专利名称：一种万能供肝的制备方法
技术领域：
本发明属于临床医学研究领域，具体涉及一种血型抗原为A型、B型、或AB型肝脏转变为0型万能供肝的制备方法。
背景技术：
据世界卫生组织报告，目前全世界约有3. 5亿人为乙肝肝炎病毒携带者，每年约有4500万人死于肝硬化，6000万人死于原发性肝癌。其中3000万为慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌，每年死于慢性肝病的就高达30万人。而盛行的酒文化和超负荷工作，催化剂般促进肝炎快速进展为爆发性肝功能衰竭或肝硬化、肝癌。肝脏移植已成为公认的治疗终末期肝病的最有效治疗方法，因此近几年活体肝脏移植在国内几大肝脏移植中心获得了快速发展。活体肝脏移植的供体主要为配偶和兄弟姐妹，相对限制在有限的几位直系亲属，供受体之间ABO血型不相容就会经常出现。而在紧急或供肝紧缺的情况下，需进行供受体ABO血型不相容的肝脏移植，但其移植肝总5年生存率低于20%，而血型相符或相容的移植肝总5年生存率为68% (根据2006年UNOS数据库统计)。而围手术期死亡率在15% — 45%之间，死因多为感染、超急性排斥反应、原发性肝脏无功能和肝动脉栓塞等，进而导致再次肝移植率高达36%。因此安全实施供受体ABO血型不相容的肝脏移植已成为全球肝脏移植专家的最关注问题之一。
人类ABO血型抗原在肝脏主要表达于肝动脉、门静脉、胆管上皮以及肝窦内皮细胞。当血型不合的供肝植入患者体内后，受体体内作为天然抗体的A、B凝集素，可直接与移植物血管内皮细胞、胆管上皮细胞上的抗原结合而形成抗原抗体复合物，引起一系列抗体介导的排斥反应，激活补体系统，迅速破坏移植物内的血管网，引起广泛血栓，导致移植物失去功能。同时，若受体的抗A、抗B、或抗AB抗体效价过高，则可以出现超急性体液免疫反应的排斥损伤；移植物中的A、B抗原还可刺激受体引起溶血性贫血和血小板减少。因此供受体之间ABO血型相容或相符是实施肝脏移植的一个基本条件。一系列措施已经被发展起来用于改善ABO血型不相容的肝脏移植术后的效果，如发展起来的术中加行脾脏切除，经门静脉、肝动脉灌注前列腺素El和激素，血浆置换、特异性免疫吸附抗体，抗⑶-20单克隆抗体美罗华(anti-⑶20，rituximab)应用，使的ABO血型不相容的肝脏移植效果有了明显的改善，但仍普遍低于血型相合组，其移植肝总5年生存率低于20%，而血型相符或相容的移植肝总5年生存率为68% (根据最新UNOS数据库统计)。而围手术期死亡率在15% — 45%之间，死因多为感染、超急性排斥反应、原发性肝脏无功能和肝动脉栓塞等，进而导致再次肝移植率高达36% ^日本京都大学移植中心是目前全世界最成功开展供受体间ABO血型不相容的肝脏移植，取得术后移植肝5年生存率为65%的可喜成果，但是与其移植中心ABO血型相符或相容的肝脏移植术后的5年生存率 (76.9%)2仍有一定的差距。而应用抗⑶-20单克隆抗体美罗华所引起的肺水肿、低氧血症和心肌梗塞等并发症，肝动脉插管引起的术后肝动脉大出血，门静脉插管引起的门静脉血栓，血浆置换须要大量的血浆和血液传播疾病的风险使的血型不相容的肝脏移植术后并发症明显增多，相应医疗费用明显增加。我科600百多例肝脏移植中，供受体ABO血型不相容的肝脏移植为8例，围手术期死亡率为50% 3。因此改善供受体ABO血型不相容的肝脏移植疗效是移植外科医师的关注热点。那如何解决临床肝脏移植实际中经常面对的ABO血型不相容难题呢？如果能把供肝血管内皮细胞、肝窦内皮细胞和胆管上皮细胞上的ABO血型抗原去除，成为0型供肝， 也就是所谓的“万能供肝”，就将ABO血型不相容的肝脏移植转化为ABO血型相容的肝脏移植，满足了肝脏作为移植免疫特惠器官要求的只要ABO血型相容的原则。ABO血型抗原的差异性是由红细胞膜表面的糖蛋白和糖脂上的寡糖链所决定的， 而构成这些寡糖链的是少数暴露于红细胞表面的糖基。因此，是糖基的构成种类和顺序决定了红细胞表面是抗原A或者抗原B。0型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖；B型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一半乳糖；A型血糖分子结构链为葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺；AB型血糖分子结构链为A型、B型两种结构兼有。从这可以看出，其他血型与0型血的区别就在于多出了些“枝杈”如果剪掉这些“枝杈”所有的血就都就成0型血了。上世纪70到80年代，研究人员已经发现从梭菌中提取的α -半乳糖苷酶、α -岩藻糖苷酶和α -半乳糖胺酶可以分别破坏红细胞的A、Β、Η抗原。之后逐渐证实了绿色咖啡豆中制备的α-半乳糖苷酶可以将B型血转变为0型血，而同时，α - N -乙酰半乳糖胺酶则可以作为A型血向0型血转变的工具酶。