免疫原性组合物的制作方法

专利名称：免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性组合物和疫苗，其包含Hib糖缀合物和至少一种额外的细菌糖缀合物，其与包括全细胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的其他抗原组合，涉及制备此类免疫原性组合物和疫苗的方法，和使用所述免疫原性组合物和疫苗免疫的用途和方法。
背景技术：
已经表明细菌多糖是用于疫苗的有效免疫原，尤其当缀合到载体蛋白时。可以得到抗b型流感嗜血杆菌(Hibtiter Wyeth-Lederle)、肺炎球菌多糖(Prevnar -ffyeth-Lederle)和脑膜炎球菌多糖(Meningitec -Wyeth-Lederleand Menactra -Sanofi)的商业缀合疫苗。还描述了包含Hib缀合物、脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物、全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性组合物和疫苗。例如，WO 02/00249公开了 7价免疫原性组合物，其包含白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳、乙型肝炎表面抗原、Hib缀合物、MenA缀合物和MenC缀合物。呈送的临床试验结果使用5 μ g糖剂量的每种细菌糖缀合物。

发明内容
本发明涉及提供组合疫苗，其包含Hib缀合物、额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)和其他抗原，包括全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原中的一种或两种。使用的糖剂量允许产生抗Hib和额外的细菌糖以及抗百日咳组分和/或乙型肝炎表面抗原组分的良好的免疫应答。本发明人已经令人惊奇地发现在包含全细胞百日咳和/或乙型肝炎表面抗原的组合疫苗中，通过降低Hib和/或额外的细菌缀合物的糖剂量到低于每剂5 μ g，保持对糖缀合物的良好的免疫应答并且全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的免疫原性得到增强(例如，使得如通过ELISA测量的Pw和/或乙型肝炎的GMC高于用含有5 μ g糖剂量的每种缀合物的免疫原性组合物免疫后实现的水平)。因此，本发明的第一方面提供了免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌糖缀合物，和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于每剂5 μ g。本发明的免疫原性组合物包含Hib糖缀合物，和/或至少或刚好1、2、3或4种细菌糖缀合物，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5 μ g或小于4 μ g，或者在1-4 μ g或1_3 μ g， 或2-4 μ g或2-3 μ g之间，或者约或者刚好2. 5 μ g，任选地，至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)的全部或其每一种的糖剂量小于 10 μ g>9 μ g>8 μ g>7 μ g>6 μ g>5 μ g or 4 μ g, 1一10 μ g>l~8 μ g>l~6 μ g>l"5 μ g、l_4y g、1-3 μ g、或2-4 μ g或2-3 μ g之间或约或刚好2. 5 μ g。术语“糖”包括多糖或者寡糖。将多糖从细菌分离或从细菌分离并通过已知的方法(见例如EP4975M和EP497525)并任选通过微流化按大小分级到某种程度。可以按大小分级多糖以便减小多糖样品中的粘性和/或提高缀合产物的滤过率。寡糖具有低数目的重复单位(通常5-30个重复单位)并且通常是经水解的多糖。以施用于人的免疫原性组合物或者疫苗的量测量“糖剂量”。Hib糖是聚核糖基磷酸酯(PRP)荚膜多糖或者b型流感嗜血杆菌的寡糖。“至少一种额外的细菌多糖缀合物”是指连接到载体蛋白的任一种细菌糖类的缀合物。细菌糖类任选地是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株、肺炎链球菌(S. pneumoniae)菌株、 伤寒沙门氏菌(S. typhi)菌株的荚膜多糖或者本文所述的任一种细菌糖类。“至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物”是指脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌W135荚膜糖 (Menff)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B荚膜糖 (MenB)、血清群C和Y荚膜糖(MenCY)、血清群C和A荚膜糖(MenAC)、血清群C和Wl35荚膜糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜糖(MenAY)、血清群A和W135荚膜糖(MenAW)、血清群 W135和Y荚膜糖(MenWY)、血清群A、C和W135荚膜糖(MenACW)、血清群A、C和Y荚膜糖 (MenACY)、血清群A、W135和Y荚膜糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y荚膜糖(MenCWY)或者血清群A、C、W135和Y荚膜糖(MenACWY)、血清群B和C荚膜糖(MenBC)、血清群B、C和Y荚膜糖(MenBCY)、血清群B、C和A荚膜糖(MenABC)、血清群B、C和W荚膜糖(MenBCW)、血清群 A、B和Y荚膜糖(MenABY)、血清群A、B和W荚膜糖(Men ABff)、血清群B、W135和Y荚膜糖 (MenBWY)、血清群 A、B、C 和 Wi;35 荚膜糖(MenABCW)、血清群 A、B、C 和 Y 荚膜糖(MenABCY)； 血清群A、B、Wi;35和Y荚膜糖(MenABWY)、血清群B、C、Wi;35和Y荚膜糖(MenBCWY)；或血清群 A、B、C、W135 和 Y 荚膜糖(MenABCffY)。例如，上面所列的加入或者不加入Hib糖缀合物的脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的任一组合可以以小于5 μ g或小于4 μ g、或1-4 μ g或1-3 μ g、或2-4 μ g或2_3 μ g或约或刚好2. 5yg的糖剂量存在。为了本发明的目的，“约”或“大约”被定义为给定数字的10%上下。在一个实施方案中，Hib的糖剂量可以与脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物的糖剂量相同、更大或更少。Hib糖缀合物的糖剂量可以为例如至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物的平均或最低糖剂量的100 %或小于90 %、80 %、75 %、70 %、60 %、50 %、 40%、30%、20%或10%。Hib糖的糖剂量为例如至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物的平均或最低糖剂量的20 %到60 %、30 %到60 %、40 %到60 %或约或刚好 50%。在本发明的一个实施方案中，所述至少一种额外细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌) 糖或者其每一种的剂量相同或者大约相同。本发明的免疫原性组合物的实例是由下面组成的或包含下面的组合物Hib缀合物和MenA缀合物和MenC缀合物，任选地，糖剂量比为2 2、1 2 1、 1 4 2、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、1 6 6 (w/w)。任选地，MenA 的糖剂量大于MenC的糖剂量。
