专利名称：载蟾蜍灵的环肽修饰的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸纳米粒的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤靶向递送与缓释给药系统技术领域。具体是一种载蟾蜍灵的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸纳米粒，简称为bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD，以及它们的制备方法和应用于制备抗肿瘤药物的用途。
背景技术：
蟾蜍灵(bufalin)是蟾蜍毒素中的主要成分，对多种恶性肿瘤具有良好的治疗效果，但它的毒副作用和低溶解性等缺点，限制了其在临床的进一步应用。近几十年来，以可生物降解的聚合物为载体的递送系统由于其独特的优势而备受国内外关注。将药物包裹在靶向递送载体可以有效地降低药物的毒副作用，提高药物的溶解性，增强药物的靶向性，改善治疗效果。许多像聚乳酸、聚乳酸_羟基乙酸等生物降解材料已经广泛的被用做药物和基因的递送载体，取得了一定的治疗效果。段友容等人发明了 “聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(简称 mPEG-PLGA-PLL)纳米递送系统、制备方法及其应用”(CN 200910247576.7)。该专利公开了 mPEG-PLGA-PLL阳离子聚合物纳米粒递送系统的制备和其应用，聚合物制备的载体纳米粒可用于负载有机药物、水溶性药物、水不溶性抗癌药物或用于诊断用的显影剂等。缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽，简称cRGD，是一种有效的靶向分子，众多实验已经证实其对肿瘤血管具有很好的靶向效果(James D. Byrne, Tania Betancourt, Lisa Brannon-Peppas, Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews,2008,60 1615-1626.)人们期待能够具有上述各种优点的新的抗肿瘤药物。在本发明中，发明人以mPEG-PLGA-PLL为基础材料经过缬氨酸-精氨酸-甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽的修饰成为缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸聚合物(简称mPEG-PLGA-PLL-cRGD)， 然后将蟾蜍灵(bufalin)包裹在mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物中形成以载bufalin的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽(VRGDG，cRGD)修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)纳米给药系统，该系统将能够有效的降低bufalin的毒性，增强其靶向性。由于聚乙二醇单甲醚(mPEG)附着在 mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物载体的表面，mPEG的长链能使纳米载体有效的逃避网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目的，有助于取得较好的治疗效果。可降解聚合物PLGA， 能将bufalin包裹起来，降低其毒性。同时可使bufalin随材料的降解被缓慢释放出来， 从而达到较长时间的治疗效果，且PLGA作为植入材料已获得美国FDA批准。阳离子多聚物聚左旋赖氨酸PLL，生物相容性好，降解产物为人体所必需的氨基酸。多聚左旋赖氨酸复合物仍带正电荷，其结构灵活、稳定、易调整其分子量，可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨架，进而调整和改善载体的性能，达到缓释药物的目的。cRGD是一个有效的靶向分子，众多实验已经证实其对肿瘤血管具有很好的靶向效果。本项目中合成 mPEG-PLGA-PLL-cR⑶聚合物，综合了它们的优点。因此以载蟾蜍灵(bufalin)的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽(VRGDG，cRGD)修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)纳米给药系统将能够有效的降低bufalin 的毒性，增强其靶向性。纳米给药系统的靶向能力是将药物准确递送至靶点并取得良好治疗效果的关键。 bufaline-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米给药系统可以很好的解决这个问题。研制的纳米载体系统直径可保持在10-500nm。因为正常组织周围的血管没有缝隙，而肿瘤组织周围的血管有100纳米左右的缝隙，所以纳米粒子就会从这些缝隙中渗透出来，并利用增强的渗透保留效应聚集于肿瘤部位，然后攻击癌细胞，但不会损害正常细胞，从而达到被动靶向的效果。纳米粒上的cRGD靶向基团可以与靶点特异性结合，具有受体介导的靶向给药系统形成的主动靶向效应，使蟾蜍灵抗肿瘤药物比较准确送到肿瘤细胞中，实现恶性肿瘤的靶向治疗。采用本发明所设计的以缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽(VRGDG， cRGD)修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物为载体，以蟾蜍灵(bufalin)为模型药制备的bufalin-mPEG-PLGA-PLL的纳米给药系统将具有良好的靶向递送能力和治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种载蟾蜍灵(bufalin)的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽(VRGDG，cRGD)修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL)纳米粒，简称 bufalin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD。