专利名称：重组鼠骨髓瘤细胞ns0-f10及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗瘤坏死因子的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
自身免疫性疾病是威胁人类健康的慢性病，由于类风湿关节炎和强直性脊柱炎等病致残的人数超出交通事故。早期用于治疗类风湿性关节炎症状以及维持患者生活质量的药物为非留体类抗炎药，比如阿司匹林、奈普生和C0X-2抑制剂，这些药物都可以缓解疼痛和炎症反应。甾体激素也和非留体类抗炎药联合使用已进一步减轻炎症反应，这种联合治疗可以获得更强的短期抗炎效果，但这种效果随着时间推移而逐渐减少直至消失。另一类治疗类风湿性关节炎的药物称为DMARDS (disease-modifying antirheumatic drugs)，这一类药物不仅是缓解症状，而且可以阻断疾病的发展进程。最常使用的药物为甲氨喋呤，其他药物包括金盐、抗疟药、柳氮磺胺呲啶(Sulphasalazine)、四环素和环孢素。尽管甲氨喋呤对大多数类风湿性关节炎病人都有效，但许多病人无法耐受该药的副作用，大约50%的病人最终会停止使用该药。这些病人可以使用一些比较新的生物反应调节剂，如来氟米特(Leflimomide，Arava)，但其作用机制和不良反应与甲氨喋呤类似，作为二线治疗药物用于甲氨喋呤无法耐受或治疗失败的患者。上述提及的都属于使用多年的老药，疗效确切，使用量大，但由于为非专利药，价格低廉，因此销售额并不高。近几年开发成功一系列免疫调节剂，这些免疫调节剂属专利药，价格高，为开发厂家带来了巨额利润。最成功的当属肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂，大约 30%中到重度类风湿性关节炎患者会接受TNF抑制剂治疗，并且还将往轻到中度患者群渗透。本发明以人TNF重组蛋白为抗原免疫小鼠，成功获得多株杂交瘤，能够分泌中和 TNF生物活性的单克隆抗体，其中一株亲和力达到3nM，生物活性EC50为0. 6nM。这个抗体已足以作为我们抗体药物的前体，目前人源化步骤已完成。
发明内容
本发明的一个目的是提供分泌特异性结合人肿瘤坏死因子的单克隆抗体。本发明所提供的抗体可以为如下1)、2)所述的抗体1) 一种抗体，其重链可变区具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列，其轻链可变区具有序列表中序列3所示的氨基酸残基序列。2)由重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10分泌得到的单克隆抗体。上述1)中所述抗体的重链可变区的编码基因和轻链可变区的编码基因也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种分泌特异性结合人肿瘤坏死因子α的单克隆抗体的细胞系。实验证明重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10分泌的单克隆抗体人TNF α的解离常数为 3ηΜ,生物活性EC50为0. 6ηΜ。上述单克隆抗体能够高亲和力特异性识别肿瘤坏死因子，并中和其生物学活性， 可以用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫性疾病。
图1为ELISA检测杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体与人TNF α的解离曲线 (纵坐标是ELISA显色后的光吸收值)图2为杂交瘤细胞株3f8生物活性的测定。关于保藏的生物材料的说明A.生物材料的保藏单位名称和地址名称中国科学院微生物研究所地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号邮编100101B.交保藏机构A的日期2010 年 05 月 24 日C.保藏机构A给予的保藏号CGMCC No. 384具体实施例方式下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。实施例1、鼠杂交瘤3f8及其分泌的抗肿瘤坏死因子α (TNF α )的单克隆抗体的制备和鉴定一、杂交瘤细胞株鼠杂交瘤3f8的制备1、抗原的制备人 TNFa 与结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MT)Psts—1 蛋白氨基酸 3沈-344小肽(DQVHFQPLPPAVVKLSDAL)的融合蛋白(TNFa-MT)的获得将编码人TNF α的 cDNA与小肽通过PCR方法重组，得到融合基因TNF a -MT ；将融合基因克隆至删除了 GST编码区的PET-41a载体(N0Vagen，USA)，克隆的质粒在DH5a里扩增，再经由BL21中表达，得到融合蛋白TNFa。融合蛋白中带有6Xhis Tag，通过Ni-NTA亲和层析纯化。2、免疫以步骤1得到的融合蛋白作为抗原免疫NZB/W Fl小鼠，共免疫三次10微克 TNF α -MT加完全弗氏佐剂皮下免疫(第一次免疫)，14天后5微克HMGBl-MT加不完全弗氏佐剂皮下免疫(第二次免疫)。14天后5微克HMGBl-MT加不完全弗氏佐剂皮下第三次免疫；3天后的NZB/W Fl小鼠取脾中的免疫细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞以5 1比例混合， 用聚乙二醇进行融合，HAT筛选后得到杂交瘤。3、杂交瘤筛选GST-TNF α重组蛋白的制备将人TNF α的编码区(序列如序列表中序列5所示)克隆至PET-41a载体(Novagen, USA)的EcoR I和HindIII酶切位点，转化至DH5 α，抗性筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，测序，结果质粒中TNFa的序列及插入方向正确；将阳性质粒转入大肠杆菌BL21，ImM IPTG诱导表达；纯化融合蛋白中带有GST Tag, 通过谷胱甘肽亲和层析纯化，具体步骤是，将诱导后的菌液5000rpm IOmin离心收集，弃上清，用PBS将菌体重悬，超声破碎，5000rpm离心lOmin，弃沉淀，将上清缓慢通过谷胱甘肽层析柱(Sigma)，用谷胱甘肽洗脱液将挂在谷胱甘肽层析柱上的融合蛋白洗脱下来，得到 GST-TNF α重组蛋白。