Hib缀合物和MenC缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenC的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenC缀合物和MenW缀合物，任选地，糖剂量比为1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w)。任选地，MenC的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenW缀合物，任选地，糖剂量比为1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenA的糖剂量大于MenW的糖剂量。Hib缀合物和MenA缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1 2 2、 1 2 1、1 4 2、1 4 1、1 8 4、1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、 1:6: 6 (w/w) 0任选地，MenA的糖剂量大于MenY的糖剂量。Hib缀合物和MenW缀合物和MenY缀合物，任选地，糖剂量比为1 2 2、 1 2 1、1 1 2、1 4 2、1 2 4、1 4 1、1 1 4、1 3 6、1 1 3、 1 6 3、1 3 3、1 4 4、1 5 5、1 6 6 (w/w)。任选地，MenY 的糖剂量大于MenW的糖剂量。“其他抗原”包括全细胞百日咳(Pw)和乙型肝炎表面抗原OfepB)中的一种或两种。在一个实施方案中，所述其他抗原还包括白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、无细胞百日咳(Pa)和/或脊髓灰质炎病毒(IPV)。在一个实施方案中，所述其他抗原包含DT、TT、 百日咳抗原0 或Pw)和H印B或由其组成。在一个实施方案中，所述其他抗原包含或DT、 TT、百日咳抗原(Pa或Pw)、H印B和IPV其由组成。包括在本发明的免疫原性组合物中的Hib和/或脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素的无毒突变体、白喉类毒素、 CRM197、白喉毒素的其他无毒突变体[如 CRM176，CRM197，CRM228，CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218 ；3838-3844，1973) ；CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 和 CRM107，和 Nicholls 禾口 Youle 在遗传工禾呈化的毒素(Genetically Engineered Toxins), Ed :Frankel, Maecel Dekker Inc，1992 中描述的其他突变；US 4709017 或US 4950740 中公开的 Glu-148 向 Asp、 Gln或Ser和/或Ala 158向Gly的缺失或突变和其他突变；US 5917017或US 6455673 中公开的至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变或者其他突变；或者US 5843711中公开的片段]、肺炎球菌的肺炎球菌溶血素、OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B提取-EP0372501)、合成肽(EP0378881、 EP0427347)、热休克蛋白(W093/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(W0 98/58668、 EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(W0 91/01146)、包含来自多种病原体来源的抗原的人⑶4+T细胞表位的人工蛋白质(Falugi等人O001)Eur J Immunol 31; 3816-3824)，如 N19 蛋白(Baraldoi 等人(2004) Infect Immun 72 ；4884-7)肺炎球菌表面蛋白 PspA(W) 02/091998)肺炎球菌溶血素(Kuo 等人(1995nnfect Immun 63 ；2706-13)、 铁摄取蛋白(W001/72337)、难辨梭状芽孢杆菌(C. difficile)的毒素A或B(W0 00/61761) 或蛋白 D(EP594610 和 WO 00/56360)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在Hib缀合物和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物中，任选在Hib缀合物和每种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物(任选免疫原性组合物中存在的所有糖缀合物)中使用相同的载体蛋白。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物和Men多糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC糖缀合物、Hib糖缀合物和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和 MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenC糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和Men和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenW和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和 MenA, MenC和MenW糖缀合物、Hib糖缀合物和MenA、MenC和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenA、Menff和MenY糖缀合物、Hib糖缀合物和MenC、Menff和MenY糖缀合物或Hib糖缀合物和MenA、MenC、Menff和MenY糖缀合物。在一个实施方案中，单一载体蛋白可以携带一种以上的糖抗原(W004/083251)。例如，单一载体蛋白可以缀合至Ij Hib禾口 MenA、Hib禾口 MenC、Hib禾口 MenW、Hib禾口 MenY、MenA禾口 MenC、MenA 禾口 MenW、MenA 禾口 MenY、MenC 禾口 MenW、MenC 禾口 MenY 或 Menff 禾口 MenY。