专利名称：氢生理盐水在制备治疗急性神经损害疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是氢生理盐水在制备治疗急性神经损害疾病药物中的应用。
背景技术：
马尾综合征(Cauda equina syndrome, CES)是马尾神经损害导致下肢疼痛、运动感觉障碍，大、小便、性功能及鞍区感觉功能障碍为典型症状、体征的一组症侯群。临床上描述马尾受到压迫后继发产生的CES为“全面爆发综合征”，早期症状比较轻微，可能仅表现为腰腿痛，一旦发生CES则多种症状同时出现，需急诊手术治疗，错过手术时机，即使手术解除马尾压迫，运动功能大多数能够恢复，但大、小便、性功能及鞍区感觉障碍难以恢复，患者往往因为就诊时间延误而不能及时手术，致残率非常高。马尾神经具有特殊的解剖位置， 是脊髓和周围神经的桥梁，连接脊髓神经元和背根神经节假单极神经元，马尾神经受压迫后，其局部病理改变如不能得到及时改善，则形成恶性循环，发生继发性的损害，不仅马尾神经自身发生变性，还可产生顺行性背根神经节细胞变性、逆行性脊髓神经元变性，造成永久性的神经功能损害。马尾神经“全面爆发性”损害的病理生理机制目前还不明确，但继发性氧化应激损伤而发生神经元凋亡越来越引起学者的重视，氧化应激损伤能解释马尾综合征的“全面爆发”特性。目前临床上治疗急性神经损伤最常用药物为甲强龙，其作用机制为非特异性抗炎症反应，能够抑制炎性物质的产生和抗氧化应激损伤而减轻神经继发损害，其治疗作用得到了较广泛的认可，但它的副作用较大且价格昂贵也让人担忧。近期，氢气的选择性抗氧化效应的发现使人们意识到氢气对氧应激损伤具有潜在的应用价值。在脑、心肌、肝脏、肾、小肠缺血再灌注损伤、化疗药物肾损伤、尿毒症血液透析等研究中，发现呼吸氢气或注射氢生理盐水都具有抗氧应激损伤作用而抑制了这些重要脏器的严重损伤。氢生理盐水(溶解有氢气的生理盐水)是否对马尾压迫急性损伤后发生的氧化应激反应具有对抗作用，从而有效抑制急性神经损害，目前尚无报道。中国专利公开号CN101347451A公开了一种具有治疗缺血再灌注损伤功能的含氢注射液，该发明是一种可用于治疗脑、心、肾等组织器官缺血再灌注损伤的注射液。制备方法为将医用注射液软包装袋置于低压下脱气处理，抽除气体后进行低温预处理，再注入氢气进行加压助溶，使氢气溶于注射液，在常压4°C左右保存备用，稳定M小时后就可使用。 但是关于氢生理盐水在制备治疗急性神经损害疾病药物中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种氢生理盐水在制备治疗急性神经损害疾病药物中的应用。本发明的再一的目的是，提供一种含氢口服液在制备治疗急性马尾神经损害疾病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是氢生理盐水在制备治疗急性马尾神经损害疾病药物中的应用。所述的氢生理盐水在制备治疗急性马尾综合征疾病药物中的应用。所述的氢生理盐水中氢气的含量为0. 6mmol/L-饱和。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种含氢口服液在制备治疗急性马尾神经损害疾病药物中的应用。所述的含氢口服液在制备治疗急性马尾综合征疾病药物中的应用。所述的口服液选自纯净水、生理盐水或葡萄糖生理盐水。所述的含氢口服液中氢气的含量为0. 6mmol/L-饱和。本发明优点在于
1、本发明开发了氢生理盐水的新用途，发现了氢生理盐水具有和甲强龙相似的急性神经损伤保护作用，通过抑制氧化应激反应减少马尾神经纤维变性和神经元的凋亡，抑制马尾综合征的继发损害，对急性马尾综合征具有治疗效果；
2、氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用， 从动物实验的结果来看具有良好的治疗优势，大大减少急性神经损伤患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本；
3、本发明还开发了一种含氢口服液在制备治疗急性马尾综合征的保健品中的新用途， 含氢口服液制备简单，方便病人饮用，且无毒副作用，具有很好的治疗急性马尾综合征的优势。
图1是各组的脊髓、马尾和背根神经节HE染色对比(HE X400)。图1A.各组的马尾神经HE染色对比；图1B.各组的脊髓神经HE染色对比；图1C.各组的背根神经节HE染色对比。压迫组脊髓细胞周围间隙扩大、大量细胞核固缩甚至消失形成凋亡小体，马尾神经纤维结构松散、肿胀、脱髓鞘改变，背根神经节细胞核固缩甚至消失形成凋亡小体，神经纤维肿胀、脱髓鞘改变。氢水组、甲强龙组和混合组的脊髓、马尾、背根神经节形态均较接近正常组织形态，少量细胞出现核偏移、固缩、神经纤维肿胀、脱髓鞘改变。图1-1 假手术组马尾神经纤维轴突和髓鞘结构良好；
