专利名称：一种丝素蛋白管状支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种丝素蛋白管状支架及其制备方法。
背景技术：
人工神经导管、人工胆管、人工血管、人工肾管等移植物已成为临床迫切需求的材料。以人工血管为例，心血管疾病已经成为人类的头号杀手，严重威胁着人类身体健康。近年来，随着血管外科技术及生物支架材料的快速发展，人工血管等管状支架材料在血管外科治疗中有着不可替代的作用，是目前生物医用材料及临床最迫切需求的材料。目前医学上应用的人工血管产品主要由涤纶、聚氨酯纤维和膨体聚四氟乙烯材料制成，上述三种支架材料在研发大中口径人工血管方面具有极广的应用。但是，聚氨酯材料容易形成血栓，远期通畅效率较差。膨体聚四氟乙烯材料柔软性差，疏水性强，影响组织愈合。上述三类支架材料的组织相容性及与组织修复匹配性有待提高。为了提高人工血管的组织相容性和组织修复匹配性，现有技术有采用家蚕丝素蛋白制作管状支架。家蚕丝素是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，丝素蛋白即丝芯蛋白，是蚕丝的主要组成部分，约占蚕丝质量的70% 80%，其余为丝胶蛋白和少量的茧丝蜡、灰分、碳水化合物等。将蚕丝进行脱胶处理后可得到丝素蛋白。家蚕丝素蛋白由重链(H链，分子量350kDa)、轻链(L链、分子量^kDa)和糖蛋白组P25组成(分子量30kDa)组成的复合体。其中，H链由12段富含-(Gly-X)η-的重复序列和11个氨基酸基本相同的42 43氨基酸残基的非重复序列间隔排列而成。丝素蛋白以反平行折叠链构象(β-sheet)为基础，形成直径大约为IOnm的微纤维，无数微纤维密切结合组成细纤维，大约100根细纤维沿长轴排列构成直径大约为ΙΟμπι 18μπι的单纤维， 2根单纤维组合形成1根茧丝丝素纤维。丝素蛋白独特的微结构赋予丝素纤维优越的力学性能。丝素蛋白除了具有上述独特的一级结构和微纤维结构外，重要的是其还具有良好的生物相容性。丝素蛋白由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应。已有大量的文献研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，在抗凝血性方面也有较多的研究，在药物释放载体、生物传感器、人工韧带、人工肌腱、隐形眼睛、人工皮肤等方面的研究取得了突破性的进展，用于组织工程材料研究已越来越深入。国内外许多文献曾报道了家蚕丝素蛋白管状支架的制备方法，例如美国Kaplan 研究组将丝素溶液直接成型为管状、静电纺或静电喷射形成管状材料再冷冻干燥制作小 口径血管修复材料(Biomaterials2007(28) :5271-5279 ；Biomaterials2008 (29) 4650-4657 ；Biomaterials2008(29) :2217-2227 ；Biomaterials 2009(30) :3213-3223)。 又如采用静电纺方法制备了丝素蛋白单层管状材料(International Journal of Biological Macromolecules 2009(45) :504-510)，但按照上述方法制备的丝素蛋白支架材料力学性能均较低，由此也限制其应用空间。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种力学性能较好的丝素蛋白管状支架及其制备方法。有鉴于此，本发明首先提供一种丝素蛋白管状支架的制备方法，包括将家蚕熟丝线编织成管状编织物；将家蚕生丝依次进行脱胶、透析，得到丝素蛋白溶液；将所述管状编织物、丝素蛋白溶液和胶黏剂置于管状模具中，将管状模具在-80°C -20°C冷冻后取出，得到依次包括外层丝素蛋白膜、芯层编织物和内层丝素蛋白膜的丝素蛋白管状支架。优选的，所述脱胶处理具体为使用碳酸钠溶液处理家蚕生丝1 3次，处理温度为95°C 100°C ；将碳酸钠溶液处理过的生丝依次进行水洗，拉松，干燥，得到家蚕丝素纤维。优选的，所述透析具体为将脱胶后的蚕丝用氯化钙-乙醇溶液进行溶解后使用截留分子量为3kDa 20kDa 的半透膜在水中进行透析。优选的，所述胶黏剂与丝素蛋白溶液的质量比为0.2 2 1。优选的，所述胶黏剂为多元醇或多元醇缩水醚。