但是，咖啡豆中的半乳糖酶却少得可怜，从50磅的咖啡豆中提取的酶，只能完成200毫升B型血变0型血的转化4’5。2007年生物技术的进展使的此设想成为可能。美国哈佛大学和丹麦哥本哈根大学科学家组成的国际研究小组从2500种细菌当中，发现两种特殊细菌Elizabethkingia meningosepticum (脑膜脓毒性菌)和Bacteroides fragilis (脆弱类杆菌)，并提取了特殊的酶(a-Ν —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶)。它们具有高效性和高选择性地将 A型和B型血中的抗原从血红细胞上移除的能力。这项技术已经在标准实验室中得到了验证。将这种细菌蛋白酶60mg置入200毫升的A型、B型或AB型血中，把真菌中的细菌酶当作“剪刀”，将A型、B型和AB型血中的抗原剪掉，1小时后，A、B抗原就完全消失了，这3种血型的血全部转变成0型血，同时保持了红细胞的完整性和功能，整个过程不影响红细胞的生理和代谢参数6。a_N —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶在中性缓冲盐液内发挥高效酶解作用，如分别转化200毫升洗涤A1、A2红细胞分别只需要60毫克、5毫克酶；而酶本身是低消耗，转化每毫升洗涤红细胞60分钟只需300微克酶，同时，抗原转化过程与酶的剂量和时间是成线性关系。重要的是此酶在转化结束后可以用等张PBS缓冲液简单冲洗就可除去6。器官保存研究的进展显示常温下机械持续灌注保存在动物模型已经被证明为优于常规低温保存6夂。肝脏常用保存液之一 HTK (histidine-tryptophanketoglutarate) 液是细胞外液，PH值近中性(7. 2)，渗透压310，在0°C— 4°C可以保存18 —对小时，在 37°C可以保存4小时f^ 12。主要成分是缓冲盐，符合a-Ν —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶酶解的条件。
发明内容
针对上述现有技术存在的诸如肝脏供体不足、ABO血型不相容的肝脏移植等问题， 本发明的目的在于提供一种万能供肝的制备方法，使ABO血型不相容的肝脏移植转化为 ABO血型相容的肝脏。本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的 一种万能供肝的制备方法，包括如下步骤
(1)检测待移植肝脏的血型抗原类型，
(2)对不同血型抗原类型的待移植肝脏做血型抗原转化处理，操作方法如下
对A型肝脏采用保存液I在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对 B型肝脏采用保存液II在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对AB型肝脏同时采用保存液I和保存液II在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上，其中所述的保存液I由3000mlHTK液加入60mg α -N-乙酰基半乳糖苷酶制成，所述的保存液II由3000mlHTK液加入5mg α -半乳糖苷酶制成，
(3)检测血型抗原转化处理后的肝脏，得到血型抗原为0型的万能供肝。按Liu6等方法提取重组的a-N —乙酰基半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶；α — N — 乙酰基半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶能够高效酶解红细胞膜表明的A、B或AB抗原抗原，但在血管上皮、胆管上皮，肝窦内皮的A、B或AB抗原能否被高效酶解？按本发明的技术方案， 适当调整肝脏保存液成分，保存温度，保存方法，既能保存肝脏的生理代谢功能，又能有利于α-N —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶高效酶解肝脏血管上皮、胆管上皮，肝窦内皮的A、B或AB抗原，转化肝脏血管上皮，胆管上皮，肝窦内皮细胞上的A、B或AB血型抗原为0抗原。作为优选，根据本发明所述的一种万能供肝的制备方法，其中，所述的待移植肝脏做血型抗原转化处理前采用肾保存液在15°C下做冲洗预处理。本发明中的肾保存液为市售产品，与HTK液相比，具有成本低的优点，此外，用肾保存液冲洗预处理可去除待移植肝脏的残血和杂质，便于下一步的血型抗原转化处理。作为优选，根据所述的一种万能供肝的制备方法，其中，所述的步骤(2)中持续灌注5个小时以上。本发明的持续灌注必须达5个小时以上才能获得完全去除A抗原和B抗原的0型肝脏。为更加具体地说明本发明技术方案，发明人做了以下实验 1. 1实验操作过程