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的Hib糖，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。其中对于Hib，所述载体蛋白是TT或者其片段和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖，载体的总剂量为 2. 5-25 μ g,3-20 μ g,4-15 μ g,5-12. 5 μ g, 15-20 μ g, 16-19 μ g 或 17-18 μ g。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的至少1、2、3、 或4种脑膜炎奈瑟氏球菌细菌糖，所述载体蛋白选自TT、DT、CRM197、TT的片段C和蛋白D。本发明的免疫原性组合物任选地包含Hib糖缀合物，其Hib与载体蛋白的比例为 1:5 至 5: 1;1:2 至 2: 1 ；1 1 至 1:4;1:2 至 1: 3. 5 ；或约或刚好 1 2.5 或 1 3(w/w)。本发明的免疫原性组合物任选包含至少一种脑膜炎球菌糖(例如，MenA和/或 MenC和/或MenW和/或MenY)缀合物，其Men糖与载体蛋白的比例为1 5到5 1、1 2 到 5 1、1 0.5 至Ijl 2. 5 或 1 1. 25 至Ij 1 2. 5 (w/w)。使用灭菌的缀合物可以测定缀合物中糖与载体蛋白(w/w)的比例。使用Lowry测定法(例如 Lowry 等人(1951) J. Biol. Chem. 193,265-275 或 Peterson 等人，Analytical Biochemistry 100，201-220 (1979))测定缀合物中糖与载体蛋白(w/w)的比例((w/w))并将ICP-OES (电感耦合的等离子体-光学发射光谱法)用于MenA，DMAP测定法用于MenC和间苯二酚测定法用于 MenW 和 MenY (Monsigny 等人(1988) Anal. Biochem. 175,525-530)以测定糖的量。在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，Hib糖通过接头，如双功能接头缀合到载体蛋白。接头任选地是异双功能的或者同双功能的，具有例如一个活性氨基和一个活性羧酸基团、2个活性氨基或2个活性羧酸基团。接头具有例如4到20、4到12、5到10 个碳原子。可能的接头是ADH。其他接头包括B-丙酰氨基(W0 00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever 等人(1979)Med. Microbiol. Immunol. 165 ；171-288)、卤代烧基卤(US4057685) 糖苷键(US4673574, US4808700)和 6-氨基己酸(US4459286)。在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术制备。例如，可以通过硫醚键将糖偶联。缀合方法可以依赖于用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶馈活化糖以形成氰酸酯。从而，活化的糖可以直接或者通过间隔基(接头)被偶联到载体蛋白上的氨基。任选地，用己二胺或者ADH将氰酸酯偶联并且使用涉及硫醚键形成的杂连接化学将氨基衍生的糖缀合到载体蛋白，或者使用碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)化学将其缀合到载体蛋白。此类缀合物在PCT公布的申请WO 93/15760 Uniformed Services University 和 WO 95/08348 和 WO 96/29094 中描述。其他合适的技术使用碳酰亚胺、酰胼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多在WO 98/42721中描述。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI反应(Bethell等人J. Biol. Chem. 1979,254 ；2572-4，Heam等人 J. Chromatogr. 1981.218 ；509-18)，接着通过与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键而形成。这可以涉及将异头末端还原成伯羟基，任选地保护/去保护伯羟基，使伯羟基与CDI反应形成 CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白质上的氨基反应。通过如US 4365170 (Jennings)和 US 4673574 (Anderson)中描述的直接还原胺化方法也可以制备缀合物。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。另一方面涉及通过碳化二亚胺缩合(Chu C.等人hfect. Immunity，1983 245 256)，例如使用EDAC，将用己二酸酰胼(ADH)衍生的溴化氰(或CDAP)活化的糖偶联到载体蛋白(Chu C.等人 hfect. Immunity，1983 245 256)。在一个实施方案中，将糖上的羟基直接或间接(通过接头)地连接到蛋白质上的氨基或羧基。当存在接头时，任选地例如使用CDAP缀合，将糖上的羟基连接到接头上的氨基。接头(例如ADH)上的另一氨基可以被缀合到蛋白质上的羧酸基团，例如，通过使用碳化二亚胺化学，例如，通过使用EDAC。在一个实施方案中，在接头被缀合到载体蛋白前，首先将Hib或者至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到接头。在一个实施方案中，当Hib糖存在时，其被使用CNBr、或者CDAP，或者CDAP和碳化二亚胺化学(如EDAC)的组合，或CNBr和碳化二亚胺化学(如EDAC)的组合缀合到载体蛋白。任选地，使用CNBr和碳化二亚胺化学(任选EDAC)缀合Hib。例如，用CNBr连接糖和接头，然后用碳化二亚胺化学连接接头和蛋白质载体。在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一种被直接缀合到载体蛋白。任选地，将MenW和/或MenY和/或MenC和/或MenA糖直接缀合到载体蛋白。 例如,将 Menff ；MenY ；MenC ；MenA ；Menff 禾口 MenY ；Menff 禾口 MenC ；MenY 禾口 MenC ； ^ Menff, MenY 和MenC直接连接到载体蛋白。任选地，通过CDAP将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖中的至少一种直接缀合。例如，将 Menff ；MenY ；MenC ；Menff 禾口 MenY ；Menff 禾口 MenC ；MenY 禾口 MenC ；或 Menff, MenY和MenC通过CDAP直接连接到载体蛋白(见WO 95/08348和W096/29094)。任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例为1 0. 5到1 2 (w/w)或者MenC 糖与载体蛋白的比例为1 0. 5和1 2或1 1.25和1 1. 5或1 0. 5和1 1 (w/ w)，特别任选地使用CDAP将这些糖直接连接到蛋白质。在一个实施方案中，通过接头，如双功能接头将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。接头任选地是异双功能的或者同双功能的，具有例如一个活性氨基和一个活性羧酸基团、2个活性氨基或2个活性羧酸基团。接头具有例如4到20、4到12和5到 10个碳原子。可能的接头是ADH。