其中，mPEG 是一种具有长循环功效，PLGA可生物降解有缓控释功效、PLL侧链带有侧氨基基团，易于用靶向基团修饰。cRGD是能够有效的、主动靶向肿瘤血管的靶向分子。此给药系统还具有运送不同抗癌药物的功能。本发明的目的还提供一种缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸聚合物，简称mPEG-PLGA-PLL-CR⑶。本发明的目的还提供一种载蟾蜍灵的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米粒的的制备方法。本发明的一目的是提供一种上述缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物的制备方法。本发明的目的还提供一种载蟾蜍灵的缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸 (buf al in-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)的用途，可以用于制备抗肿瘤的纳米粒药物。本发明所要解决的技术问题在于如何有效的将bufalin包裹在制备的聚合物载体中，使之能够有效地递送到靶点，从而最大限度的发挥药物的疗效。本发明所述的buf al in-mPEG-PLGA-PLL-cRGD纳米粒子是以缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(mPEG-PLGA-PLL-cRGD)聚合物为载体，以蟾蜍灵(bufalin)为模型药，制备出载蟾蜍灵的纳米药物。其粒径为10-2000nm。所述的纳米粒的分子量为1. 5X 103-9. 5X 106,优选的分子量范围为 3X 103-5X 106。其中，乳酸和羟基乙酸摩尔比为1-80 1-80，优化的比例为50-80 2-50, 例如乳酸和羟基乙酸摩尔比为5050 50,70 30或80 20等；羟基乙酸和赖氨酸摩尔比为90-50 10-50，优化的比例为50-70 10 20，例如羟基乙酸和赖氨酸摩尔比为 70 10,60 10 或 50 20，mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩尔比为 1-60 1-60，优化的比例为 1 20-50，例如 mPEG-PLGA-PLL 和 cRGD 摩尔比为 1 20、1 30 或 1 50 ； 1-60 1-60, 优化的比例为1 20-50，例如Bufalin和mPEG-PLGA-PLL-cRGD的摩尔比为1 20、1 30 或 1 5。本发明所述的mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物的合成方法具有如下常压CN 200910247576. 7 所述的 mPEG-PLGA-PLL 或者下述(1)-(5)的步骤合成获得的mPEG-PLGA-PLL，在室温下以及N，N'-羰基二咪唑(⑶I)和二甲亚砜(DMSO) 的混合有机溶液中，与cRGD搅拌反应3-48h，所述的mPEG-PLGA-PLL与cRGD的摩尔比 (为1-60 1-60;所述的N，N'-羰基二咪唑(⑶I)的二甲亚砜(DMSO)摩尔比(为 1-60 1-60。该反应推荐在氮气保护的条件进行。反应后的产物可以进一步纯化，将上述产物在水中进行透析，透析袋截留分子量为1000-10000，然后冻干机上在0-60°C温度下冻干l-72h，即得产物纯化的 mPEG-PLGA-PLL-cRGD。纯化产物低温干燥保存为好。(l)mPEG-PLGA的制备抽真空加热干燥耐热玻璃管，加入一定摩尔质量比的丙交酯和乙交酯原料(比例为1-80 1-80)，加入占原料总量质量百分比为 15%、分子量范围为350 5000的mPEG，再加入催化剂，通氮气，加热溶解抽真空，冷却固化抽真空2小时后封管，120-150°C反应8-50h。所述的催化剂包括辛酸亚锡、乳酸锌、SnCl2 ·2Η20和对甲苯磺酸等。所述的mPEG与催化剂的摩尔比为1-20 1_20。(2)mPEG-PLGA-Boc(Z)的制备在有机溶剂中和 0 40 °C，mPEG-PLGA、 Boc-Phe (eqv. )、N，N- 二环己基碳二亚胺(eqv.)和4_ 二甲氨基吡啶反应1 3天。该反应推荐常压氮气保护。所述的mPEG-PLGA、Boc-Phe (1 15eqv. )、N，N- 二环己基碳二亚胺 (1 15eqv.)和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1 1 15 1 15 1 15。反应产物可以进行纯化过滤，碱洗水洗或透析，浓缩，加冰甲醇或冰乙醚沉淀出产物，过滤，真空干燥。所述的Boc-Phe为Boc-苯丙氨酸。(3)mPEG-PLGA-NH2的制备在有机溶剂中和0°C，上述的mPEG-PLGA_Boc (Z)与三氟乙酸反应1 4小时。反应推荐采用氮气保护。所述的mPEG-PLGA-Boc(Z)与三氟乙酸的摩尔比为1-50 1-80。产物纯化，旋蒸去除溶剂与未反应三氟乙酸，残渣溶于有机溶剂， 冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。(4) mPEG-PLGA-PZLL的制备有机溶剂中和室温下，PEG_PLGA_NH2和NCA反应1 5天。所述的PEG-PLGA-NH2和NCA的摩尔比为1 60。反应推荐在氮气保护下进行。反应产物进一步纯化浓缩，冰甲醇或冰乙醚沉淀，过滤，真空干燥。(5)mPEG-PLGA-PLL 的制备在 0°C，mPEG-PLGA-PZLL、三氟乙酸和 33% 的 HBr 醋酸溶液反应0. 5-8h，所述的mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸为等摩尔，33%的HBr醋酸溶液占mPEG-PLGA-PZLL和三氟乙酸的总体积的1_50%。反应产物纯化可以采用冰甲醇或冰乙醚
沉淀，过滤，真空干燥。mPEG-PLGA-PLL-cRGD聚合物的合成反应式缩写如下其中，r. t-反应时间，h-时间，d-天，LA-丙交酯，Sn (Oct) 2-辛酸亚锡，mPEG-聚乙二醇单甲醚，PLGA-聚乳酸/羟基乙酸，DCC-二环己基碳二亚胺，DMAP-4-二甲氨基吡啶，BOC-苯丙氨酸，terminated-末端的，Acetic-醋酸，HBr-氢溴酸，Amino-氨基，poly(NE-(Z)-L-lySine)-带苄氧羰基有保护基团的聚赖氨酸，PLL-聚赖氨酸， dialysis-透析.
