一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物及其制备方法

专利名称：一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于美容保健和医药生物技术领域，涉及一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物及其制备方法。
背景技术：
人体衰老是一个普遍存在的生理变化过程，而皮肤是衰老过程中最易显露的器官，它的老化主要是随着年龄的增长同时在内源性和外源性或者内外源性因素共同的作用下所产生的一系列皮肤生理学功能和组织学结构改变以及临床症状，主要表现为色斑的出现、皱纹的产生、皮肤的松弛和局部组织的吸收萎缩产生凹陷。目前，人们根据多种衰老机制学说，从皮肤老化的内外诱因入手，进行了基因调控和遗传工程的研究，研制出了一系列外用制剂、养颜护肤品内服剂，同时开展了微创填充技术。然而前者主要是针对抗皮肤衰老的预防措施，而外用制剂是针对抗皮肤衰老的一种延缓措施，并且见效慢。而临床上微创填充除了治疗面部皱纹外，还广泛应用于治疗皮肤暴露部位缺损，例如面部软组织缺损或凹陷畸形，小面积凹陷性瘢痕、真皮萎缩、鼻唇沟填充缺损，颞部填充等。目前，应用于皮肤微创治疗的填充材料来源很多，且有不同的优缺点，为进一步探索适合医疗美容领域需求的填充理想材料，我们现对已有的填充材料作个简单的介绍。一、填充用非生物材料早在100年前，学者及科学家就开始尝试使用一些材料纠正面部缺陷。在19世纪末，欧洲人通过注射石蜡改善面部轮廓。由于并发症的存在以及长期效果不理想，此方法后来被放弃。在上个世纪中期，美国开始以注射硅甲烷满足求美者的需求。但由于局部和全身性反应，以及注射迁移和组织断裂，此方法也被淘汰。尽管众多缺陷和不足一直阻碍着非生物材料的广泛应用，但由于其直接的效果一直促使着人们寻找更加理想的非生物材料。(一 )硅橡胶固体硅橡胶生物学性能良好，但目前国内已极少用。1965年，Neaman等在大鼠上发现注射该材料后会刺激肉芽组织过度增生。同年，美国FDA禁止它作为注射充填剂将其退出了美容医学市场。其原因在于硅胶不能长入周围组织，在其周围形成纤维包膜，质地手感与周围正常组织差异较大，外形欠佳，且易造成包膜挛缩、假体移位外露、不同程度的炎症反应，肉芽肿及各种自体免疫性疾病等并发症，且难以处理。例如，2011年1月沈日，美国FDA宣布硅胶隆胸可能会引起一种非常罕见的间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymph0ma，ALCL)。FDA掌握的数据显示，进行过植入性隆胸手术的女性其邻近植入假体的疤痕包膜组织可能会有很小但显著的ALCL发病率。(二)聚四氟乙烯聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)是一种四氟乙烯树脂经拉伸等特殊加工方法制成的高分子软组织填充材料，膨体聚四氟乙烯由内在的聚四氟乙稀结通过多方向的聚四氟乙烯纤维相连，在膨化过程中产生多孔的超微结构，其平均纤维长度为22um，具有理化性能稳定、无毒、耐高温及低温、耐腐蚀的优点，但置入组织后与置入固体硅橡胶的反应类似，有包膜包围，且炎症反应及异物反应均比固体硅橡胶更明显。虽然膨体聚四氟乙烯(ePTFE)及呈微孔状的特氟隆，具有良好的组织相容性、柔韧性，没有明显的假体轮廓感，可以避免因为硅橡胶引起的发红症状等优点，且可长入材料微孔中，无纤维包膜形成， 但也存在缺点。