图1-2 压迫组马尾神经纤维松散，部分轴突及髓鞘肿胀、脱髓鞘改变； 图1-3 氢水组马尾神经纤维少部分轴突及髓鞘肿胀、脱髓鞘改变； 图1-4 甲强龙组马尾神经部分轴突及髓鞘肿胀、脱髓鞘改变； 图1-5 混合组组马尾神经纤维少部分轴突及髓鞘肿胀、脱髓鞘改变； 图1-6 假手术组脊髓神经细胞与周围组织无分离，细胞核位于胞浆中央； 图1-7 压迫组脊髓神经细胞与周围组织空隙增大，细胞核固缩甚至消失； 图1-8 氢水组脊髓神经细胞与周围组织无分离，部分核偏移，个别凋亡小体； 图1-9 甲强龙组脊髓神经细胞与周围组织无分离，部分核偏移，未见凋亡小体； 图1-10 混合组脊髓神经细胞与周围组织无分离，部分核收缩，未见凋亡小体； 图1-11 假手术组背根神经节无凋亡小体，神经纤维无髓鞘肿胀、脱髓鞘； 图1-12 压迫组背根神经节出现凋亡小体，部分神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘；图1-13 氢水组背根神经节未见凋亡小体，少量神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘； 图1-14 甲强龙组背根神经节可见充血，细胞形态较好，无凋亡小体； 图1-15 混合组背根神经节未见凋亡小体，部分神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘。图2是各组的脊髓和背根神经节的Caspase染色对比(CaSpaSe3 X200)。图 2A.各组的脊髓的Caspase染色对比；图2B.各组的背根神经节的Caspase染色对比。压迫组可见大量胞浆棕黄色染色的阳性细胞。氢水组、甲强龙组和混合组阳性细胞数量明显少于压迫组。图2-1 假手术组脊髓未见阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-2 压迫组脊髓可见大量阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-3 氢水组脊髓可见少量阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-4 甲强龙组脊髓可见部分阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-5 混合组脊髓可见部分阳性胞浆棕黄色染色细胞；
图2-6 假手术组背根神经节未见阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-7 压迫组背根神经节可见大量阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-8 氢水组背根神经节可见少量阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-9 甲强龙组背根神经节可见少量阳性胞浆棕黄色染色细胞； 图2-10 混合组背根神经节可见部分阳性胞浆棕黄色染色细胞。图3是各组马尾神经的NF染色对比(NF X400)。图3A.假手术组、压迫组和氢水组马尾神经的NF染色对比；图;3B.甲强龙组和混合组马尾神经的NF染色对比。压迫组可见少量神经纤维染色为棕黄色强阳性，大部分为弱阳性和阴性。氢水、甲强龙组和混合组可见大量神经纤维为强阳性染色。正常组全部为强阳性染色。图3-1 假手术组马尾神经横切面可见轴突全部棕黄色阳性染色，包裹的鞘膜为蓝角·
JUL，
图3-2 假手术组马尾神经纵切面可见轴突全部棕黄色阳性染色，夹杂蓝色的鞘膜细胞核；
图3-3 压迫组马尾神经横切面可见轴突少量棕黄色强阳性染色，大量为弱阳性或阴性染色；