相应的，本发明还提供一种丝素蛋白管状支架，包括依次设置的外层、芯层和内层，所述外层和内层均为丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜包括交联丝素蛋白和胶黏剂；芯层为家蚕熟丝线管状编织物。优选的，所述胶黏剂为多元醇或多元醇缩水醚。优选的，其口径为 10_。优选的，其管壁厚度为0. 4mm 1mm。优选的，其折内径为5mm 7mm。本发明提供一种丝素蛋白管状支架的制备方法，该方法是将家蚕丝熟丝线编织成管状编织物，然后制备丝素蛋白溶液，最后将上述管状编织物、丝素蛋白溶液和胶黏剂置于管状模具内冷冻，得到依次包括外层、芯层和内层的管状支架。该管状支架芯层为家蚕熟丝线的编织物，具有较好的力学性能和组织相容性；外层和内层为交联丝素蛋白，具有较好的细胞相容性和降解性能，其多孔结构还更加适合细胞的粘附、生长及营养等的传递。因此， 按照本方法制得的管状支架具有优异的生物相容性和力学性能，适合用作人工血管、神经导管等。
图1为实施例1制得的管状支架的剖面扫描电镜图；图2为实施例1制得的管状支架内表面的扫描电镜图。
具体实施例方式为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明实施例公开了一种丝素蛋白管状支架的制备方法，包括将家蚕熟丝线编织成管状编织物；将家蚕生丝依次进行脱胶、透析和纯化后得到丝素蛋白溶液；将管状编织物、丝素蛋白溶液和胶黏剂置于模具中，将管状模具在-80°C -20°C 冷冻后取出，得到依次包括外层丝素蛋白膜、芯层编织物和内层丝素蛋白膜的丝素蛋白管状支架。按照上述制得的丝素蛋白管状支架包括依次设置的外层、芯层和内层，外层和内层均为丝素蛋白膜，芯层为家蚕熟丝线的编织物。其中，芯层是整个管状支架的骨架，蚕丝熟丝线是若干根丝素纤维加捻后形成的丝线，再将蚕丝熟丝线编织后形成支架的芯层结构，其力学性能优异，具有较高的断裂强度和断裂伸长率，由此赋予管状支架较为优异的力学性能。蚕丝熟丝线可以采用O 20) X 20/22、O 20) X 27/ 等组合，具体可以为将 2根20/22加捻成线A，3根20/22加捻成线B，再将A和B加捻成复合线，然后采用编织的方法获得管状编织。由上述方法制得的管状支架的外层和内层均为丝素蛋白膜，其是先将家蚕生丝依次进行脱胶、透析和纯化先制成丝素蛋白溶液，再向其中加入胶黏剂后于-80°C -20°C冷冻交联成型。丝素蛋白发生交联形成多孔网状结构，并由胶粘剂紧密粘合后附着于芯层表面形成丝素蛋白膜。丝素蛋白具有较好的生物相容性和降解性能，交联后形成的多孔结构给细胞粘附提供了适宜条件，因此以丝素蛋白膜作为管状支架的内外层符合血管内外膜组织结构的要求。丝素蛋白溶液的制备工序中，脱胶优选按照如下方式进行使用碳酸钠溶液处理家蚕生丝1 3次，处理温度为95°C 100°C ；将碳酸钠溶液处理过的生丝依次进行水洗， 拉松，干燥，得到家蚕丝素纤维。脱胶后丝素纤维进行溶解制得家蚕丝素蛋白溶液，然后将制得的蛋白溶液进行透析。透析是将家蚕丝素纤维溶解后使用半透膜对丝素蛋白溶液进行脱盐。优选将脱胶后蚕丝用氯化钙-乙醇溶液进行溶解后使用截留分子量为3kDa 20kDa的半透膜在水中进行透析，优选每隔2 4小时更换一次水，透析时间优选为3 5天。透析后便得到丝素蛋白水溶液。本发明还优选将丝素蛋白溶液的浓度调整为2. 5wt% 6. 0wt%，此种浓度范围制得的丝素蛋白支架成型好，且丝素蛋白易于均勻分散于芯层表面，进而形成厚度均勻的管状支架材料。由于丝素蛋白溶液后续需要经过冷冻处理，丝素蛋白溶液中若残留气泡，这些气泡则会在冷冻过程中会滞留在丝素蛋白膜中，影响丝素蛋白膜的性能。因此，本发明还优选将丝素蛋白溶液进行脱泡处理。脱泡可以按照本领域技术人员熟知的方法进行，本发明对此并无特别限制。按照上述方法制备好管状编织物和丝素蛋白溶液后，将管状编织物放入管状模具中，再向管状模具中注入上述丝素蛋白溶液和胶黏剂，使编织物浸于丝素蛋白溶液和胶黏剂中，然后将上述管状模具置于-80°C -20°C的环境中冷冻，丝素蛋白发生交联，形成多孔网络结构，胶黏剂将交联后的丝素蛋白紧密粘合，在芯层双面均形成多孔丝素蛋白膜。本发明优选选用多元醇或多元醇缩水醚等生物相容性较好的亲水性胶黏剂，更优选为甘油、聚乙二醇、二缩水甘油基乙醚等，最优选采用聚乙二醇二缩水甘油醚。对于浓度为 2. 5wt% 6. 