专利名称：建立斑马鱼血栓模型的方法及筛选抗栓/致栓药物的方法
技术领域：
本发明属于药物筛选(评价)领域，具体涉及一种简便、经济、快速、高效、高通量的斑马鱼血栓模型的建立方法，并且利用该动物模型筛选抗血栓药物和评价药物的致血栓性。
背景技术：
血栓性疾病是一种血管内腔狭窄与闭塞引发的常见心脑血管病。血栓形成是造成脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化等致残和致死率高的心脑血管疾病的主要病理基础。动脉血栓形成初期主要由血管内皮受损，血小板黏附和聚集所致，而静脉血栓一般由血流缓慢或瘀滞引起[1]。随着人类生活环境和膳食习惯的变化，心、脑血管病的发病率和死亡率正逐年增高。据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年平均有1700万人被心脑血管病夺走生命，占了世界总死亡人数的30%。我国是脑卒中高发病率国家，每年由高血压引致的脑血栓多达120 万人，存活者中有75%的患者因病致残，40%以上为重度致残。据《2009-2010年中国抗血栓药市场研究分析预测报告》指出，抗血栓药物是年销售额数十亿美元的大市场，预计到2015全球新颖抗血栓药物创造的市场总价值将达到100亿美元左右。德国拜尔和法国赛诺菲-安万特引领抗血栓药物的市场，拜尔新药 Rivaroxaban在2008年面市，成为凝血因子抑制剂类的第一新药[2]。百时美施贵宝公司销售的华法林(warfarin，Coumadin) 以及赛诺菲安万特公司的氯吡格雷(clopidogrel， Plavix)是目前最畅销的两种抗血栓药物。华法林是一种口服抗凝剂，由DuPont公司(目前的百时美施贵宝公司)于20世纪40年代在美国上市。但是，华法林的使用剂量不当很可能引起过度抗凝及抗凝不足，分别表现为出血风险的提高及血栓形成风险的提高M。Plavix 能够预防曾发生过缺血性中风，血管栓塞，心梗发作或已有外周血管疾病的患者出现动脉粥样硬化。Plavix的缺点在于疗效不大。Lovenox (enoxaparin)也是由赛诺菲安万特推出，该药在全球抗栓药物中占据着很重要的地位。Pletaal (cilostazo)属于磷酸二酯酶抑制剂，具有抗血小板凝集及扩张血管作用，主要用于治疗间歇性跛行；该药也在巴西获批用于预防中风，在日本上市用于治疗复发性脑梗塞。专家认为，近年来临床在血栓治疗上取得的实质性进展很小，在这方面，备受关注的当属阿斯利康公司的血栓因子靶向抑制剂 Exanta (ximelagatran)。Exanta已在许多欧盟国家上市用于大型整形术中静脉血栓形成的短期预防，但FDA因安全性及疗效问题对该药的推迟批准使得分析人士认为其上市后未必会一帆风顺。抗血栓药物市场的潜力是巨大的，谁填补了这个空白无疑将获得巨大的利润回报。药物筛选是发现、开发药物过程中一个重要的环节，实验动物血栓模型的建立对评价与筛选抗血栓药物至关重要。目前建立血栓模型的方法主要有(1)体外血栓形成法 该法由Chandler提出，系在体外旋转圆环内模拟体内的血流状态以形成血栓[5] ； (2)半体内血栓形成法血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时，发生黏附、聚集，血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓[6] ； (3)机械损伤法机械损伤血管内膜后，使内皮细胞外基质裸露，促使血小板与胶原接触而被激活和黏附，启动凝血过程，导致血栓形成[7] ;(4)电流损伤法利用电刺激，破坏局部血管，使血管内膜损伤，促使血小板黏附聚集从而形成血栓[8] ； (5)动脉异物法动脉管腔狭窄形成湍流以及异物的诱导，均可激活血小板，使其黏附性和聚集性增加，血小板黏附于受损内膜下的胶原和异物，激活凝血途径形成血栓[9]； (6)结扎法该法常用于制备下腔静脉血栓模型，静脉结扎后，引起局部血流瘀滞、低氧，导致血管内皮损伤，启动凝血系统，从而导致静脉血栓形成[1°] ;(7)光化学法将光敏物质引入机体后在特定波长光线的照射下，发生光化学反应而产生单线态氧等活性氧，继而损伤血管内皮细胞，激发血小板聚集而形成血栓[11]。研究表明以上的一些方法虽然是经典的血栓模型的制备方法，但有很多的弊端和局限性[12_15]。体外血栓形成法和半体内血栓形成法所需费用较低，但缺少了生物整体的循环转换和药物在体内的循环分布，不能真正反映药物的整体生物活性。机械损伤法对动物创伤大且实验操作复杂[13]。结扎法建立的血栓模型可靠，效果较为满意且可用于各种动物，但造模的手术操作过程繁琐，对动物创伤较大，且静脉血管很薄，在操作中易损伤而引发大出血[14]。光化学法、电流损伤法制作方法复杂，技术要求高，造价昂贵。动脉异物法需从颈部入路，手术创伤大，对动物生理指标影响不可忽视[13]。这些方法均较为复杂，不易控制血栓形成的程度，且与人类血栓形成的病理过程相距较远。常用于血栓模型研究的动物有犬、猪、兔、大鼠等。大鼠由于血管较细，动脉插管困难而较少运用。犬、猪在技术操作上显然不存在此问题，但往往受场地、经费等限制不宜大量饲养，从而影响研究中多组设计，给研究带来不利[16]。兔的抵抗力差，造模周期过长(一般需要8周以上)，易导致兔的继发性感染死亡从而影响实验的稳定性。这些动物模型均存在造模操作复杂、技术要求高、手术创伤大、血栓形成发生率低、并发症和死亡率高、模型建立不稳定、可重复性差等缺点[17_19]，不利于后续抗血栓药物的评价与筛选工作，且实验周期长、费用高、工作量大。近年来化学药物诱导血栓形成法被广泛应用，其原理是利用化学物质损伤血管内膜，促进血小板黏附、聚集和促进血管活性物质的释放，形成闭塞性血栓_]。这是一种原位血栓形成的方法，能较好地模拟人类血栓形成的发病过程，为抗血栓药物的评价与筛选工作提供了较好的途径。Kuzz等[21]首次报道了 FeCl3S导的大鼠颈总动脉血栓形成模型，实验结果显示这种模型可靠、形成简便、快捷，血栓模型成功率100%，而且可以控制血栓形成的程度。但是该动物模型技术要求高、手术创伤大、并发症和死亡率高、容易弓I起血管痉挛