图3-4 压迫组马尾神经纵切面可见轴突少量棕黄色强阳性染色，大量为弱阳性染色； 图3-5 氢水组马尾神经横切面可见轴突大量棕黄色阳性染色，少量阴性染色； 图3-6 氢水组马尾神经纵切面可见轴突大量棕黄色阳性染色，少量为阴性染色； 图3-7 甲强龙组马尾神经横切面可见轴突大部分棕黄色阳性染色； 图3-8 甲强龙组马尾神经纵切面可见轴突大部分棕黄色阳性染色； 图3-9 混合组马尾神经横切面可见轴突部分棕黄色阳性染色； 图3-10 混合组马尾神经纵切面可见轴突部分棕黄色阳性染色。图4是各组脊髓和背根神经节的Tunel染色对比(Tunel X 200)。图4A.各组脊髓组织的Tunel染色对比；图4B.各组背根神经节的Tunel染色对比。压迫组可见大量细胞核棕黄色阳性染色。氢水组、甲强龙组和混合组阳性细胞数量明显少于压迫组。图4-1 假手术组脊髓可见个别阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-2 压迫组脊髓可见大量阳性胞核棕黄色染色神经细胞；图4-3 氢水组脊髓可见少量阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-4 甲强龙组脊髓可见少数阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-5 混合组脊髓可见部分阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-6 假手术组背根神经节未见阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-7 压迫组背根神经节可见大量阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-8 氢水组背根神经节可见少量阳性胞核棕黄色染色神经细胞； 图4-9 甲强龙组背根神经节细胞可见部分阳性胞核棕黄色染色； 图4-10 混合组背根神经节细胞可见部分阳性胞核棕黄色染色。图5是各组脊髓和背根神经节的Bax染色对比(Bax X 400)。图5A.各组脊髓组织的Bax染色对比；图5B.各组背根神经节的Bax染色对比。压迫组可见大量胞浆棕黄色阳性染色细胞。氢水组、甲强龙组和混合组阳性细胞数量明显少于压迫组。图5-1 假手术组脊髓组织可见少量细胞胞浆染色为棕黄色； 图5-2 压迫组脊髓组织可见大量细胞胞浆染色为棕黄色；
图5-3 氢水组脊髓组织可见少量细胞胞浆染色为棕黄色； 图5-4 甲强龙组脊髓组织可见少量细胞胞浆染色为棕黄色； 图5-5 混合组脊髓组织可见少量细胞胞浆染色为棕黄色； 图5-6 假手术组背根神经节未见胞浆棕黄色的阳性细胞； 图5-7 压迫组背根神经节可见大量胞浆棕黄色的阳性细胞； 图5-8 氢水组背根神经节可见部分胞浆棕黄色的阳性细胞； 图5-9 甲强龙组背根神经节可见部分胞浆棕黄色的阳性细胞； 图5-10 混合组背根神经节可见部分胞浆棕黄色的阳性细胞。图6是各组BBB评分变化对比(Oh为正常组和假手术组)。图7是各组热板实验大鼠缩足潜伏期时间对比(Oh为正常组和假手术组)。图8 各组脊髓、马尾和背根神经节MDA水平变化对比。图8-1 各组脊髓MDA含量变化(Oh为正常组)； 图8-2 各组马尾MDA含量变化(Oh为正常组)；
图8-3 各组背根神经节MDA含量变化(Oh为正常组)。图9是各组脊髓、马尾和背根神经节GSH水平变化对比。图9-1 各组脊髓GSH含量变化(Oh为正常组)； 图9-2 各组马尾GSH含量变化(Oh为正常组)；
图9-3 各组背根神经节GSH含量变化(Oh为正常组)。图10是各组脊髓和背根神经节的Caspase 3阳性指数对比。图11是各组脊髓和背根神经节的Bax阳性指数对比。图12是各组马尾神经的NF阳性纤维率(NF染色阳性率)对比。图13是各组脊髓和背根神经节的Tunel凋亡指数对比。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例11.材料和方法 (1)动物
健康雄性SD大鼠，年龄为8-9周，体重为200-250g。动物饲养于鼠笼中，饲养条件自由饮食，光/暗周期为12h/12h，背景噪音小于(40士 10)db，饲养温度为(22士4) °C。实验动物先予一周的时间适应环境，手术前12小时禁食水。(2)氢生理盐水的制作
将氢气在6小时0. 4 MPa气压下溶解于生理盐水中，而后常压储存于无空腔的铝包中，置于4°C冰箱保存，氢生理盐水采用Y射线消毒。为保证氢生理盐水中氢的含量略高于0. 6 mmol/L,氢生理盐水每周配置一次，并通过Ohsawa等作者的检测方法用气体光谱分析对氢盐水的氢含量进行检测(详见0hsawa I，Nishimaki K, Yamagata K, et al. Consumption of hydrogen water prevents atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377(4):1195-1198.)