在一个实施方案中，通过接头将MenA ；MenC ；或MenA和MenC缀合到载体蛋白。在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC，通过接头将脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。例如，使用如上述的CDAP和EDAC，通过接头(例如，在其末端具有两个氨基，如 ADH)将MenA ；MenC ；或MenA和MenC缀合到蛋白质。例如，用CDAP将糖缀合到接头并用 EDAC将接头缀合到蛋白质。任选地，对于MenA ；MenC ；或MenA和MenC，通过接头的缀合导致糖与载体蛋白的比例为1 0.5到1 6;1 1到1 5或1 2到1 4。在本发明的一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群 A、C、W和Y中的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖或者被最高达xl. 5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、 x9、xl0或x20的系数按大小分级。例如，至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小为约 50kDa、60kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa 或 130kDa。“天然多糖”是指还没有接受目的是减小该多糖的大小的处理的多糖。 “被最高达x2的系数按大小分级”是指对该多糖进行一种处理，该处理的目的是减小多糖的大小但是保留超过天然多糖大小的一半的尺寸。X3、x4等以相同的方式被解释， 即，对多糖进行处理，其目的是减小多糖的大小但是保留超过天然多糖大小1/3、1/4等等的大小。在本发明的一方面，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群A、C、W和 Y的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖。在本发明的一个方面中，免疫原性组合物包含缀合到载体蛋白的来自血清群A、C、 W和Y的至少1、2、3或4种的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖，其中至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖被最高达xl. 5、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的系数按大小分级。在一个实施方案中，至少1、2、3或4种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小如通过 MALLS 测定的，为 50KDa 到 1500kDa、50kDa 到 500kDa、50kDa 到 300KDa、IOlkDa 到 1500kDa、IOlkDa 到 500kDa、IOlkDa 到 300kDa。在一个实施方案中，当MenA糖存在时，其具有如通过MALLS测定的50_500kDa、 50-100kDa、100-500kDa、55-90KDa、60-70kDa 或 70_80kDa 或 60_80kDa 的分子量。在一个实施方案中，当MenC糖存在时，其具有如通过MALLS测定的100_200kDa、 50-100kDa、100-150kDa、101-130kDa、150-210kDa 或 180_210kDa 的分子量。在一个实施方案中，当MenY糖存在时，其具有如通过MALLS测定的60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa 或 110-140kDa、50_100kDa、100_140kDa、 140-170kDa 或 150_160kDa 的分子量。在一个实施方案中，当MenW糖存在时，其具有如通过MALLS测定的60_190kDa、 70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa 或 120_140kDa 的
分子量。糖的分子量是指在缀合之前并且通过MALLS测定的多糖的分子量。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖是天然多糖或者在正常提取物过程中大小减小的天然多糖。
在一个实施方案中，将脑膜炎奈瑟氏球菌糖通过机械断裂，如通过微流化或者超声处理按大小分级。微流化和超声处理具有降低较大的天然多糖的大小而足以提供可滤过的缀合物的优点。在一个实施方案中，糖的多分散性是1-1. 5,1-1. 3,1-1. 2U"1. 1或1-1. 05并且在缀合到载体蛋白后，缀合物的多分散性为1. 0-2. 5,1. 0-2. 0,1. 0-1. 5,1. 0-1. 2,1. 5-2. 5、 1. 7-2. 2或1. 5-2. 0。所有多分散性都通过是MALLS测量的。对于脑膜炎球菌糖的MALLS分析，可以组合使用两个柱子(TSKG6000和5000PWxl TOSOH Bioscience)并用水洗脱糖。使用光散射检测器(例如，装备IOmW氩激光器的Wyatt Dawn DSP在488nm下)和干涉测量折射计(例如，装备PlOO测定池和红色滤光器的Wyatt Otilab DSP在498nm下)检测糖类。在一个实施方案中，当存在时MenA糖，其被至少部分地0_乙酰化，使得至少50 %、 60 %、70%、80%、90%、95%或98%的重复单位在至少一个位置被0-乙酰化。0-乙酰化例如存在于至少0-位。在一个实施方案中，当存在时MenC糖，其被至少部分地0_乙酰化，使得至少30 %、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 98% 的 O — 9)-连接的 NeuNAc 重复单位在至少一个或两个位置被0-乙酰化。0-乙酰化例如存在于0-7和/或0-8位。在一个实施方案中，当存在时MenW糖，其被至少部分地0-乙酰化，使得至少30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %的重复单位在至少一个或两个位置被0-乙酰化。0-乙酰化例如存在于0-7和/或0-9位。在一个实施方案中，当存在时MenY糖，其被至少部分地0_乙酰化，使得至少40 %、 50 %、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单位在至少一个或两个位置被0-乙酰化。 0-乙酰化存在于7和/或9位。0-乙酰化的百分比是指含有0-乙酰化的重复单位的百分比。这可以在缀合之前和/或缀合后在糖中测量。本发明的另一方面是包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。任选地，免疫原性组合物或疫苗含有足够增强对免疫原的免疫应答量的佐剂。