长和转移，最终达到治疗肿瘤的目的己经成为可能。siRNA干扰技术应用于肿瘤治疗与以前的肿瘤基因治疗方法相比较，具有以下几个独特的优点①特异性较高，siRNA引起的是转录后的特异的基因沉默，因而避免了其对机体正常系统的干扰。②高效率，RNA干扰抑制基因表达的效果与其它基因治疗方法相比效果显著，因此siRNA是一种极其有潜力的肿瘤治疗策略。但是天然结构的siRNAs不能够完全满足作为基因药物的需要，必要的化学修饰能够改善其体内稳定性、透膜性、生物利用度等特性，提高其沉默效应。尽管siRNA体内稳定性差，但由于黑色素瘤属于表皮肿瘤，独立肢体灌注是主要的给药途径，可以有效避免siRNA的弱点，因此将siRNA作为黑色素瘤的治疗工具是有价值的。在第一阶段的研究过程中，我们采用特异性针对MEKl基因的siRNA阻断其功能，考察MEKl基因被沉默后下游ERK蛋白及pERK蛋白的表达情况，从而确证了 MEKl基因在黑色素瘤细胞增殖中的重要作用。修饰的特异序列(SiMEKl)可能在制备有效的治疗黑色素瘤的基因药物中得到应用。但是siRNA作用的分子生物学机制比较复杂，化学修饰在改善其理化性质及生物活性方面的作用需要做进一步的探讨。
发明内容
为了克服天然的SiRNA在血清中稳定性较差及非特异性的沉默活性作用(脱靶效应)，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用异核苷对siRNA进行化学修饰以提高其稳定性及降低脱靶效应的方法。其特征在于在欲修饰的siRNA序列中掺入化学式(I)及(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，
权利要求
1.一种siRNA序列化学修饰的方法，其特征在于在欲修饰的siRNA序列的合成中掺入化学式(I)及(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，
2.如权利要求I所述的siRNA序列化学修饰的方法，其特征在于使用固相合成，采用亚磷酰胺法，在DNA合成仪上，将一个或几个权利要求I所述的异核苷亚磷酰胺单体掺入到所合成的序列中。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应脱DMT、偶联、封闭、氧化。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于在掺入位使用异核苷亚磷酰胺单体代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于合成寡核苷酸链的条件是采用增加异核苷亚磷酰化单体的进样次数至3次；每次进样后的偶联时间为300秒/次；合成siRNA的条件是每个循环偶联时间增加至45分钟，900秒/次X 3次。
6.根据权利要求1-5任一项所述的化学修饰的方法所合成的siRNA在制备疾病治疗药物方面的应用。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法合成针对人黑色素瘤细胞中MEK-I基因的异核苷掺入的siRNA序列，修饰前的siRNA序列为 正义链5’ -GCAACUCAUGGUUCAUGCUdtdt-3’ 反义链3，_dtdtCGUUGAGUACCAAGUACGA-5’。
8.根据权利要求7所述的siRNA序列，其特征在于合成时，在siRNA序列的正义链的I位、8位、9位、11位或12位其中一位或者多位上掺入化学式(I)或(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联。
9.根据权利要求8所述的siRNA序列，其特征在于在合成时，在siRNA序列的正义链的8位上掺入化学式(I)或(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联。
10.根据权利要求9所述的siRNA序列，其特征在于合成时，在siRNA序列的正义链的8位上掺入化学式(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联。
11.根据权利要求7-10任一项所述的siRNA序列在制备治疗人黑色素瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种siRNA序列化学修饰的方法，还涉及该合成的siRNA序列及其在制备治疗疾病特别是黑色素瘤药物中的应用。本发明提供的合成方法，其特征在于在siRNA序列合成过程中掺入了化学式(I)及(II)所示的异核苷亚磷酰胺单体，从而得到一种异核苷修饰的siRNA，其具有理化性质稳定、合成效率高等特点，具有比天然siRNA更好的生物活性。通过该方法修饰的人黑色素瘤细胞MEK-1基因的siRNA序列，相较天然未修饰的siRNA序列，具有更好的稳定性及沉默活性，具有潜在的制备特异性治疗黑色素瘤药物的开发前景。
文档编号A61K48/00GK102757961SQ20111010526
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者张 浩, 张礼和, 杨振军, 武芸, 郭羽佳, 陈卓 申请人:北京大学