2.实验设计
(1)实验分组
①假手术组(即对照组，仅行L5棘突和L5/6间隙黄韧带的切除后关闭伤口，预前实验中和正常对照组无差异)；②压迫组；③氢生理盐水治疗组(简称氢水组)；④甲强龙治疗组 (简称甲强龙组);⑤氢生理盐水和甲强龙混合治疗组(简称混合组)。每组只。假手术组和压迫组予以生理盐水腹腔注射；氢生理盐水治疗组予以氢生理盐水5ml/kg腹腔注射， 3次/日；甲强龙治疗组采用30mg/Kg甲强龙一次性腹腔注射；混合治疗组为氢生理盐水和甲强龙共同使用。每隔他行膀胱按摩一次。术后每日青霉素4万单位腹腔内注射预防感
^fe ο马尾神经压迫模型建立方法10%水合氯醛(0. 3ml/100g)腹腔注射麻醉，显露大鼠L5-L6的棘突和椎板，切除L5的棘突，尖嘴钳扩大L5/6椎间隙，并切除L5/6间隙的黄韧带，向头端塞入10. OX 1.0X 1.3mm硅胶条1根，手术过程注意不损伤硬膜囊。假手术组仅行L5棘突和L5/6间隙黄韧带的切除后关闭伤口。(详见Jekiguchi M, Kikuchi S, Myers R R. Experimental spinal stenosis relationship between degree of cauda equina compression, neuropathology, and pain[J]. Spine (Phila Pa 1976)，2004，29(10):1105-1111.和Watanabe K, Konno S, Sekiguchi Μ, et al. Spinal stenosis: assessment of motor function, VEGF expression and angiogenesis in an experimental model in the rat[J]. Eur Spine J, 2007, 16(11):1913-1918.)
(2)组织取材
分别于术后:3h、6h、12h、Mh、48h、7a!将行为学评价后的大鼠每组抽取4只，麻醉后行手术切除椎板，暴露椎管，截取T13-L1段脊髓、L4-L6段马尾神经及L5、L6双侧背根神经节， 清洗干净后，立刻放入液氮中保存，以备MDA (丙二醛)和GSH检测。另于4 每组抽取4 只大鼠，麻醉后，经左心室-升主动脉插管，先注射肝素生理盐水后，室温生理盐水约100ml 冲洗血管，剪开右心耳，使静脉积血流出，至流出液变清，继而加压灌注4%多聚甲醛溶液约 300ml，待皮肤粘膜变白、肢体僵硬后，手术后路切除椎板，暴露椎管，截取T13-L1段脊髓、 L4-L6段马尾神经及L5、L6双侧背根神经节，放入4%多聚甲醛固定Mh，石蜡包埋，脊髓行垂直于长轴横向切片，马尾和背根神经节分别行横向和纵向切片，片厚4 μ m,备行HE、NF、Caspases 3、Bax 及 Tunel Ife0(3)行为学观察
分别于术后Μι、1 ι、24Κ4 ι、7 ι行BBB评分和热板实验评价。BBB评分中观察者为非本组实验人员，且对评分标准十分熟悉。评价前所有动物应检查膀胱是否充盈，以免因膀胱充盈而影响活动。大鼠置于开阔场地观察5分钟，采用双人独立观察记录，每只大鼠的后肢，评分为双侧后肢的平均值，最后取双人的平均值为准。热板实验根据Eddy和Leimbach确立的方法进行。(详见Eddy N B, Leimbach D. Synthetic analgesics. II. Dithienylbutenyl and dithienylbutylamines[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1953，107 (3) : 385-393.)将热板仪温度调节于(55. 0士0. 5) °C，选取基础痛阈5-20s的大鼠，记录自大鼠放在热板仪至其舔咬后爪的时间，即缩足潜伏期(PWL， paw-withdrawal latency),以此时间为痛阈指标。术前测量3次，取均值作为基础痛阈。经过热板实验的筛选，反应异常鼠被剔除。每只大鼠均行3次，每次至少相隔5 min以上，取其平均值作为基础PffL值。为防止大鼠后爪被烫伤，确定30s为中断时间(Cut-off值)，超过30s按30s计算。测试时力求保持热板表面清洁干燥，遇有大鼠粪便和尿液污染时则及时清除。(4)生化检测分析