合适的佐剂包括，但不限于，铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-I)、胞壁酰肽、 皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉酚酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈和衍生物，和免疫刺激复合物(ISCOMs)，如 Takahashi 等人(1990)Nature 344 :873-875 描述的那些。对于上文讨论的HibMen组合，有利的是Hib和Men糖缀合物不被吸附到铝盐佐剂或者任何佐剂上。在一个实施方案中，免疫原性组合物是无佐剂的。对于本发明，“无佐剂的”是指自身不作是抗原性组分的佐剂组分不存在于免疫原性组合物中。在本发明的一个实施方案中，H印B被吸附到磷酸铝(W093/M148)。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含通过接头缀合到破伤风类毒素的Hib糖和直接或通过接头缀合到破伤风类毒素的MenC糖和直接或通过接头缀合到破伤风类毒素的MenA糖。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物被缓冲在、或调节到pH 7. 0到8. 0， pH 7. 2到7. 6或约或刚好pH 7. 4。任选地在稳定剂如多元醇如蔗糖或者海藻糖存在下冻干本发明的免疫原性组合物或者疫苗。对于所有免疫原性组合物或疫苗，必须通过经验确定免疫原的免疫学有效量。待考虑的因素包括免疫原性、免疫原是否将与佐剂或载体蛋白或其他蛋白质复合或者共价连接、施用途径和待施用的免疫剂量数。此类因素是疫苗领域已知的并且免疫学家完全可以不用过度实验来做出此类确定。活性剂可以以不同的浓度存在于本发明的药物组合物或疫苗中。通常，物质的最小浓度是实现它的预期用途必须的量，尽管最大浓度是将保持在溶液中或者均勻悬浮在最初混合物中的最大量。例如，治疗剂的最小量任选地为将提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质，最小浓度是重构时生物活性必需的量，并且最大浓度是不能保持均勻悬浮液时的浓度。对于单次剂量单位，所述量是单次治疗应用的量。通常，预期每剂将包含 1-100 μ g蛋白质抗原，任选地5-50 μ g或5-25 μ g。本发明的疫苗制剂可以用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物(例如，人类患者)，可以通过全身或粘膜途径施用所述疫苗。人类患者任选地为婴儿(12个月以下)、初学走路的孩子(12-M、12-16或12-14个月)、儿童 (2-10、3-8或3-5岁)和青少年(12-25、14-21或15-19岁)或成人(12、15、18或21岁以上)。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射；或者通过粘膜施用到口腔/食道、呼吸道、生殖泌尿道。优选鼻内施用疫苗以治疗肺炎或者中耳炎(如可以有效预防肺炎双球菌的鼻粘膜携带，从而减轻它的最早阶段的感染)。尽管本发明的疫苗可以作为单次剂量施用，但是其组分也可以一起或者在不同的时间共同施用(例如，如果糖存在于疫苗中，那么这些可以在同时分开施用或者在细菌蛋白质疫苗施用后1-2周施用以最佳地协调相互的免疫应答)。除了单一施用途径外，还可以使用2种不同的施用途径。例如， 病毒抗原可以ID(皮内)施用，而细菌蛋白质可以IM(肌内)或者IN(鼻内)施用。如果存在糖类，那么它们可以IM(或ID)施用并且病毒蛋白质可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗可以被IM施用用作引发剂量，以及IN施用用作加强剂量。疫苗制剂一般被描述于疫苗设计(“The subunit and adjuvant approach "(Powell Μ. F.禾口 Newman Μ. J.著)(1995) Plenum Press New York)。Ful lerton, 美国专利4，235，877描述了在脂质体内的包裹。本发明的另一方面是用于相伴或者顺序施用的疫苗试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物，用于在宿主中赋予抗百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)禾口脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)弓I起的疾病的保护。例如，该试剂盒任选地包含第一个容器和第二容器，第一容器包含一种或多种破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，和全细胞百日咳组分和任选地还包含乙型肝炎表面抗原，第二个容器包含
Hib糖缀合物，和至少1、2、3或4种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，其中Hib缀合物的糖剂量小于5 μ g或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或 2-3 yg或者约或刚好2. 5 μ g，任选地至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)或其每一种的糖剂量小于10 μ g、9 μ g、8 μ g、7 μ g、6 μ g、
5μ g 4 μ 1"10 μ g、1~8 μ g、1一6 μ g、1~5 μ g、1一4 μ g、1~3 μ g、$ 2~4 Ug^ 2~3 Ug^. 间或约或刚好2.5 μ g。Hib缀合物和至少一种额外的细菌糖(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖)缀合物的实例如上述。上述缀合物的任一种性质可以存在于疫苗试剂盒中。任选地，本发明的疫苗试剂盒包含第三种组分。例如，本发明的试剂盒任选地包含第一个容器和第二个容器以及第三个容器，第一个容器包含一种或多种破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，和全细胞百日咳组分，和任选包含乙型肝炎表面抗原；第二个容器包含载体蛋白和来自肺炎链球菌的荚膜糖的一种或多种缀合物[其中荚膜糖任选来自选自 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、 23F和33F的肺炎球菌血清学]，而第三个容器包含Hib糖缀合物，和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物，其中Hib缀合物的糖剂量小于5 μ g或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或 2-3 μ g或者约或刚好2. 5 μ g，并且任选地至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌糖缀合物 (例如，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物)或其每一种的糖剂量小于10 μ g、9 μ g、8 μ g、7 μ g、