AjV [22] 寸O为评价与筛选抗血栓药物，首先必须建立一种比较理想的动物血栓模型。本发明利用化学药物苯胼诱导活体斑马鱼血栓模型。苯胼能够损伤血管内膜，促进血小板黏附、 聚集及血管活性物质的释放to]。斑马鱼具有凝血因子、血小板受体，已经应用于血小板功能与血栓形成的遗传实验研究to_26]。与传统的体内和体外筛选模型相较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、成本高的弊端。与线虫、果蝇相比，斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因高度相似，经英国专家的基因预测发现，斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85% 左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[27]。更重要的是，斑马鱼具有与生俱来的优点[27_2 " 1)饲养成本低，性成熟周期短；2)繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产 200 300枚卵；3)生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；4)胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；5)胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食， 可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；6)胚胎很小，幼鱼体长只有1-4 mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；7)给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的血栓模型的研究材料。目前利用斑马鱼研究血栓的报道很少，并且大多集中在对与血栓形成相关的因子进行遗传学分析方面β9_31]。Gregory等[23]首先用FeCl3和激光照射处理斑马鱼诱导血栓形成，然后采用两种筛选策略检测与血栓形成相关的新基因，最后对与血栓形成相关的基因进行了遗传学分析。该研究经FeCl3和激光照射诱导形成的血栓分析过程复杂，细胞离体后缺少了生物整体的代谢循环转换和体内的循环分布，不能真正反映整体生物活性。值得一提的是，该篇文章中也尝试用苯胼诱导斑马鱼血栓，但并未成功，失败可能与作者选用斑马鱼发育阶段、处理时间及化合物剂量不当等有关。与该研究相比，我们利用苯胼诱导血栓模型的过程中对斑马鱼发育阶段、处理时间及化合物剂量进行了广泛优化。该项研究同时申请了公开号分别为US2005/0120392A1和US2005/0M4808A1两项发明专利，专利写作中只提到利用FeCl3和激光照射诱导血栓模型，并未涉及苯胼。该研究血栓分析方法虽然有效，但所需费用较高、实验周期较长、生物学功能较差、相对纯度较低、难以避免非特异性影响，从而产生假阳性或假阴性结果。Jagadeeswaran 等[32]首先建立了斑马鱼止血 (hemostasis)模型，然后采用一系列的方法分离止血突变体，同时提供了研究止血模型的基因敲除术。该项研究属分子水平方面，同样缺少了生物整体的循环转换和药物在体内的循环分布，且实验操作复杂，实验周期长，实验费用高，并不适合抗血栓药物的筛选。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺点和不足，本发明的目的首先在于提供一种建立斑马鱼血栓模型的方法。第二个目的提供一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，可以简便、快速、高效和高通量实现对抗血栓药物的抗血栓性的定性或/和定量评价或者对致栓药物的致栓性的定性或/和定量评价。为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案 发明概述
发明人首先提供了一种建立斑马鱼血栓模型的方法，包括下述步骤
(1)斑马鱼选取
选取受精后2-4天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；
(2)化合物处理
移除微孔板中的养殖用水，然后按照血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于下恒温培养M-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯胼溶液，溶剂为浓度为0. 1%的酒精，
(3)荧光显微镜定性分析或/和定量分析。作为优选，根据本发明所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其中，所述的养殖用水符合下述规格溶解氧质量容量浓度为6-8mg/L，水温为，pH为7. 2-7. 6，总硬度为 200-250mg/Lo作为优选，根据本发明所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其中，所述的荧光显微镜定性分析按照下述方法操作
移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0. 64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上，接着置于荧光显微镜下观察斑马鱼尾静脉血栓形成情况。作为优选，根据本发明所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其中，所述的定量分析按下述步骤操作
移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入邻联茴香胺染色液，然后将微孔板置于恒温培养10-15min ；接着移除染色液，用DMSO (二甲基亚砜)快速清洗数遍，将斑马鱼转入新的微孔板中，根据微孔板规格加入DMSO ；再将斑马鱼侧位放置于双凹载玻片上，最后置于荧光显微镜下对心脏部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算心脏红细胞染色强度，血栓形成率计算公式如下
权利要求