获得肝脏移植受体切除的完整病肝，(以从脑膜脓毒性菌和脆弱类杆菌)提取重组 a-N —乙酰基半乳糖苷酶和a_半乳糖苷酶加入HTK保存液，此混合液在适当温度(15°C ) 以生物泵经肝动脉、门静脉和胆管持续灌入，持续适当时间后，以国际标准血型检测试剂检测肝脏血管上皮，胆管上皮，肝窦内皮细胞上的血型抗原的转变。此阶段目的是肝脏血型抗原的成功转化。取临床肝脏移植受体切除病肝，3000ml肾保存液(15°C )经肝动脉、门静脉、胆总管冲洗后，用灌注仪以保存液I或/和保存液II在15°c经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注 1、5小时；取肝脏组织粉碎获得勻浆以国际标准血型试剂检测。3000ml HTK液加入60mg(a-N 一乙酰基半乳糖苷酶)制备的保存液I用于A型肝脏、3000ml HTK液加入5mg(a-半乳糖苷酶)制备的保存液II用于B型肝脏，1小时后切除 1块(IOOg)肝组织用于检测，继续灌注5小时后切取肝脏(IOOg)组织检测。1.2实验分组
对照组Al :HTK液15°C对A型病肝持续灌注保存1小时后取肝组织(IOOg)粉碎肝脏获得勻浆以国际标准血型试剂检测。对照组A2 =HTK液15°C对A型病肝持续灌注保存5小时后取肝组织(IOOg)粉碎肝脏获得勻浆以国际标准血型试剂检测。对照组Bl HTK液15°C对B型病肝持续灌注保存1小时后取肝组织(IOOg)粉碎肝脏获得勻浆以国际标准血型试剂检测。 对照组B2 HTK液15°C对B型病肝持续灌注保存1小时后取肝组织(IOOg)粉碎肝脏获得勻浆以国际标准血型试剂检测。实验组A3: HTK液+a-N—乙酰基半乳糖苷酶15°C对A型病肝持续灌注保存1小时后取肝组织(IOOg)勻浆以国际标准血型试剂检测。实验组A4: HTK液+a-N—乙酰基半乳糖苷酶15°C对A型病肝持续灌注保存5小时后取肝组织(IOOg)勻浆以国际标准血型试剂检测。实验组B3 HTK液+ a-半乳糖苷酶对B型病肝持续灌注保存1小时后取肝组织 (IOOg)勻浆以国际标准血型试剂检测。实验组B4: HTK液+ a-半乳糖苷酶对B型病肝持续灌注保存5小时后取肝组织 (IOOg)勻浆以国际标准血型试剂检测。1. 3实验结果对照组A1、A2、B1、B2肉眼均可观察到弱抗原抗体反应，光镜下稍明显抗原抗体反应；实验组A3、B3肉眼下无明显抗原抗体反应，光镜下有弱抗原抗体反应，实验组A4、B4显微镜下无抗原抗体反应。1. 4 结论
①3000ml HTK液+60mg(a-N—乙酰基半乳糖苷酶)用于A型肝脏于15°C下经持续灌注可有效消除A型红细胞抗原，5小时后完全消除A型红细胞抗原。②3000mlHTK液+ 5mg(a-半乳糖苷酶)用于B型肝脏于15°C下持续灌注可有效消除B型红细胞抗原，5小时后完全消除B型红细胞抗原。本发明术语说明
0型血糖抗原结构链葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖， B型血糖抗原结构链葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一半乳
糖，
Al型血糖抗原结构链葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一N-乙酰半乳糖胺，
A2型血糖抗原结构链葡萄糖一半乳糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一N-乙酰半乳糖胺一半乳糖一岩藻糖一N-乙酰半乳糖胺， AB型血糖抗原结构链:A型、B型两种结构兼有。本发明有以下优点
本发明在我国器官移植供体短缺，ABO血型不相容的器官移植效果差的国情下，结合 2007年国际最新生物技术进展，在国际上首次提出了转化供肝A、B或AB抗原为0抗原，转化供肝为“万能供肝”创新性方案。本发明成功转化A、B、或AB型肝脏为0型肝脏，使的全球肝脏移植专家的最关注问题之一的安全实施供受体ABO血型不相容的肝脏移植成为过去，完美解决了供受体血型不相容须行肝脏移植的难题，扩大了供体来源，也可推广应用到其它实质脏器。提供了解决器官移植排斥反应的新思路，从根本上解决了供受体血型不相容行肝脏移植后的血型抗体介导的排斥反应。
图1是本发明比较例肝脏细胞变性光镜照片(X 400)。图2是本发明实施例肝脏细胞变性光镜照片(X 400)。图3是本发明比较例流式细胞仪检测肝细胞凋亡图谱。图4是本发明实施例流式细胞仪检测肝细胞凋亡图谱。
具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1
(1)获取尸体供肝(乙肝阳性或中重度脂肪肝等临床不适宜作供肝)，检测供肝的血型抗原类型为A型，
(2)采用3000ml肾保存液在15°C下做冲洗预处理，然后对A型肝脏采用保存液I在 15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注5个小时，其中所述的保存液I由3000mlHTK液加入60mg α-N-乙酰基半乳糖苷酶制成，