6μ g>5 μ g 4 μ g> $ 1—10 μ g、1一8 μ g、1一6 μ g、1一5 μ g、1一4 μ g、1一3 μ g、 2~4 Ug^ 2-3 μ g之间或约或刚好2. 5 μ g。包含脑膜炎球菌缀合物，如HibMenC、HibMenAC, HibMenAff, HibMenAY, HibMenCff, HibMenCY, HibMenffY, MenAC, MenAff, MenAY, MenCW、MenCY, MenffY 或 MenACWY 的免疫原性组合物，包括与上述那些相似组分的试剂盒任选地包含来自麻疹和/或腮腺炎和/或风疹和/ 或水痘的抗原。例如，脑膜炎球菌免疫原性组合物含有来自麻疹、腮腺炎和风疹或麻疹、腮腺炎、风疹和水痘的抗原。在一个实施方案中，这些病毒抗原任选地存在于与脑膜炎球菌和 /或Hib糖缀合物相同的容器中。在一个实施方案中，将这些病毒抗原冻干。本发明的另一方面是制备本发明的免疫原性组合物的方法，其包括将Hib糖缀合物与至少一种额外的细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合而形成组合物的步骤，其中Hib缀合物的糖剂量小于5 μ g 或4 μ g，或1-4 μ g或1-3 μ g，或2-4 μ g或2_3 μ g之间或者约或刚好2. 5 μ g，并且任选地， 至少或刚好1、2、3或4种额外的细菌(如脑膜炎奈瑟氏球菌)糖缀合物或其每一种的糖剂 fi /h T 10 μ g>9 μ g>8 μ g>7 μ g>6 μ g>5 μ g 4 μ g> 1—10 μ g>l~8 μ g>l~6 μ g>l"5 μ g、1-4 μ g、1-3 μ g、或 2-4 μ g 或 2-3 μ g 之间或约或刚好 2. 5 μ g。本发明另一方面是免疫人宿主以抗流感嗜血杆菌和任选地脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，其包括对宿主施用免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物，其用于治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病。本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒用于生产治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的药物的用途。如本文所用的术语“包含”和“包括”被发明人意在与术语“由...组成”和“组成为”在每一方面可以任选地替代。本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请都引入本文作为参考。在附随的实施例中阐明本发明。除了另外详细描述的之外，使用本领域技术人员公知和常规的标准技术进行下面的实施例。这些实施例是举例说明性的，并且不限定本发明。
具体实施方案实施例实施例1-多糖缀合物的制备通过Chu等人anfection and Immunity 1983,40(1) ；245-256)开发的偶联化学方法进行流感嗜血杆菌(Hib)PRP多糖与TT的共价结合。通过加入CNBr并在ρΗΙΟ. 5温育 6分钟活化Hib PRP多糖。将pH降低到pH8. 75并加入己二酸二酰胼(ADH)并继续温育90 分钟。使用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)通过碳化二亚胺缩合将活化的PRP偶联到纯化的破伤风类毒素。加入EDAC到活化的PRP以达到0. 6mg EDAC/ mg活化的PRP的最终比例。调节pH到5.0并加入纯化的破伤风类毒素至达到aiig TT/mg 活化的PRP。将所得溶液在温和搅拌下放置3天。通过0.45 4!11膜过滤后，在用0.211 NaCl 平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S500HR(Wiarmacia，Sweden)柱上纯化缀合物。使用(通过MALLS测量在150kDa以上的)天然多糖或者通过温和微流化产生 MenC-TT缀合物。使用天然多糖或者如通过实施例2的方法测量的60kDa以上温和微流化的多糖产生MenA-TT缀合物。使用如通过MALLS测量的约100-200kDa的按大小分级的多糖产生MenW和MenY-TT缀合物(见实施例2)。使用勻浆器Emulsiflex C-50装置通过微流化进行按大小分级。然后通过0.2μπι滤器过滤多糖。如W096/29094和WO 00/56360中所述的进行活化和偶联。简言之，将2Μ NaCl pH 5. 5-6. 0中10-20mg/ml浓度的多糖与CDAP溶液(用乙腈/WFI50/50新鲜制备的IOOmg/ ml)混合至最终CDAP/多糖比例为0.75/1或1.5/1。1. 5分钟后，用氢氧化钠升高pH到 pH10.0o 3分钟后，加入破伤风类毒素以达到糖/蛋白质比例对于MenW为1.5/1，对于MenY 为1. 2/1，对于MenA为1. 5/1或对于MenC为1. 5/1。反应持续1到2小时。在偶联步骤之后，加入甘氨酸至甘氨酸/PS(w/w)最终比例为7. 5/1并调节pH到 PH9.0。将混合物放置30分钟。使用10 μ m Kleenpak滤器澄清缀合物，然后装载到聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱上，使用150mMNaCl，IOmM或5mM Tris pH7. 5的洗脱液。在Opticap 4无菌膜上过滤临床批号。得到的缀合物的平均多糖蛋白质比例为1 1-1 5(w/w)0
为了通过间隔基将MenA荚膜多糖缀合到破伤风类毒素，使用下面的方法。通过偶联化学方法进行多糖和间隔基(ADH)的共价结合，通过该方法，在受控的条件下通过氰化 (cyanylating)试剂四氟硼酸1_氰基_4_ 二甲基氨基吡啶馈(CDAP)活化多糖。使间隔基通过它的胼基与氰化的PS反应，在间隔基和多糖之间形成稳定的异脲。用新鲜制备的乙腈/水(50/50(v/v))中的100mg/ml CDAP溶液处理10mg/ml MenA 溶液得到CDAP/MenA比例为0. 75 (w/w)。1. 5分钟后，升高pH到pH 10. O。3分钟后，加入 ADH得到ADH/MenA比例为8. 9。降低溶液的pH到8. 75并且进行反应2小时。在缀合反应前，将纯化的TT融合和将PSAah溶液稀释而达到10mg/ml的PSAah浓度和10mg/ml的TT浓度。向PSAah溶液中加入EDAC以便达到0. 9mg EDAC/mg PSAah的最终比例。调节pH到 5.0。用蠕动泵(60分钟内)加入纯化的破伤风类毒素达到aiig TT/mg PSAah。将所得溶液在+25°C在搅拌下放置60分钟，得到120分钟的最终偶联时间。使用10 μ m滤器澄清缀合物并用聚丙烯酰胺葡聚糖S400HR柱进行纯化。实施例2-使用MALLS测定分子量将检测器连接到HPLC大小排阻柱，从其洗脱样品。一方面，激光散射检测器在16 个角度处测量大分子溶液散射的光强度，另一方面，在线放置的干涉测量折射计允许测定洗脱的样品的量。从这些强度可以测定溶液中大分子的大小和形状。以重量计的平均分子量(Mw)被定义为所有物种的重量乘以它们各自的分子量的和并除以所有物种重量之和。a)重量-平均分子量-Mw-[
0123]
权利要求
1.免疫原性组合物，其包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物以及选自由全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原组成的组的另一抗原，其中Hib 糖缀合物的糖剂量小于5 μ g。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中至少一种额外的细菌，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物或者其每一种的糖剂量小于6 μ g。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中至少一种额外的细菌，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌的糖缀合物包含来自选自血清群A、B、C、W135和Y的菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜糖。