MDA的水平可以反应脂质氧化的程度。MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物的显色反应，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，随后通过比色法进行定量检测。检测严格按照“脂质氧化(MDA)检测试剂盒”(中国上海碧云天生物科技有限公司，编号S0131)说明书的操作规程进行。GSH是重要的抗氧化物，在对抗氧自由基过氧化中发挥着重要作用。GSH含量是用 DTNB法测定。检测严格按照“GSH/GSSG检测试剂盒”(中国上海碧云天生物科技有限公司， 编号S0053)说明书的操作规程进行。( 5)组织学和免疫组化
通过HE染色可以观察马尾、脊髓及背根神经节的病理改变。NF染色即神经纤维蛋白染色，可以观察马尾神经纤维的形态及数量，正常神经纤维为阳性染色，神经纤维受损害后，神经纤维蛋白发生变性而染色为阴性。NF染色方法采用 ELPS 法(Enhance Labelled Polymer System)，也称 EnVision 法，是利用一种多聚化合物，将HRP或AP和第二抗体(抗鼠或抗兔IgG)同时标记在一个多聚化合物上，即形成酶-多聚化合物-第二抗体巨大复合物，而后采用DAB显色。染色操作规程按照“NF抗体试剂盒” (丹麦DAKO公司，编号M0762))的说明书进行。Caspase 3是细胞凋亡过程中的一个关键酶，在细胞核凋亡过程中具有关键作用。 Caspase 3的活性观察也采用ELPS法免疫组化染色。染色操作规程按照“caspase 3抗体试剂盒”(美国santa cruz公司，编号SC-623))的说明书进行。Bax可以激活caspase系统，促使细胞发生凋亡。Bax检测采用“ABC”染色法，又称卵白素-生物素-酶复合物染色法。将特异性一抗与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素花桥与一抗结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化物酶链接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。染色操作规程按照“Bax抗体试剂盒” (英国ABCAM公司，编号ab5714)的说明书进行。
细胞凋亡采用Timel法检测，即末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TdT-mediatedX-dUTP nick end labeling)，细胞凋亡时双链DNA会出现许多不对称的断裂点，暴露出3’ -0H,末端转移酶(TDT)，可催化地高辛，生物素或荧光素等标记的脱氧核苷酸加到3’ -OH末端，再通过免疫组化方法进行检测。染色操作规程按照“Timel试剂盒” (美国Trevigen公司，编号cat#4^8-30_DK)的说明书进行。(6)细胞计数
NF染色用阳性神经纤维率进行评价在40倍光镜下每张马尾组织横切面切片分别随机选5个视野，计算阳性神经纤维数目和阴性神经纤维数目，阳性神经纤维率=阳性神经纤维数/ (阳性神经纤维数+阴性神经纤维数)X 100%。Caspase3和Bax用阳性指数来评价以细胞棕黄色染色为阳性，蓝色或不着色为阴性。应用计算机图像管理分析系统进行图像采集与分析，将免疫组化染色结果先转化为灰度值，再转换为阳性指数进行半定量分析。阳性指数越大，代表阳性产物表达程度越强。Tunel评价指标为凋亡指数(apoptosis index, Al)在光镜下随机选择5个高倍视野计数阳性细胞数，除以该视野总细胞数，即得到凋亡指数(AI=视野内凋亡细胞个数/ 视野内所有神经细胞X 100%)。(7)统计学分析
所有数据用均数士标准差表示，用统计软件SPSS处理，多组数据用ANOVA 分析；若方差不齐，采用非参数统计检验。/Y0. 05视为统计学差异显著，/YO. 01为统计学差异非常显著。实验结果