的丝素蛋白溶液，胶黏剂与丝素蛋白溶液的重量比优选为0.2 2 1。冷冻交联处理后，为了去除未发生交联的丝素蛋白，还可使用去离子水对其进行洗涤，具体为，将管状支架从管状模具中取出后放入盛有去离子水的容器内，每隔3 4小时更换容器内的去离子水，持续4天。按照上述方法便可制得依次包括外层丝素蛋白膜、芯层编织物层和内层丝素蛋白膜的管状支架。该管状支架芯层为家蚕熟丝线的编织物，具有较好的力学性能和组织相容性；外层和内层为交联丝素蛋白，具有较好的细胞相容性和降解性能，其多孔结构还更加适合细胞的粘附、生长及营养等的传递。因此，按照本方法制得的管状支架具有优异的生物相容性和力学性能，适合用作人工血管、神经导管等。本发明还提供一种丝素蛋白管状支架，其包括依次设置的外层、芯层和内层，其中外层和内层均为丝素蛋白膜，芯层为家蚕熟丝线管状编织物。其中，丝素蛋白膜包括交联丝素蛋白和胶黏剂，胶黏剂优选多元醇及其缩水醚等生物相容性较好的亲水性胶黏剂，具体如甘油、聚乙二醇、二缩水甘油基乙醚等，更优选采用聚乙二醇二缩水甘油醚。上述丝素蛋白管状支架的口径优选为Imm 10mm，口径为Imm 6mm的管状支架适合用作如小口径的人工血管，口径为6mm IOmm的管状支架适合用作如中口径的人工血管。上述丝素蛋白管状支架管壁厚度优选为0. 4mm 1mm，以保证管内物质运输的通畅性。综合上述论述，该管状支架的芯层结构赋予该管状支架较好的力学性能、优异的组织相容性和可降解性；外层和内层的交联丝素蛋白赋予该管状支架较好的细胞相容性、 降解性能及细胞粘附性。因此，该管状支架具有优异的生物相容性和力学性能，适合用作人工血管、神经导管等。芯层管状编织物的口径可以为6mm 10mm，此种管状支架适合用作如中口径的人工血管等；芯层管状编织物的口径也可以小于6mm，此种管状骨架适合用作如小口径的人工血管或神经导管等。本发明还提供一种管状支架，包括依次设置的外层、芯层和内层，所述外层和内层均为丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜包括交联丝素蛋白和胶黏剂；芯层为家蚕熟丝线管状编织物，所述管状支架的弯折内径优选为5mm 7mm。由上述论述可知，本发明提供的管状支架具有较好的生物相容性和力学性能。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的管状支架及其制备方法进行描述。本发明的保护范围不受以下实施例的限制。以下实施例中的胶黏剂均是由美国 Sigma公司提供的聚乙二醇二缩水甘油醚。实施例11.将8X (20/22)熟丝线通过组合编织成内径为3mm的小口径管状编织物。2.将0. 2千克家蚕生丝放入10升浓度为0. 25g/L的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理三次，前两次用自来水，每次处理30分钟。第三次用去离子水，处理45分钟。然后用水将丝充分清洗干净，拉松，置于60°C烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。3.称取脱胶后的家蚕丝素10克溶解于IOOml的摩尔比1 2的氯化钙-乙醇的水溶液中，70°C溶解2小时得家蚕丝素溶解液。4.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3. 0 20. OkDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水，持续透析4天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为3wt%。5.将织成的管状织物装在管状模具上，向上述丝素蛋白溶液中加入等质量的胶黏剂混勻，再脱气泡后注入管状模具中，管状编织物浸于丝素蛋白溶液和胶黏剂中，将管状模具置于-20°C冷冻4小时。6.从冰箱取出管状模具摘下管状样品，置于盛有去离子水的容器内，每隔3小时更换新的去离子，持续4天后取出并风干，得到具有孔状结构的管状支架。如图1所示为本实施例制得的管状支架的剖面扫描电镜图，由图可知，该管状支架依次包括具有多孔结构的外层、芯层和具有多孔结构的内层；图2所示为本实施例制得的管状支架内表面的扫描电镜图。