4.权利要求3的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)。
5.权利要求3或4的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖 (MenA)。
6.权利要求3-5中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)。
7.权利要求3-6中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW)。
8.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含DT、TT、Pw和!fepB。
9.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B外膜泡制剂。
10.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含来自选自血清群1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
11.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其包含伤寒沙门氏菌荚膜糖。
12.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中相同的载体蛋白被用于Hib缀合物和所述的至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物或其每一种。
13.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中Hib糖被缀合到选自TT、DT、 CRM197、TT的片段C、蛋白D、0MPC和肺炎链球菌溶血素的载体蛋白。
14.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖或其每一种被缀合到选自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白D、0MPC和肺炎链球菌溶血素的载体蛋白。
15.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中在Hib糖缀合物中Hib与载体蛋白的比例为 1 5 到 5 1、1 1到1 4、1 2 到 1 3. 5 或约 1 3 (w/w)。
16.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中Hib糖经由接头被缀合到载体蛋白。
17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述接头是双功能的。
18.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性氨基。
19.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性羧酸基团。
20.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述接头在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基团。
21.权利要求16-20中任一项的免疫原性组合物，其中所述接头具有4到12个碳原子。
22.权利要求16或17的免疫原性组合物，其中所述接头是ADH。
23.权利要求1-22中任一项的免疫原性组合物，其中使用CNBr或CDAP将Hib糖缀合到载体蛋白或接头。
24.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用碳化二亚胺化学方法、任选地使用EDAC化学方法将载体蛋白缀合到Hib糖或接头。
25.前面权利要求任一项的免疫原性组合物，其中脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物或其每一种具有1 5-5 1或1 1-1 4(w/w)的糖载体比例。
26.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖被直接缀合到载体蛋白。
27.权利要求沈的免疫原性组合物，其中至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖是MenW和/或 MenY、Menff 禾口 / 或 MenC、MenY 禾口 / 或 MenC、或 MenW 禾口 MenC 禾口 MenY。
28.权利要求沈或27的免疫原性组合物，其中通过CDAP化学方法将至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖直接缀合。
29.权利要求沈-28中任一项的免疫原性组合物，其中MenW和/或Y糖与载体蛋白的比例为1 0. 5至Ij 1 2。
30.权利要求沈-29中任一项的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例为 1 0. 5 至Ij 1 2。
31.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中经由接头将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合到载体蛋白。
32.权利要求31的免疫原性组合物，其中所述接头是双功能的。
33.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性氨基。
34.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头具有两个活性羧酸基团。
35.权利要求32的免疫原性组合物，其中所述接头在一端具有活性氨基并且在另一端具有活性羧酸基团。
36.权利要求31-35的免疫原性组合物，其中所述接头具有4到12个碳原子。
37.权利要求31或32的免疫原性组合物，其中所述接头是ADH。
38.权利要求31-37任一项的免疫原性组合物，其中通过CDAP化学方法将一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌糖或者其每一种缀合到接头。
39.权利要求31-38中任一项的免疫原性组合物，其中使用碳化二亚胺化学方法，任选地使用EDAC将所述载体蛋白缀合到接头。
40.权利要求31-39中任一项的免疫原性组合物，其中在载体蛋白被缀合到接头之前， 将每种脑膜炎奈瑟氏菌糖或每一种缀合到接头。
41.权利要求31-40中任一项的免疫原性组合物，其中经由接头将MenA缀合到载体蛋白。
42.权利要求41的免疫原性组合物，其中MenA糖与载体蛋白的比例为1 2到1 5。
43.权利要求31-42中任一项的免疫原性组合物，其中通过接头将MenC缀合到载体蛋 白。
44.权利要求43的免疫原性组合物，其中MenC糖与载体蛋白的比例为1 2到1 5。