1.一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的方法包括下述步骤(1)斑马鱼选取选取受精后2-4天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；(2)化合物处理移除微孔板中的养殖用水，然后按照血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于下恒温培养M-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯胼溶液，溶剂为浓度为0. 1%的酒精，(3)荧光显微镜定性分析或/和定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的荧光显微镜定性分析按照下述方法操作移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0. 64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上，接着置于荧光显微镜下观察斑马鱼尾静脉血栓形成情况。
3.根据权利要求1所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的定量分析按下述步骤操作移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入邻联茴香胺染色液，然后将微孔板置于恒温培养10-15min ；接着移除染色液，用DMSO快速清洗数遍，将斑马鱼转入新的微孔板中，根据微孔板规格加入DMSO ；再将斑马鱼侧位放置于双凹载玻片上，最后置于荧光显微镜下对心脏部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算心脏红细胞染色强度，血栓形成率计算公式如下
4.根据权利要求3所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的邻联茴香胺染色液组成为含0. 6mg/mL邻联茴香胺、0. OlM醋酸钠、0. 65%H202、40%酒精。
5.一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的方法包括下述步骤(1)斑马鱼选取选取受精后2-4天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；(2)化合物处理A方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物组合处理组、血栓模型组、阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液 +0. 1-1000 μ M待测化合物溶液、血栓诱导剂溶液、血栓诱导剂溶液+0. 1-1000 μ M抗血栓药物溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于下恒温培养M-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯胼溶液，溶剂为浓度为0. 1%的酒精，或者B方案移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物处理组、血栓形成阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的0. 1-1000μΜ待测化合物溶液、血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于下恒温培养M-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯胼溶液，溶剂为浓度为0. 1%的酒精，(3)荧光显微镜定性分析或/和定量分析。
6.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的A方案中待测化合物组合处理组的加入采用同时添加的方式或者加入血栓诱导剂苯胼6_24h后再加入待测化合物溶液的方式或者加入待测化合物溶液6-24h后再加入血栓诱导剂。
7.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的荧光显微镜定性分析按照下述方法操作移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0. 64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上，接着置于荧光显微镜下观察斑马鱼尾静脉血栓形成情况。
8.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的步骤(2)化合物处理采用A方案后，步骤(3)定量分析按下述方法操作移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入邻联茴香胺染色液，然后将微孔板置于恒温培养10-15min ；接着移除染色液，用DMSO快速清洗数遍，将斑马鱼转入新的微孔板中，根据微孔板规格加入DMSO ；再将斑马鱼侧位放置于双凹载玻片上，最后置于荧光显微镜下对心脏部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算心脏红细胞染色强度，抗血栓药效计算公式如下
9.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的步骤(2)化合物处理采用B方案后，步骤(3)定量分析按下述方法操作
10.根据权利要求8或9所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的邻联茴香胺染色液组成为含0. 6mg/mL邻联茴香胺、0. OlM醋酸钠、 0. 65%H202、40% 酒精。
全文摘要
本发明涉及本发明属于药物筛选领域，具体涉及一种斑马鱼血栓模型的建立方法，包括(1)斑马鱼选取；(2)化合物处理移除微孔板中的养殖用水，然后按照血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于28℃下恒温培养24-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯肼溶液，溶剂为浓度为0.1%的酒精，(3)荧光显微镜定性分析或/和定量分析。本发明还提供了一种建立斑马鱼血栓模型筛选药物的方法。本发明的方法具有简便、快速、高效和高通量的特点。
文档编号A61K31/15GK102266313SQ20111012642
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者朱晓宇, 李春启 申请人:杭州环特生物科技有限公司