将本实施例制备的管状支架于去离子水中浸渍，充分吸湿取出，用滤纸吸去多余的水分，采用TG065C生物管状拉伸仪测得湿态时轴向断裂强度为95MPa，断裂伸长率为 80%。实施例21.将8X (20/22)熟丝线通过组合编织成内径为3mm的小口径管状编织物。2.将0. 2千克家蚕生丝放入10升浓度为0. 25g/L的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理三次。前两次使用的碳酸钠水溶液中的水为自来水，每次处理30分钟，第三次使用的碳酸钠水溶液中的水为去离子水，处理时间为45分钟。然后用去离子水将蚕丝充分清洗干净，拉松，置于60°C烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。3.称取脱胶后的家蚕丝素10克溶解于IOOml的摩尔比1 2的氯化钙-乙醇的水溶液中，70°C溶解2小时得家蚕丝素溶解液。4.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3. 0 20. OkDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水，持续透析4天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为#t%。5.将织成的管状织物装在管状模具上，向上述丝素蛋白溶液中加入等质量的胶黏剂混勻，再脱气泡后注入管状模具中，管状编织物浸于丝素蛋白溶液和胶黏剂中，将管状模具置于-40°C冷冻4小时。6.将管状模具从冰箱取出后摘下管状样品，置于盛有去离子水的容器内，每隔3 小时用新的去离子水更换容器内的水，持续4天后取出并风干，得到具有孔状结构的管状支架。采用TG065C生物管状拉伸仪测试本实施例制备的管状材料干态时力学性能，测得轴向断裂强度为llOMPa，断裂伸长率为100%。实施例31.将8X (20/22)熟丝线通过组合编织成内径为3mm的小口径管状编织物。2.将0. 2千克家蚕生丝放入10升浓度为0. 25g/L的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理三次。前两次使用的碳酸钠水溶液中的水为自来水，每次处理30分钟，第三次使用的碳酸钠水溶液中的水为去离子水，处理时间为45分钟。然后用去离子水将蚕丝充分清洗干净，拉松，置于60°C烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。3.称取脱胶后的家蚕丝素10克溶解于IOOml的摩尔比1 2的氯化钙-乙醇的水溶液中，70°C溶解2小时得家蚕丝素溶解液。4.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3. 0 20. OkDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水，持续透析4天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为5wt%。5.将织成的管状织物装在管状模具上，向上述丝素蛋白溶液中加入等质量的胶黏剂混勻，再脱气泡后注入管状模具中，管状编织物浸于丝素蛋白溶液和胶黏剂中，将管状模具置于-20°C冷冻4小时。6.将管状模具从冰箱取出后摘下管状样品，置于盛有去离子水的容器内，每隔 3 4小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续4天后取出并风干，得到具有孔状结构的管状支架。采用LLY-06D生物管状压缩弹性仪测试本实施例制备的管状材料干态时力学性能，定距离压缩2mm，测得压缩弹性回复率75%。实施例41.将8X (20/22)熟丝线通过组合编织成内径为3mm的小口径管状编织物。2.将0. 2千克家蚕生丝放入10升浓度为0. 25g/L的碳酸钠水溶液中，于98 100°C处理三次。前两次用自来水，每次处理30分钟。第三次用去离子水，处理45分钟。然后用水将丝充分清洗干净，拉松，置于60°C烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。3.称取脱胶后的家蚕丝素10克溶解于IOOml的摩尔比1 2的氯化钙-乙醇的水溶液中，70°C溶解2小时得家蚕丝素溶解液。4.