首先其价格昂贵，其次聚四氟乙烯的植入也会引起感染、假体外露、肉芽肿等。且Linder认为ePTFE存在不易与创面结合、缺乏感知性、易形成包囊挛缩及变形移位等缺点。慢性感染、假体外露形成与适应症选择不当即表面组织未能覆盖丰富的血液循环、 局部条件不当、医务人员无菌操作观念不足有关。而假体变形、假体偏移与置入空隙过小相关。(三)聚甲基丙烯酸甲酯聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate，PMMA)俗称有机玻璃，于1989年开始用于除皱和填充皮肤凹陷处及软组织增大等。在临床上使用的PMMA是其微颗粒(32 40um)与3. 5%牛胶原蛋白或明胶、羧基葡萄糖酸镁混合的注射材料。聚甲基丙烯酸甲酯小粒在3个月内被人的胶原包裹，无明显异物反应，在体内也不移动，其作用较持久。但是注射前需皮试。其早期不良反应有肿胀、青肿、过敏反应等并发症；后期不良反应有肉芽肿等并发症，据报道其肉芽肿发生率为0. 1 %，这可能是由于该材料能刺激纤维增生。而1997年 McClelland等人报道聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸甲酯与胶原混合作为注射性填充剂应用于临床，据知此材料在巴西、美国、日本美容外科界较为流行，但文献报道其使用期间有诱发免疫排斥反应的可能。(四)聚丙烯酰胺水凝胶聚丙烯酰胺水凝胶是一种网状结构高分子生物材料，其分子量在103-107，由聚丙烯酰胺和无致热源水组成的无色透明、亲水性强而不溶于水的呈胶冻状的软组织填充剂， 该材料的使用始于20世纪80年代乌克兰，1999年获得国家药品监督管理局正式批准，目前是填充材料研究的热点之一，动物实验表明其生物相容性优于硅凝胶。虽然该材料具有最佳生物组织相容性、毒性小、炎症反应轻微、包膜后期形成、不易被吸收、分解等优点，但随时间的推移、应用范围的扩大和应用例数的增多，也出现了许多并发症，例如出现硬结，这可能是由于水凝胶稀释不均勻、注射层次不正确、注射量过多及按摩不正确造成的；水凝胶在外力作用下具有可流动性，发生注射物移位现象；因为水凝胶易流到乳腺下极及皮下，导致发生破溃；注射时要求不能注射进入腺体组织，避免引发感染。一旦出现并发症，异物无法取净。而目前，因其远期疗效及毒副作用尚无定论，有必要进一步观察与研究，我国已经禁止该制剂用于美容整形方面。(五)羟基磷灰石羟基磷灰石的化学成份与脊椎动物的牙齿和骨骼所含的矿物质极其相似，来源于珊瑚(不可吸收)和动物如牛骨(可吸收)。羟基磷灰石材料具有高度的生物相容性，无毒、无刺激性、无排斥反应、无老化现象、不致癌、不致敏，既可单独使用，也可与其它材料混合置入。它多被用于鼻根部凹陷者，但是需要操作者具备一定的经验，因为该材料不能在术前根据需要进行塑形也不能确定置入量，只能在置入过程中用手指轻轻挤压成形。(六)聚乳酸聚乳酸是以乳酸为单体经化学合成的新型生物降解性高分子材料，其无毒、无刺激性，具有优良的生物相容性，可生物分解、吸收，强度高，可塑性好，易加工成型。聚乳酸在生物体内经过酶分解，最终形成二氧化碳和水，不污染环境，因而被认为是最有发展前途的可生物降解的高分子材料。而作为皮肤填充物为人工合成的多聚左旋乳酸(PLLA)微粒，已在医学界应用了 30余年。并在09年获得素以严格著称的美国食品药物管理局的批准用于改善脸部皱纹和法令纹。2010年7月，台湾相关部门也批准在岛内应用PLLA改善患者面部皱纹。