(3)取肝组织(IOOg)检测肝组织血型抗原抗体变化、显微镜下病理大体、ArmexinV流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。检测结果如表1和图2、图4所示。比较例1
(1)获取尸体供肝(乙肝阳性或中重度脂肪肝等临床不适宜作供肝)，检测供肝的血型抗原类型为A型，
(2)采用3000ml肾保存液在15°C下做冲洗预处理，然后对A型肝脏采用保存液I在 15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注1个小时，其中所述的保存液I由3000mlHTK液加入60mg α-N-乙酰基半乳糖苷酶制成，
(3)取肝组织(IOOg)检测肝组织血型抗原抗体变化、显微镜下病理大体、ArmexinV流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。检测结果如表1和图1、图3所示。实施例2
(1)获取尸体供肝(乙肝阳性或中重度脂肪肝等临床不适宜作供肝)，检测供肝的血型抗原类型为B型，
(2)采用3000ml肾保存液在15°C下做冲洗预处理，然后对B型肝脏采用保存液II在 15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注5个小时，其中所述的保存液II由3000mlHTK液加入5mg α-半乳糖苷酶制成，
(3)取肝组织(IOOg)检测肝组织血型抗原抗体变化、显微镜下病理大体、Armexin V流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。检测结果如表1和图2、图4所示。比较例2
(1)获取尸体供肝(乙肝阳性或中重度脂肪肝等临床不适宜作供肝)，检测供肝的血型抗原类型为B型，
(2)采用3000ml肾保存液在15°C下做冲洗预处理，然后对B型肝脏采用保存液II在 15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注1个小时，其中所述的保存液II由3000mlHTK液加入5mg α-半乳糖苷酶制成，
(3)取肝组织(IOOg)检测肝组织血型抗原抗体变化、显微镜下病理大体、ArmexinV流式细胞仪检测肝细胞凋亡情况。检测结果如表1和图1、图3所示。表 权利要求
1.一种万能供肝的制备方法，包括如下步骤(1)检测待移植肝脏的血型抗原类型，(2)对不同血型抗原类型的待移植肝脏做血型抗原转化处理，操作方法如下对A型肝脏采用保存液I在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对 B型肝脏采用保存液II在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对AB型肝脏同时采用保存液I和保存液II在15°C经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上，其中所述的保存液I由3000mlHTK液加入60mg α -N-乙酰基半乳糖苷酶制成，所述的保存液II由3000mlHTK液加入5mg α -半乳糖苷酶制成，(3)检测血型抗原转化处理后的肝脏，得到血型抗原为0型的万能供肝。
2.根据权利要求1所述的一种万能供肝的制备方法，其特征在于，所述的待移植肝脏做血型抗原转化处理前采用肾保存液在15°C下做冲洗预处理。
3.根据权利要求1所述的一种万能供肝的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中持续灌注5个小时以上。
全文摘要
本发明属于临床医学研究领域，具体涉及一种万能供肝的制备方法，包括对A型肝脏采用保存液Ⅰ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对B型肝脏采用保存液Ⅱ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上；对AB型肝脏同时采用保存液Ⅰ和保存液Ⅱ在15℃经肝动脉、门静脉、胆总管持续灌注数小时以上，其中所述的保存液Ⅰ由3000mlHTK液加入60mgα-N-乙酰基半乳糖苷酶制成，所述的保存液Ⅱ由3000mlHTK液加入5mgα-半乳糖苷酶制成，得到血型抗原为O型的万能供肝。本发明有效解决了ABO血型不相容的肝脏移植等问题。
文档编号A61F2/02GK102274088SQ20111012122
公开日2011年12月14日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者杨富春, 郑树森 申请人:浙江大学