分泌特异性结合TNF α抗体的杂交瘤检测以GST-TNF α重组蛋白(10微克/毫升)作为包被原包板，杂交瘤上清(进行梯度稀释)为一抗，HRP偶联的羊抗小鼠IgG多克隆抗体(R&D Systems)为二抗进行ELISA检测。亚克隆用限制性稀释法多次克隆分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，最后获得杂交瘤细胞株鼠杂交瘤抗人TNF α杂交瘤细胞株3f8。4、单克隆抗体的制备(1)腹水的制备方法Balb/C小鼠腹腔注射降植烷0. 5ml/只十天后，将杂交瘤细胞悬液接种于小鼠腹腔，待小鼠腹腔有明显肿胀后收集腹水，离心取上清。通过蛋白A/G亲和层析柱(Pierce)纯化抗体，0. lMGlycine/HCl (pH2. 5)洗脱(2)体外培养方法将已经建立的杂交瘤细胞3f8置于细胞培养基中，置于37°C和5% C02孵箱中培养，每隔2d换一次细胞培养液，待细胞浓度大于105个/ml时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。1500rpm，离心10分钟，收集培养上清，上清含有高水平的单克隆抗体，_20°C保存备用。所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (体积百分含量)，所述细胞培养基的pH为7. 4。纯化将体外培养得到的上清进行如下纯化，将上述上清缓慢通过蛋白A/G亲和层析柱(Pierce)，再用0. IM Glycine/HCl (pH2. 5)将挂在层析柱上的目的蛋白洗脱下来， 得到纯化后的蛋白。5、杂交瘤3f8分泌的抗体的性能检测(I)ELISA检测杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体与TNF α的解离曲线。实验方法用TNF α -MT (制备方法见步骤1) (2ug/ml)作为包被抗原，步骤4制备纯化的杂交瘤细胞3f8分泌的单抗作为一抗(以160ug/ml为起始浓度，二倍二倍进行稀释)，羊抗小鼠IgG-HRP (R&D) (1 2000)为二抗进行ELISA测定。实验设3次重复，结果如图1所示，ELISA最大读数的50%相对应的抗体浓度为抗体的解离常数。表明杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体与TNF α的解离常数为3ηΜ。图 1的横坐标是杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体的浓度。(2)抗体亚型鉴别实验以GST-TNF α重组蛋白(10微克/毫升)包板，杂交瘤上清为一抗，HRP偶联的大鼠抗小鼠IgGl，186加，或IgG2b单克隆抗体(BDPharmingen)为二抗进行ELISA检测。实验证明杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体为IgG2b亚型。(3)抗体生物活性的测定实验设3次重复，结果如图2所示，生物活性EC50为0. 6nM。实施例2、抗TNF α人源化抗体pCI-DHFRr-gpt_hu3f8的制备
鼠抗体在人体内会产生免疫排斥反应，因此只能用于急症的治疗，一旦人体内产生针对鼠抗体的抗抗体，作为药物的鼠抗体就会失效。为了克服这一缺点，本发明对鼠抗体进行了人源化，制备了人源化抗体ch-TNF α。该抗体的可变区序列来自鼠抗体-杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体，不变区序列来自人IgGl。这种抗体保持了鼠单抗的抗原结合特异性，同时降低了在人体内诱导的免疫排斥反应。制备人源化抗体的步骤如下从杂交瘤细胞株3f8中分离纯化mRNA，用oligo-dT合成第一链cDNA。用PCR方法分别扩增抗体轻链和重链可变区，轻链引物为5’GAYATT GTG MTS ACM CARffCT MCA 3’和 5，CTC CAGATG TTAACT GCTCAC 3，；重链引物为5，ATG SARGTN MAG CTG SAG SAG TC 3， 和 5，GGTCAA GGT CAC TGG CTC AGG3，。其中，R = G 或 A，Y = T 或 C，M = A 或 C，S = G 或 C，W = T或A，N = G或A或C或T。将PCR产物分别克隆到T载体中测序。结果表明杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体的重链可变区的编码基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，编码具有序列表中序列7的氨基酸残基序列的重链可变区；杂交瘤细胞株3f8分泌的单克隆抗体的轻链可变区的编码基因具有序列表中序列8的核苷酸序列，编码具有序列表中序列9的氨基酸残基序列的轻链可变区。将得到的抗体重链可变区基因和轻链可变区基因人源化，抗体重链可变区的编码基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。抗体轻链可变区的编码基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。人源化的单克隆抗体3f8的轻链可变区基因与轻链载体pCI-gpt的连接用PCR 方法将人源化轻链可变区引入Ml I和)(ba I两个酶切位点，引物为5’ CCC agggtc gac egg aga cat tgt get cac cca gtc tcc age ttc 3'和 5' gaa tttctagaa gac aat agt gaa aaa tta ctt tgc age ate 3’。人源化的单克隆抗体3f8的轻链可变区基因可通过 Sal I和)(ba I两个酶切位点插入到载体pCI-gpt中，得到pCI-gpt-hu3f8_VL人源化的单克隆抗体3f8的重链可变区基因与轻链载体pCI-DHFRr的连接用 PCR方法将人源化轻链可变区引入Not I和)(ba I两个酶切位点，引物为5’ggtggc ggc cgc aac agg tgc cca ctc cca ggt cca act ggt ccag 3'^P 5'aag ctctag aag aca ata gtg aaa aat tac tta ccg ctt gag gag ac3’。