(1)氢生理盐水和甲强龙均能改善急性马尾压迫造成的运动感觉障碍。BBB评分反映了大鼠马尾神经受压后的运动功能变化，正常组、假手术组和术前各治疗组BBB评分均为21分(0h)，6h-24h压迫组明显低于正常对照组，氢水组、甲强龙组和混合组明显高于压迫组Gd <0.01) ；6h时氢水组和混合组明显高于甲强龙组Gd < 0. 05)， 24h甲强龙组评分稍高于氢水组，但无统计学差异；1池-7池甲强龙组、氢水组、混合组无统计学差异(/^)0.05)(见图6)。热板实验检测了大鼠马尾神经受压后的感觉功能变化，正常组、假手术组和术前各治疗组的缩足潜伏期时间(Oh)无统计学差异，他-7池压迫组明显高于正常对照组，氢水组、甲强龙组和混合组明显低于压迫组(P < 0. 05)。他-7池甲强龙组、混合组及氢水组之间无明显统计学差异0°〉0.05)(见图7)。(2)氢生理盐水和甲强龙均降低了 MDA的水平。脊髓、马尾和背根神经节的MDA检测结果示(图中Oh为正常组)3h-72h压迫组明显高于正常组，氢水组、甲强龙组和混合组MDA含量明显低于压迫组(/Y0. 01)；氢水组、 甲强龙组和混合组之间无明显统计学差异Gd〉0. 05)(见图8-1、图8-2和图8-3)。(3)氢生理盐水和甲强龙均提高了 GSH水平
GSH检测结果示(图中Oh为正常组)池-7池压迫组明显低于正常组，3h-24h氢水组、 甲强龙组和混合组脊髓GSH含量明显高于压迫组(/Y0. 05 )，48h和72h间无明显差异〉 0. 05)，池-7池氢水组、甲强龙组和混合组的马尾和背根神经节GSH含量明显高于压迫组 (/Y0. 05);汕-7浊氢水组、甲强龙组和混合组之间无明显统计学差异0°〉0. 05)(见图9-1、图9-2和图9-3)。(4)氢水组、甲强龙组和混合组的病理变化比压迫组更好
HE染色光镜下见正常组马尾神经纤维致密有序，轴突无肿胀，雪旺氏细胞核整齐有序， 髓鞘完整，中间夹杂少量结缔组织和血管。压迫组马尾神经纤维松散，部分轴突及髓鞘肿胀、脱髓鞘改变。氢水组、甲强龙组和混合组马尾神经纤维紧密，少量轴突肿胀、脱髓鞘改变。正常组脊髓组织神经元细胞与周围胶质细胞、神经纤维结构紧密有序，细胞未见收缩，细胞核及胞浆形态正常。压迫组脊髓组织神经元细胞出现收缩，周围间隙明显扩大， 细胞核固缩甚至消失，可见部分凋亡小体。氢水组、甲强龙组和混合组的脊髓组织绝大部分神经元细胞未见明显收缩，细胞核清晰，但部分细胞核偏移，可见个别凋亡小体。正常组背根神经节细胞及神经纤维结构紧密有序，未见节内神经纤维轴突肿胀、 髓鞘肿胀、脱髓鞘等改变。压迫组背根神经节细胞松散，个别出现凋亡小体，部分神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘。氢水组、甲强龙组和混合组背根神经节细胞紧密，未出现凋亡小体，偶可见红细胞积聚，少部分神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘(见图1-1至图1-15)。(5)氢水组、甲强龙组和混合组的Caspases 3阳性指数比压迫组更低
光镜下观察，Caspase 3染色阳性典型表现为胞浆棕黄色，细胞核为蓝色，镜下散在的棕黄色小圆点也是阳性表现。在正常组脊髓和背根神经节组织中，未见阳性的胞浆棕黄色染色细胞。压迫组脊髓和背根神经节组织可见大量棕黄色阳性染色。氢水组、甲强龙组和混合组的脊髓和背根神经节组织可见少量阳性的棕黄色染色(见图2-1至图2-10)。压迫组脊髓和背根神经节的阳性指数均明显大于正常组(P < 0.01)；氢水组、甲强龙组和混合组脊髓和背根神经节的阳性指数均明显小于压迫组(P < 0. 05)；氢水组、甲强龙组和混合组之间无明显统计学差异(P > 0. 05)(见图10)。(6)氢水组、甲强龙组和混合组的Bax阳性指数比压迫组更低
光镜下观察，Bax染色阳性为胞浆棕黄色，部分细胞核也可染色。在正常组脊髓和背根神经节组织中，可见少量阳性的胞浆棕黄色染色细胞。压迫组脊髓和背根神经节组织可见大量阳性的胞浆棕黄色染色细胞。氢水组、甲强龙组和混合组的脊髓和背根神经节组织可见部分阳性的棕黄色染色(见图5-1至图5-10)。压迫组脊髓和背根神经节的阳性指数均明显大于正常组，P <0.01 ；氢水组、甲强龙组和混合组脊髓和背根神经节的阳性指数均明显小于压迫组(P <0.01)；氢水组、甲强龙组和混合组和之间无明显统计学差异(P > 0. 05)(见图11)。(7)氢水组、甲强龙组和混合组的NF阳性率比压迫组更高