45.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenA糖存在时，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 50-100kDa、55_90KDa 或 60_80kDa 的平均大小。
46.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenC糖存在时，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 100_200kDa、100_150kDa 或 150_200kDa 之间的平均大
47.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenY糖存在时，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90_160kDa、 100-150kDa或110_140kDa之间的平均大小。
48.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenW糖存在时，其具有高于 50kDa、75kDa、IOOkDa 的分子量或者 60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90_160kDa、 100-150kDa或110_140kDa之间的平均大小。
49.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenC存在时，其被至少部分地 0-乙酰化，使得至少30%的重复单位在至少一个位置被0-乙酰化。
50.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenY存在时，其被至少部分地 0-乙酰化，使得至少20%的重复单位在至少一个位置被0-乙酰化。
51.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenW存在时，其被至少部分地 0-乙酰化，使得至少30%的重复单位在至少一个位置被0-乙酰化。
52.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中当MenA存在时，其被至少部分地 0-乙酰化使得至少50%的重复单位在至少一个位置被0-乙酰化。
53.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中hib糖缀合物和至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物不被吸收到铝盐上。
54.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其是无佐剂的。
55.前面权利要求中任一项的免疫原性组合物，其被缓冲在pH7.0到8.0之间。
56.疫苗，其包含权利要求1-55中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。
57.用于相伴或者顺序给药的疫苗试剂盒，其包含两种多价免疫原性组合物，该组合物用于在宿主中赋予抗由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌 (Clostridium tetani)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)禾口、流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)引起的疾病的保护，所述试剂盒包含第一个容器和第二个容器，第一个容器包含破伤风类毒素(TT)，和白喉类毒素(DT)，和全细胞百日咳组分，和/或乙型肝炎表面抗原；第二个容器包含含有权利要求1^5中任一项的免疫原性组合物的免疫原性组合物。
58.权利要求57的疫苗试剂盒，其中所述第一个容器还包含吸附到磷酸铝上的乙型肝炎表面抗原。
59.权利要求57或58的疫苗试剂盒，其中所述第一个或第二个容器还包含失活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。
60.用于制备权利要求1-55中任一项的免疫原性组合物的方法，其包括将Hib缀合物与至少一种额外的细菌糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原混合以形成组合物的步骤，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5 μ g并且至少一种额外的细菌糖缀合物或者其每一种的糖剂量小于6 μ g。
61.免疫人宿主以抗脑膜炎的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求 1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
62.免疫人宿主以抗由流感嗜血杆菌引起的疾病的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
63.免疫人宿主以抗由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的方法，其包括对该宿主施用免疫保护剂量的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
64.用于治疗或预防脑膜炎的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
65.用于治疗或预防由流感嗜血杆菌引起的疾病的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
66.用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒。
67.权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防脑膜炎的药物中的用途。
68.权利要求1-59中任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防由流感嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。
69.权利要求1-59任一项的免疫原性组合物、疫苗或者试剂盒在生产用于治疗或预防由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了包含Hib糖缀合物、至少一种额外的细菌如脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物和选自全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的另一抗原的免疫原性组合物，其中Hib糖缀合物的糖剂量小于5μg。
文档编号A61K39/29GK102218138SQ20111014386
公开日2011年10月19日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年6月27日
发明者C·卡皮奥, D·布特里奥, J·普尔曼, P·德内尔, P·迪维维耶, R·L·比曼斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司