人源化的单克隆抗体3f8的重链链可变区基因可通过I和)(ba I两个酶切位点插入到载体pCI-DHFRr中，得到pCI-DHFRr-hu3f8_VH。将pCI-DHFRr-hu3f8-VH中的可变区部分和不变区部分用内切酶Not I/Xho I切下，插入到pCI-gpt-hu3f8-VL的Not I/Xho I两个酶切位点中，从而构建出人源化抗体 pCI-DHFRr-gpt-hu3f8。用电转染的方法将含有人源化抗体基因的表达载体pCI-DHFRr-gpt_hu3f8导入到哺乳动物细胞NS/0(ECACC购买)中。用霉酚酸酯(Mycophenolate)在含黄嘌呤 (Xanthine)的培养基中筛选转化细胞，获得稳定转染的细胞株，记作NS0-F10，保藏在中国微生物菌种管理委员会，普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3846。NS0-F10分泌的单克隆抗体经ELISA检测，与人TNF-alpha的解离常数为3nM。细胞NS/3f8的培养方法用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。序列表
序列 1QvqlvqsgselkkpgasvkisckasgytftnygnmwvrqapgkglewmgwintytgeptyaddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycarrrsydydvamdywgqgtIvtvss序列 2Caggtccaactggtccagtctggatctgagctgaagaagcctggagcttctgtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgcggcaggctccaggaaagggtttagagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgtcttctctttggatacctctgtcagcactgcctatttgcagatctcgtcgctcaaagctgaggacacagctgtctattactgtgcaagaagaagaagctatgattacgacgtggctatggactactggggtcaaggaaccctagtcaccgtctcctca序列 3DivmtqspdslavslgqratincrasesvdsygnyfmhwyqqkpgqppklliyrasnlesgvpdrfsgsgsgtdftItisslqaedvatyycqqsneepltfgqgtkleikradaa序列 4Gacattgtgatgacccagtctccagattctttggctgtgtctctagggcagagggccaccataaactgcagagccagtgaaagtgttgatagttatggcaattattttatgcactggtatcagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctggggtccctgacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaccattagtagtctgcaggctgaagatgttgcaacctattactgtcaacaaagtaatgaggagcctctcacgttcggccaggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgca序列 5ctccctcagcaaggacagcagaggaccagctaagagggagagaagcaactacagaccccccctgaaaacaaccctcagacgccacatcccctgacaagctgccaggcaggttctcttcctctcacatactgacccacggctccaccctctctcccctggaaaggacaccatgagcactgaaagcatgatccgggacgtggagctggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgttcctcagcctcttctccttcctgatcgtggcaggcgccaccacgctcttctgcctgctgcactttggagtgatcggcccccagagggaagagttccccagggacctctctctaatcagccctctggcccaggcagtcagatcatcttctcgaaccccgagtgacaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccaaggctgcccctccacccatgtgctcctcacccacaccatcagccgcatcgccgtctcctaccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggagaagggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttgggatcattgccctgtgaggaggacgaacatccaaccttcccaaacgcctcccctgccccaatccctttattaccccctccttcagacaccctcaacctcttctggctcaaaaagagaattgggggcttagggtcggaacccaagcttagaactttaagcaacaagaccaccacttcgaaacctgggattcaggaatgtgtggcctgcacagtgaagtgctggcaaccactaagaattcaaactggggcctccagaactcactggggcctacagctttgatccctgacatctggaatctggagaccagggagcctttggttctggccagaatgctgcaggacttgagaagacctcacctagaaattgacacaagtggaccttaggccttcctctctccagatgtttccagacttccttgagacacggagcccagccctccccatggagccagctccctctatttatgtttgcacttg