PLLA美容效果一般可持续1-2年。PLLA的作用机理是可刺激患者自体胶原蛋白的生成，可使因老化而导致的面部松弛部位撑起，从而达到除皱的目的，有研究显示PLLA 能使真皮厚度增加3倍，产生临床上明显可见的填充效果。其主要不良反应有中度的淤斑和暂时性的疼痛。多为注射后炎症反应，但是不需特别治疗。发生轻到中度的血肿比例为 11% -13%。(七)其它高密度聚乙烯具有良好的生物相容性，且置入后组织可长入，异物反应极轻，但因材料孔径较大导致不易消毒且组织长入过多置入后不易取出。丙烯酸水凝胶是一种甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸乙酯的共聚体，不可降解，多用于眼科手术，在注射时易产生注射时疼痛，红斑，水肿。生物玻璃颗粒具有骨产生及骨生成能力的可分解材料，与羟基磷灰石类物质所具有的生物骨诱导或介导性不同。除此之外，蜂蜡、羊毛脂、植物油等非生物材料在历史上也曾用于皮肤填充，但因为不良反应严重，已被淘汰。二、填充用的生物材料非生物材料探索的失败，促使科学家向生物材料方向去探索，并尝试利用外源生物材料以及自体生物材料，比如牛胶原的使用，自体组织的填充都是比较热门的材料。但是到目前为止，还没有一个现有的非生物可注射材料可以完全令人满意地达到皮肤填充的效果。(一)自体生物材料目前临床上许多面部修复采用自体组织作为填充材料，如软骨、肌肉、筋膜、真皮、 脂肪等，这些材料具备安全性高，无抗原性的优势，但是同时也存在供区及受区均有切口、 取材有限、感染率较高的缺点，这些缺点可能会在一定程度上增加患者的痛苦，影响外观美。(1)自体脂肪移植自体脂肪组织具有操作简单、取材方便、塑形容易、安全性高、形态质感与周围组织一致、组织相容性好、无需附加切口、不遗留瘢痕、患者心理上无异感等优点，因此有学者认为是目前最理想的软组织填充材料。1889年VanderMeulen首先开始应用了自体脂肪移植技术。自体脂肪组织也分为游离脂肪组织移植和颗粒脂肪组织移植。采用自体游离脂肪组织进行修复，皮肤被移植的脂肪组织最大可以被吸收达70%左右，效果不稳定受到了很大限制。而自体脂肪颗粒注射移植是ChajchiiNliiouz等学者20世纪80年代提出的将抽吸所得的纯化脂肪颗粒，用注射器注射到软组织缺损部位的方法。王阳等从1991 2000 年期间进行334例自体脂肪颗粒注射移植，取得良好效果。但不管是游离脂肪注射还是自体颗粒脂肪注射均存在一些不足。首先是移植后存在一定的吸收率，这是可能是因为脂肪组织对缺血及机械损伤耐受较差，移植后易被吸收，多发生在1年之内，剩余的将不再被吸收。关于吸收率的研究，Dolsky等动物移植实验后得出结论，认为脂肪颗粒吸收率为40%。而国内外相关研究所报道的脂肪移植吸收率在30 % 70 %，差别比较大。多数学者认为在一年以后的吸收率在50%左右。这表明自体脂肪细胞注射一般需多次注射，这可能导致出现症状瘢痕、继发感染或无菌性炎症等并发症。而且多次临床案例研究表明自体脂肪的注射还会引起脂肪液化、坏死、钙化等并发症。于此同时，为了避免机械损伤，自体脂肪注射的提取要求更高的技术水平。除此之外，自体脂肪注射虽然广泛应用于面部凹陷修复等临床整形美容，但并不是所有部位的修复均能得到满意的修复效果，例如进行眼睑瘢痕及凹陷填充修复时，因为眼睑皮肤及皮下组织薄，脂肪不易注射均勻，所以易出现凹凸不平的现象。(2)自体成纤维细胞1995年，威廉·博斯利博士用组织工程学技术体外培养的自体成纤维细胞用于整形美容的皮肤填充，属于活细胞移植性填充，由此提出了整形材料的全新理念。