专利名称：龙血竭及其黄酮类化学成分作为辣椒素受体trpv1的拮抗剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药理学和生物学领域，具体是一种龙血竭及其黄酮 类化学成分作为辣椒素受体TRPVl的拮抗剂的应用。
背景技术：
目前的镇痛药主要有阿片类和非阿片类两类。典型的阿片类镇痛药如吗啡、可待因、美沙酮等，尽管使用历史悠久，但迄今其镇痛机制尚未完全阐明，而且长时间使用可产生依赖性、成瘾性等缺点，在临床上限制了使用。非阿片类镇痛药又以非留体抗炎类、苯胺类、水杨酸类为主，这类药物多为前列腺素合成酶的抑制剂，主要作用于疼痛部位的神经末梢，但由于其镇痛效应不佳，并有明显毒副作用而使其使用受到限制。因此从已被证实具有良好镇痛临床效果的传统药物中寻找具有安全高效、不致造成依赖成瘾，且毒副作用低的新型镇痛药是目前研究人员面临的主要问题。龙血竭是传统药物傣药中的一味常用药材，具有活血化瘀、祛腐生肌、止血收敛、 消肿止痛等功效，被誉为“活血圣药”(王智民，中药药效物质基础的系统研究是中药现代化的关键，中国中药杂志，2003,28(12) :1111-1113)。目前国内外学者对血竭的关注逐渐集中在其镇痛作用方面。运用巴豆油、角叉菜胶致炎、小鼠扭体反应等药理学实验，发现龙血竭外擦能明显抑制巴豆引起的小鼠耳壳炎症、大鼠角叉菜胶性足肿胀，降低小鼠腹腔毛细血管通透性，减少小鼠扭体反应次数，抑制在体大鼠子宫平滑肌收缩作用。上述现象都表明有明显的抗炎、镇痛作用(曾雪瑜等，广西血竭的消炎止痛作用及毒性研究.，中国中药杂志，1999，24(3) :171-173)。通过动物实验研究发现，龙血竭能有效抑制二甲苯所致的鼠耳炎症、家兔烫伤炎症，而对蛋清性关节炎无明显拮抗作用(向金莲等，血竭消炎止痛作用研究，时珍国医国药，2001，12(2) :110-lll)o发现龙血竭对二甲苯致炎部位和腹腔注射醋酸后腹腔液PGE2的释放均有明显的抑制作用(谢文等，酸化对血竭中血竭素含量测定的影响，中草药，2000，31 (4) :265)。上述结果说明龙血竭对化学致炎剂引起的炎症反应有抑制作用，起到镇痛作用。国内多数学者认为，龙血竭的这种镇痛作用机理，与其抗菌消炎、改善局部微循环、改善机体的免役功能有关。临床疗效观察也证实其在治疗痔疮、痛经、溃疡以及急性软组织损伤等疾病时表现出较好的镇痛效果，急性和慢性毒理学实验则表明龙血竭毒性很低。因而龙血竭中产生镇痛效应的化学成分极具开发成一种安全有效、成瘾性低的以血竭总黄酮为先导化合物的新型镇痛药物的潜能。然而目前龙血竭产生镇痛作用的药理机制和它的哪些成分产生效应尚不清楚。龙血竭化学成分复杂，药理作用又具有多靶点、多层次等特点，化学成分间还可能由于物理和化学等方面的原因在药理效应上存在着相互作用(协同或拮抗)。亦不可能将龙血竭的所有化学成分一一提取分离，巨细无遗地研究这些化学成分及其组合的药理作用。这些都极大的限制了龙血竭的研究开发工作。最近的研究中，已有证据表明龙血竭对初级感觉神经元电压门控性钠通道电流具有调制作用(刘向明，陈素，张玉霞，张凡，血竭对背根神经节细胞河豚毒素不敏感型钠电流的调制及其药效物质的确定，中国科学C辑生命科学2006，36 (1) 76-85)，并证实了其药效物质基础为从龙血竭中提纯的黄酮类化学成分剑叶龙血素A(化学名为4'-羟基-2， 6- 二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B (化学名为6-羟基-7-甲氧基-3- (4 ‘-羟苄基) 色原烷)和龙血素B (化学名为4 ‘-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)(卢文杰等，剑叶龙血树氯仿部位化学成分的研究，药学学报，1998， 10)3种成分的组合。这说明龙血竭能够通过其3种成分的组合调制钠通道，干预痛觉信息传导，产生镇痛作用。但是钠通道除了能够传导痛觉外，其它感觉也能通过其进行传递，因此在疼痛发生机制中的特异性不强。TRPVl是1997年报道克隆成功的TRPV亚家族的通道蛋白 (Caterina 等，1997，Nature 389，816-824)，被称为辣椒素受体(Capsaicin receptor), I型香草酸受体(Vanilloidrec印tor subtype 1，VRl)，是目前TRP家族各成员中研究最多的一个亚型，在神经支配皮肤、内脏、外周组织和脊髓的感觉神经上均有发现。