光镜下观察，可见正常组马尾组织中，神经轴突全部为强阳性的棕黄色染色，雪旺氏细胞、髓鞘和血管结缔组织则为阴性的蓝色。压迫组的马尾神经轴突只有少量的强阳性的棕黄色染色，大量为黄色的弱阳性染色或蓝色的阴性染色。氢水组、甲强龙组和混合组可见大量强阳性的棕黄色染色和弱阳性的黄色染色，只有少量的阴性染色(见图3-1至图3-10)。正常组的阳性纤维率100%，压迫组阳性纤维率为(21. 35士2. 38) %，氢水组阳性纤维率为(59. 08士6. 25)%，甲强龙组阳性纤维率为(64. 41 士3. 97) %，混合组阳性纤维率为 (55. 06士4. 74)%，与压迫组相比统计学差异显著(P < 0. 01);氢水组、甲强龙组和混合组之间相比无明显统计学差异(P >0.05)(见图12)。
(8)氢水组、甲强龙组和混合组的Tunel凋亡指数比压迫组更低
光镜下观察，Tunel染色阳性典型表现为胞核棕黄色。在正常组脊髓和背根神经节组织中可见个别阳性细胞；压迫组的脊髓和背根神经节中可见大量阳性细胞；氢水组、甲强龙组和混合组脊髓和背根神经节组织可见少量阳性细胞(见图4-1至图4-10)。压迫组脊髓和背根神经节的凋亡指数均明显大于正常组，P <0.01 ；氢水组、甲强龙组和混合组脊髓和背根神经节的凋亡指数均小于压迫组，P <0.01 ；氢水组、甲强龙组和混合组之间无明显统计学差异(P > 0. 05)(见图13)。讨论
本发明发现，急性马尾综合征大鼠的氧化应激指标在池即迅速增强，4 达到高峰，并与动物行为学、神经纤维损伤和细胞凋亡的改变一致。氢生理盐水、甲强龙或两者混合治疗后，均能在48h内明显改善大鼠的行为学评分，降低脂质氧化水平，具有较好的脊髓、马尾及背根神经节的组织形态，减少了马尾神经纤维变性，减少了神经元凋亡。氢生理盐水和甲强龙在马尾综合征中均具有抗氧化应激、抑制神经纤维变性及抗神经元凋亡作用，氢生理盐水具有和甲强龙相似的急性神经损伤保护作用。马尾综合征的继发性损害和氧化应激导致的细胞凋亡密切相关。临床上由于腰椎间盘突出、腰椎管狭窄等马尾神经受到压迫原因而导致发生CES的发病率为1.6-8%，马尾受压并不都出现CES，但鞍区感觉障碍和大小便、性功能障碍一旦出现就难以恢复，说明短期内发生了不可逆的神经细胞损害。马尾神经受压后病理生理变化达到一定程度时，逆行性、顺行性和跨细胞性凋亡在很短时间内发生并迅速扩散可以合理解释“全面爆发综合征”，而跨细胞的神经元凋亡与马尾受压迫后产生的炎症反应关系密切，炎症反应造成损伤的重要机制之一就是氧化应激损害。本发明中急性马尾综合征大鼠的氧化应激指标在池即迅速增强，4 达到高峰，并与动物行为学、神经纤维损伤和细胞凋亡的改变一致，说明了急性马尾综合征的继发损害与氧化应激有直接的关联，也为临床对于CES采取急诊手术治疗提供了理论依据。氢生理盐水和甲强龙通过抑制氧化应激反应而减少了马尾神经纤维变性和神经元的凋亡，抑制了马尾综合征的继发损害，对急性马尾综合征具有治疗效果，也说明了氧化应激反应在急性马尾综合征的继发损害中发挥着重要作用。氢生理盐水与甲强龙相比，应该具有更好的治疗优势。甲强龙是目前临床广泛应用的急性神经损害保护药物，属于糖皮质激素，其作用机制为非特异性抗炎症反应，能够抑制炎性物质的产生、降低脂质氧化水平而减轻神经继发损害，其治疗作用得到广泛认可，但不足之处是副作用较大且价格昂贵。甲强龙大剂量冲击可能造成心律失常甚至心脏骤停死亡，即使普通剂量也可能造成精神异常、消化道溃疡、感染、高血糖、高血压、眼压升高、电解质紊乱、内分泌紊乱、股骨头坏死等并发症。甲强龙的使用每年产生了高额的医疗费用，在中国，一位60kg体重患者Mh甲强龙大剂量冲击治疗花费约为400美元，4 约为700美元，并且要使用普通剂量维持一周或者更久并逐渐减量才能停药。氢气过去被认为是爆炸性的危险气体，但被发现具有选择性清除羟自由基和过氧化硝酸盐能力后被作为吸入性治疗气体得到了学者们的关注。呼吸氢气存在设备使用的困难、人体吸收浓度低及可能发生爆炸风险，然而氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，每袋氢生理盐水的成本在几美元，且目前动物研究中报道氢生理盐水大剂量口服20ml/kg/day连续应用 28天也无副作用。