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为3. 0 20. OkDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水，持续透析4天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为#t%。5.将织成的管状织物装在管状模具上，向上述丝素蛋白溶液中加入等质量的胶黏剂混勻，再脱气泡后注入管状模具中，管状编织物浸于丝素蛋白溶液和胶黏剂中，见管状模具置于-80°C冷冻4小时。6.从冰箱取出管状模具后摘下管状样品，置于盛有去离子水的容器内，每隔3 4小时用新的去离子水更换容器内的水，持续4天后取出用滤纸吸去多余的水分，得到具有孔状结构的管状支架。采用LLY-06D生物管状压缩弹性仪测试本实施制备的管状支架湿态时的力学性能，定负荷90cN，测得压缩弹性回复率92%。按照中华人民共和国国家GB/T16886. 5-2003/IS0 10993-5 :1999，医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性实验中的浸提液试验方法对实施例1 4制备的管状支架进行测试，测试结果表面实施例1 4制备的管状支架细胞毒性均为0级，无渗漏。实施例1 4制备的管状支架的弯折内径均为5. 5mm 6. 5mm。由上述结果可知，本发明制备的管状支架无毒性，力学性能优异，适合作为人工血管、神经导管等人工管状移植物。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
权利要求
1.一种丝素蛋白管状支架的制备方法，包括 将家蚕熟丝线编织成管状编织物；将家蚕生丝依次进行脱胶、透析，得到丝素蛋白溶液；将所述管状编织物、丝素蛋白溶液和胶黏剂置于管状模具中，将管状模具在-80°c -20°c冷冻后取出，得到依次包括外层丝素蛋白膜、芯层编织物和内层丝素蛋白膜的丝素蛋白管状支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱胶处理具体为 使用碳酸钠溶液处理家蚕生丝1 3次，处理温度为95°C 100°C ；将碳酸钠溶液处理过的生丝依次进行水洗，拉松，干燥，得到家蚕丝素纤维。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析具体为将脱胶后的蚕丝用氯化钙-乙醇溶液进行溶解后使用截留分子量为3kDa 20kDa的半透膜在水中进行透析。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶黏剂与丝素蛋白溶液的质量比为0. 2 2 1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶黏剂为多元醇或多元醇缩水醚。
6.一种丝素蛋白管状支架，其特征在于，包括依次设置的外层、芯层和内层，所述外层和内层均为丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜包括交联丝素蛋白和胶黏剂；芯层为家蚕熟丝线管状编织物。
7.根据权利要求6所述的管状支架，其特征在于，所述胶黏剂为多元醇或多元醇缩水醚。
8.根据权利要求6所述的丝素蛋白管状支架，其特征在于，其口径为Imm 10mm。
9.根据权利要求6所述的丝素蛋白管状支架，其特征在于，其管壁厚度为0.4mm Imm0
10.根据权利要求6所述的丝素蛋白管状支架，其特征在于，其折内径为5mm 7mm。
全文摘要
本发明提供一种丝素蛋白管状支架及其制备方法。该管状支架包括依次设置的外层、芯层和内层，所述外层和内层均为丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜包括交联丝素蛋白和胶黏剂；芯层为家蚕熟丝线管状编织物。本发明提供的上述管状支架弯折内径为5mm～7mm。本发明提供的管状支架无细胞毒性，具有优异生物力学性能。
文档编号A61F2/06GK102274089SQ20111013535
公开日2011年12月14日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者刘志武, 王建南 申请人:苏州大学