已有资料提示，它的过度表达或激动可致热痛觉过敏、异常性疼痛、偏头痛、牙痛、外阴痛、疼痛性胃肠病，参与食管炎、结肠炎、胰腺炎、膀胱炎和膀胱反应性增高、骨关节炎等病理过程。已知对于TRPVl缺失小鼠，不仅由辣椒素引起的疼痛反应消失，而且炎症时的痛觉过敏也减弱 (Nature 405 183-187，2000)。TRPVl的拮抗药可通过抑制TRPVl的活化而表现镇痛作用， 如TRPVl拮抗药辣椒平，在动物模型中对神经性疼痛、炎症性疼痛有效(J. Pharmacol. Exp. Ther. 304 =56-62,2003)。另外，在TRPVl敲除小鼠中，已经观察到改变的膀胱功能，非排泄性膀胱收缩和膀胱容量增加(Birder等人，Nat. Neurosci. 5. 856-860，2002)。因此暗示了调节TRPVl活性的药物不仅在疼痛状态和炎症相关疾病中具有实用性，而且在涉及原发性感觉纤维过度活动的疾病(例如膀胱过度活动症和急迫性尿失禁)中具有实用性。如在中国专利CN101796036A中已经公开了作为TRPVl受体调节剂的5-苯基异噁唑-3-甲酰胺衍生物并可用于治疗由TRPVl介导的病症，诸如急性和慢性疼痛病症，急性和慢性神经性疼痛，急性和慢性炎性疼痛，呼吸系统疾病和下尿路病症。目前已证实从龙血竭中提取的龙血素B可以明显抑制辣椒素诱发的辣椒素受体电流(王灿，陈素，刘向明.龙血素B抑制大鼠背根神经节细胞辣椒素诱发的电流反应.中国药理学通报，2007Feb ;23(2) :211_214)。从龙血竭中提取的剑叶龙血素B也可抑制辣椒素诱发的电流(Song-tao Wang,Su Chen,Min Guo,Xiang-ming Liu. Inhibitory effect of cochinchinenin B on capsaicin-activated responses in rat dorsal root ganglion neurons, Brain Research. 1201 (2008) 34-40)。同为龙血竭调制钠通道药效物质的剑叶龙血素A对TRPVl受体的调制作用则尚未见报道。而且，龙血素B、剑叶龙血素B单独作用于 TRPVl受体的IC50均较高，直接用于药用的可能性不大。因此，需要更深入的研究龙血竭对TRPVl受体的调节作用，并确定其作用的有效成分或组合，降低其药用浓度，用于作为治疗由TRPVl介导的病症的有效药物。
发明内容
本发明提供一种龙血竭及其黄酮类化学成分作为辣椒素受体TRPVl的拮抗剂的应用及其在制备治疗与TRPVl相关的疾病的药物中的应用，可以作为伤害感受性疼痛、神经性疼痛、癌性疼痛、头痛、膀胱功能障碍、炎症等与TRPVl相关的疾病的良好的治疗或预防药。
龙血竭及其黄酮类化学成分作为辣椒素受体TRPVl的拮抗剂的应用，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合，剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基_2，6- 二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素B的化学名为6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘ _羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为4'-羟基-2，4， 6-三甲氧基双氢查耳酮。龙血竭及其黄酮类化学成分在制备治疗与TRPVl受体相关的疾病的药物中的应用，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B 中至少两种的混合，剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基-2，6- 二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素B的化学名为6-羟基-7-甲氧基-3-(4'-羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为 4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮。一种药用组合物，包括龙血竭、龙血竭的黄酮类化学成分、龙血竭或其黄酮类化学成分在药学上容许的盐或组合、龙血竭或其黄酮类化学成分在药学上容许的载体组合，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合，剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基_2，6-二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素 B的化学名为6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘ _羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮。本发明的效果见如下实验例材料的获取和处置龙血竭、提取自龙血竭的剑叶龙血素A(化学名为4'-羟基-2，6- 二甲氧基双氢查耳酮)、剑叶龙血素B (化学名为6-羟基-7-甲氧基-3- (4'-羟苄基)色原烷)和龙血素B(化学名为4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮)，纯度 ^98% (广西中医药研究所提供)，按需配成适宜的浓度和不同的组合物。辣椒素，HEPES， EGTA均为Sigma公司产品，其他未予注明的为国产分析纯。主要仪器EPC_9双通道膜片钳放大器(HEKE公司，Germany)、玻璃微电极拉制仪 (ΡΙΡδ,ΗΕΚΕ公司，Germany)、DAD给药系统(ALA公司，USA)、精密三维微操纵仪(PCS-5200， Burleigh 公司，USA)、倒置显微镜(OLYMPUS 公司，Japan)。急性分离大鼠背根神经节(DRG)细胞的制备背根神经节细胞是哺乳类和人类的外周神经系统主要传入神经元，表达了多种TRP受体通道蛋白，在神经保护、神经损伤后修复、伤害性刺激传导、病理发生发展和生理性过程中起重要作用。实验对象为一月龄Wistar 大鼠，体重IOOg左右，性别不限。大鼠断颈后，迅速剪开背部皮肤，取胸腰段脊柱然后浸在充氧的DMEM培养液中，沿脊柱从正中剖成两半，用游丝镊取出背根神经节后剪去周围多余的组织，经充分剪碎置于含胶原酶0. 6mg/ml和胰蛋白酶0. 3mg/ml的DMEM培养液中，用尖端热处理过的吸管轻轻吹打数十下放入35. 5°C的恒温水浴箱中消化约15min，然后加入 0.9mg/ml的抑制剂终止消化。将消化得到的细胞悬液经200目筛网过滤到直径为35mm的培养皿中静置30min使细胞贴壁，更换外液两次，每15min更换一次，然后可进行全细胞膜片钳记录。全细胞膜片钳记录用细胞外液成分为(mmol/L) =NaCl 145. 0，HEPES 10.0， D-Glucose 11. 0，KCl 5. 0，CaC122. 0，MgC121. 0 用 Imol/LNaOH 调 PH 值到 7· 4。细胞内液成分为(mmol/L) :KC1 140. 0，EGTA10. 0，HEPES 10. 0，Na2ATP 9. 7，CaC121. 0，MgC122. 0，用lmol/L KOH调PH值到7. 3。辣椒素先用100%无水乙醇配制成lOmmol/L的辣椒素干液， 龙血竭先用二甲亚砜溶解，配制成千分之五的干液，剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B 则先用二甲亚砜溶解，配制成lOmmol/L的干液。实验时用上述细胞外液稀释成实验所需浓度的辣椒素溶液及药品溶液。采用EPC-9双通道膜片钳放大器于室温下进行全细胞膜片钳记录。电极用1. 4mm 内径的玻璃毛胚管由PIP5拉制仪拉制而成，入水电极电阻为3 5ΜΩ。数据采集和刺激的施加由Pulse软件控制，数据的AD/DA转换由Digidata 1200完成。实验选取中小型的胞体晶亮的DRG细胞记录，因为中小型的细胞上含较多的辣椒素受体。在细胞的电极之间的封接达到G欧后，给予快电容补偿，然后撤销正压并给予一定的负压吸破细胞形成全细胞记录状态，给予慢电容补偿。在电压钳记录时，钳制电位固定在_60mV。药物通过DAD给药系统施加。实验资料采用pulsefitS. 02软件进行分析处理，实验数据以〒士SE表示。考虑到不同细胞所引导出的电流差异较大，故将给药前后的电流峰值Imax作为计算依据，按照公