tgattatttattatttatttattatttatttatttacagatgaatgtatttatttgggagaccggggtatcctgggggacccaatgtaggagctgccttggctcagacatgttttccgtgaaaacggagctgaacaataggctgttcccatgtagccccctggcctctgtgccttcttttgattatgttttttaaaatatttatctgattaagttgtctaaacaatgctgatttggtgaccaactgtcactcattgctgagcctctgctccccaggggagttgtgtctgtaatcgccctactattcagtggcgagaaataaagtttgcttagaaaagaa序列 6Cagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggactcggctacatatttctgtgcaggaagaagaagctatgattacgacgtggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccatctcctca序列 7qsgpelkkpgetvkisckasgytftnygmnwvkqapgkglkwmgwintytgeptyaddfkgrfafsletsastaylqinnlknedsatyfcagrrsydydvamdywgqgtsvtiss序列 8gacattgtgctcacccagtctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgcagagccagtgaaagtgttgatagttatggcaattattttatgcactggtatcagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaccattaatcctgtggaggctgatgatgttgcaacctattactgtcaacaaagtaatgaggagcctctcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgca序列 9divltqspaslavslgqratiscrasesvdsygnyfmhwyqqkpgqppklliyrasnlesgiparfsgsgsgtdftItinpveaddvatyycqqsneepltfgsgtkleikradaa.
权利要求
1.重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10CGMCCNo. 3846。
2.重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10CGMCCNo. 3846分泌的单克隆抗体及其衍生物，所述单克隆抗体的衍生物为单链抗体、Fab片段或人-鼠嵌合抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体及其衍生物，其特征在于所述重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10CGMCC No. 3846分泌的单克隆抗体、由所述单克隆抗体衍生的Fab片段或人-鼠嵌合抗体的重链可变区具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体衍生物，其特征在于由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链具有序列表中序列8的氨基酸残基序列，重链具有序列表中序列9 的氨基酸残基序列。
5.根据权利要求2所述的单克隆抗体及其衍生物，其特征在于由所述单克隆抗体衍生的单链抗体具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。
6.权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体及其衍生物的编码基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于由所述单克隆抗体衍生的人-鼠嵌合抗体的轻链编码基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，重链编码基因具有序列表中序列7的核苷酸序列。
8.权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体及其衍生物在制备药物中的应用，所述药物为治疗由人TNF-alpha参与的炎症反应的药物、由人TNF-alpha参与的自身免疫性疾病或器官损伤性疾病的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述炎症反应为败血症，全身炎症反应综合症或急性肺损伤；所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎，糖尿病或红斑狼疮；所述器官损伤性疾病为心肌梗塞，脑梗，药物性或病毒性肝损伤。
10.权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体及其衍生物在检验人TNF-alpha中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10及其应用。一种抗体，其重链可变区具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列，其轻链可变区具有序列表中序列3所示的氨基酸残基序列。实验证明重组鼠骨髓瘤细胞NS0-F10分泌的单克隆抗体与人TNFα的解离常数分别为3nM，生物活性EC50为0.6nM。上述单克隆抗体及其衍生物能够高亲和力特异性识别肿瘤坏死因子α，并中和其生物学活性，可以用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫性疾病。
文档编号A61P29/00GK102260648SQ20111014039
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者周洪哲, 唐捷, 杭海英, 王云波, 贾俊英 申请人:中国科学院生物物理研究所