从动物实验的结果来看氢生理盐水具有良好的治疗优势，即使其疗效类似于甲强龙，也将大大减少急性神经损伤患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本。中国专利公开号CN101347451A公开了一种具有治疗缺血再灌注损伤功能的含氢注射液，该发明是一种可用于治疗脑、心、肾等组织器官缺血再灌注损伤的注射液。该发明提出氢生理盐水注射液可减少大鼠局灶性脑缺血后脑梗死的体积、减少神经细胞损伤、减少细胞凋亡数量、降低皮层和海马中的凋亡酶活性，可用作治疗脑、心、肾等重要器官缺血再灌注损伤的药物。上述文献虽然也提到氢生理盐水可以减少神经细胞损伤，但大脑神经元细胞属于高级中枢神经元，而马尾神经属于周围神经，氢生理盐水虽然能够减少大脑神经细胞损伤， 但并不能证明其对马尾神经损伤也有很好的治疗效果，例如利鲁唑，该药能够调节中枢神经系统，具有神经保护作用，但其对马尾神经损伤却没有治疗作用。综上所述，虽然该发明提出氢生理盐水能够减少大脑神经细胞损伤，但并不能由此显而易见的推导出氢生理盐水对急性马尾神经损害具有治疗作用。实施例2含氢口服液的制备
将氢气在6小时0. 4 MPa气压下溶解于纯净水中，保证口服液中氢的含量略高于0. 6 mmol/L,消毒，常压储存于无空腔的铝包或铝罐中，置于4°C冰箱保存。实施例3含氢口服液的制备
将氢气在6小时0. 4 MI^a气压下溶解于生理盐水中，保证口服液中氢的含量略高于0. 6 mmol/L,消毒，常压储存于无空腔的铝包或铝罐中，置于4°C冰箱保存。实施例4含氢口服液的制备
将氢气在6小时0. 4 MPa气压下溶解于葡萄糖生理盐水中，保证口服液中氢的含量略高于0. 6 mmol/L，消毒，常压储存于无空腔的铝包或铝罐中，置于4°C冰箱保存。实施例5含氢口服液的临床试验
材料含氢口服液根据实施例3所述的方法制备；
符合马尾综合征疾病特征的病人30例，随机分成对照组、生理盐水组和含氢口服液组 3组，每组10人。含氢口服液组每日口服含氢口服液1L，纯净水组每日口服生理盐水1L，对照组不给予药物治疗。连续服药8周，疗程结束后进行疗效评价。疗效评价结果见下表1，由表1数据可见，服用含氢口服液8周后，马尾综合征病人的总有效率达到90%，证明含氢口服液具有很好的治疗急性马尾神经损伤的作用，在临床上具有很好的应用价值。
权利要求
1.氢生理盐水在制备治疗急性马尾神经损害疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氢生理盐水在制备治疗急性马尾综合征疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氢生理盐水中氢气的含量为 0. 6mmol/L-饱和。
4.一种含氢口服液在制备治疗急性马尾神经损害疾病保健品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的含氢口服液在制备治疗急性马尾综合征疾病保健品中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的口服液选自纯净水、生理盐水或葡萄糖生理盐水。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的含氢口服液中氢气的含量为 0. 6mmol/L-饱和。
全文摘要
本发明涉及氢生理盐水在制备治疗急性马尾神经损害疾病药物中的应用。本发明还提供一种含氢口服液在制备治疗急性马尾神经损害疾病保健品中的应用。本发明优点在于开发了氢生理盐水的新用途，发现了氢生理盐水具有和甲强龙相似的急性神经损伤保护作用，对急性马尾综合征具有治疗效果；氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用，具有良好的治疗优势，大大减少急性神经损伤患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本；本发明还开发了一种含氢口服液的新用途，含氢口服液制备简单，方便病人饮用，且无毒副作用，具有很好的治疗急性马尾综合征的优势。
文档编号A61K33/00GK102228467SQ20111017123
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者史建刚, 官正茂, 王元 申请人:上海长征医院