给药前I -给药后I
$ —给；前工一~^xl00%①掀難W娜_ Imax _飢匕测軋由如下实验更具体地解释本发明的有益效果实验一龙血竭对辣椒素受体TRPVl的抑制作用使用急性分离大鼠背根神经节细胞，在固定电压下，进行全细胞膜片钳记录，通过将辣椒素(lymol/L)施用于细胞附近局部，从而测定诱发的电流应答。将血竭溶于细胞外液作为测试试剂。以不存在测试试剂情况下的辣椒素电流应答为100%，施用不同浓度血竭试剂，测定各浓度的抑制率。结果显示龙血竭对辣椒素受体TRPVl有良好的抑制作用，具体结果请参见表1。表1 龙血竭对辣椒素受体TRPVl的抑制作用
权利要求
1.龙血竭及其黄酮类化学成分作为辣椒素受体TRPVl的拮抗剂的应用，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合， 剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素B的化学名为 6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘-羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮。
2.龙血竭及其黄酮类化学成分在制备治疗与TRPVl受体相关的疾病的药物中的应用， 其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合，剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素B的化学名为6-羟基-7-甲氧基-3- (4 ’ -羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为 4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮。
3.如权利要求2所述的龙血竭及其黄酮类化学成分在制备治疗与TRPVl受体相关的疾病的药物中的应用，其特征在于所述与TRPVl受体相关的疾病包括伤害感受性疼痛、神经原性疼痛、癌性疼痛、头痛、膀胱功能障碍、炎症。
4.一种药用组合物，包括龙血竭、龙血竭的黄酮类化学成分、龙血竭或其黄酮类化学成分在药学上容许的盐或组合、龙血竭或其黄酮类化学成分在药学上容许的载体组合，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合，剑叶龙血素A的化学名为4'-羟基-2，6-二甲氧基双氢查耳酮，剑叶龙血素B 的化学名为6-羟基-7-甲氧基-3-(4‘ _羟苄基)色原烷，龙血素B的化学名为4'-羟基-2，4，6-三甲氧基双氢查耳酮。
5.如权利要求4所述的药用组合物，其特征在于所述载体包括稀释剂、粘合剂、吸收齐 、崩解剂、分散剂、湿润剂、助溶剂、缓冲剂或表面活化剂。
6.如权利要求4或5所述的药用组合物，其特征在于所述药用组合物为口服、注射或外用的制剂。
全文摘要
本发明涉及龙血竭及其黄酮类化学成分作为辣椒素受体TRPV1的拮抗剂的应用及在制备治疗与TRPV1受体相关的疾病的药物中的应用，其中所述黄酮类化学成分为剑叶龙血素A或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B、龙血素B中至少两种的混合。本发明还涉及一种包括龙血竭及其黄酮类化学成分的药用组合物。龙血竭、剑叶龙血素A的单独组分或者剑叶龙血素A、剑叶龙血素B和龙血素B的两两组合或同时含有三种成分的组合具有很强的辣椒素受体TRPV1活化抑制作用以及基于此效果的良好的药理作用，因而其作为活性成分可用于与TRPV1相关疾病如伤害感受性疼痛、神经原性疼痛、癌性疼痛、头痛、膀胱功能障碍、炎症等的治疗或预防药物。
文档编号A61K36/889GK102406787SQ201110122228
公开日2012年4月11日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刘向明, 梅之南, 沈州, 维力斯, 陈素 申请人:中南民族大学