权利要求
1.本发明属于纳米给药技术领域。本发明公开了一种载蟾蜍灵的环肽修饰的聚乙二醇_聚乳酸羟基乙醇酸_聚赖氨酸纳米粒，其特征在于所述的纳米粒以缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸聚合物为载体，以蟾蜍灵为模型药，制备载蟾蜍灵的缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸纳米粒。
2.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于所述的纳米粒的粒径为10-2000nm。
3.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于所述的制备的纳米粒的聚合物分子量为 1. 5X 103-9. 5X 106。
4.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于所述的制备纳米粒的聚合物中乳酸和羟基乙酸摩尔比为1-80 1-80，羟基乙酸和赖氨酸摩尔比为90-50 10-50，聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽摩尔比为1-60 1-60，荷蟾蜍灵和缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸的摩尔比为1-60 1-60。
5.一种如权利要求1所述的载蟾蜍灵的缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇_聚乳酸羟基乙醇酸_聚赖氨酸纳米粒的制备方法，其特征在于如下步骤获得(1)在室温下以及N，N'-羰基二咪唑和二甲亚砜的混合有机溶液中，聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽搅拌反应3-48h，获得缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸；所述的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽的摩尔比为1-60 1-60 ；(2)缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸和蟾蜍灵摩尔比为1-60 1-60时，通过乳化蒸发法、界面沉淀法、透析法、薄膜乳化法、冷冻干燥法、超声分散法或逆向蒸发法制备获得载蟾蜍灵的缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸纳米粒。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)是在氮气中进行。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述的采用复乳法制备是取 4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚_聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于200 μ L 二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中，加入0. 2mg蟾蜍灵溶液，400W，10sX4的条件下进行超声乳化，再加入2. 2mL浓度为的普朗尼克F68水分散介质中，再次在400W，IOs X 4的条件下进行超声乳化，然后室温下搅拌0. 5-5h除去有机相；所述的薄膜乳化法制备，取4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和0. 2mg蟾蜍灵溶于400 μ L丙酮溶剂中，旋转蒸发成膜，随后加入4mL的水溶液，室温下搅拌0. 5-6h ；所述的透析法制备，取4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于200 μ L 二甲亚砜溶剂中，加入0. 4mg蟾蜍灵，将搅拌均勻的溶液在搅拌的条件下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋中透析3-72小时，除去有机溶剂，所述的透析袋的截留分子量为7000 ；采用乳化蒸发法制备，取4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和0. 2mg蟾蜍灵溶于400 μ L丙酮和二氯甲烷的混合溶剂中，加入2. 2mL浓度为2%的含聚乙烯醇的水分散介质中，超声或高压乳勻乳化，乳液在室温下搅拌2-4h，挥尽有机溶剂；采用界面沉淀法制备，取4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸_聚赖氨酸和0. 2mg蟾蜍灵溶于400 μ L丙酮溶剂中， 在不断的搅拌条件下，将上述溶液注入2. 2mL的浓度为2%的聚乙烯醇水分散介质中，加压挥发去除丙酮；采用自组装法制备，取4mg缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸溶于200 μ L水溶液中，加入0. 4mg蟾蜍灵，将搅拌均勻的溶液在搅拌的条件下滴入2mL水中，之后将溶液装入透析袋中透析3-72小时， 除去有机溶剂；三位数的透析袋的截留分子量为7000。
8.—种如权利要求1所述的载蟾蜍灵的缬氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_谷氨酸环肽修饰的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙醇酸-聚赖氨酸纳米粒的应用，其特征在于用于制备具有长循环、可生物降解、缓控释、被动靶向、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的药物是静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服或经皮给药等方式的药物。
全文摘要
本发明属于纳米给药技术领域。本发明公开了一种载蟾蜍灵(bufalin)的环肽(VRGDG，cRGD)修饰的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸(bufanlin-mPEG-PLGA-PLL-cRGD)纳米粒，它们的制备方法及其用于制备抗肿瘤药物的应用。该纳米粒制备方法简便，适于大规模生产。
文档编号A61K31/585GK102302783SQ201110177938
公开日2012年1月4日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者侯黎莉, 刘培峰, 刘宣, 周利红, 孙颖, 李克桑, 李琦, 梁波, 段友容, 殷佩浩, 王炎, 秦建民, 邱艳艳, 陈红宇, 靳宝辉 申请人:上海市普陀区中心医院, 上海市肿瘤研究所