1998年，德博拉 瓦特森博士通过实验也认为，自体成纤维细胞作为皮肤填充材料是较理想的。自此， 美国首先开始规模化地与医院合作，培养自体成纤维细胞并用于整形美容。1995年至1999 年，共有200位医生试用了 1000名患者，结论是“有效”。2002年，在英国和澳大利亚开始临床应用。2003年7月，美国食品药品管理局(FDA)委托亨利·门茨医生进行自体成纤维前体细胞治疗面部皱纹和面部凹陷性疤痕的临床三期试验，共治疗了 146名皱纹和疤痕患者，得出了“有效”的积极结论。自体成纤维细胞是通过培养自体纤维母细胞，在切取自体皮肤后，经体外扩增纤维母细胞，然后制成细胞悬液注射进入真皮，间隔2 3周可重复注射，直到满意为止。这种方法可以充填真皮皮下缺损，可对光化性、老化性瘢痕造成的缺损进行充填，排除了免疫与过敏反应的顾虑。Watson等也证实，利用自体成纤维细胞治疗老年皱纹10例，经组织学检查证明真皮厚度增加，注入的成纤维细胞在12 对个月仍可分泌胶原，但其不足在于这种注射方法在注射后3 4个月才能显效。同时，此种方法不适宜超过60岁的老年人，原因在于老年人的皮肤成纤维细胞产生胶原的能力较弱。从细胞移植技术角度，此种方法需要体外培养成纤维细胞导致未能明确体外培养是否会对细胞性状产生影响以及移植到体内后远期效果。( 二)医学美容胶原①动物胶原美国FDA于1981年批准了第一个注射用牛胶原蛋(Zyderm I、II)。 胶原蛋白注射最大缺点是注射前30d要进行皮试并且需反复充填注射，注射后只能保持4 个月左右的效果且仍然存在超敏反应和非超敏反应，如红斑、水肿等，同时由于血液中的牛胶原抗体的存在，还可能会产生囊性肉芽肿反应。另外可能会发生疱疹病毒和细菌感染，局部皮肤坏死等罕见并发症。②人类异体胶原主要来源于整形手术时获取的皮肤，经过4-6 周的冷冻、处理后形成的胶原。目前仍建议在使用前皮试，并在注射前观察3d，会出现短暂红斑、皮肤色素沉着、痤疮急性发作样改变和粟粒疹样改变等并发症。③人自体胶原主要来源于整形手术时获取的自体皮肤，经过4-6周的冷冻、处理后形成的胶原。与人类异体胶原对比，其优点在于可以避免由异体、异种胶原所产生的过敏和疾病的传播，而其一些并发症又与人类异体胶原类似，同时也有一些关于其发生进行性急性溃疡性过敏反应或慢性肉芽肿的报道。(三)透明质酸
该物质存在于皮肤和其他组织中的氨基聚糖，又称黏多糖，在所有生物中的化学结构都相同，大分子量透明质酸的分子量范围为1800000 2200000，可防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤，中分子量透明质酸分子量范围为1000000 1800000，可紧致肌肤，长久保湿，小分子量透明质酸分子量范围为400000 1000000，可快速与细胞发生水合作用。它可以从天然有机物如鸡冠和龙虾壳中提取或者通过细菌对糖发酵后产生的衍生物合成。通过交联的透明质酸可以吸取自身体积1000倍的水分，从而使肌肤丰满、有弹性，平均维持时间6个月至1年。目前根据透明质酸制剂来源可以分为动物源性和非动物源性。提取动物源性的透明质酸分离的过程较为复杂，不可能形成规模化的生产，提取出来的透明质酸的分子量相对较小。目前，透明质酸在临床整形美容方面主要是在唇部，眼周围除皱或者丰唇、治疗凹陷性痤疮瘢痕。导致不良反应的其中一方面原因可能是操作程序不合理和不当操作，比如注射的层次错误和注射压力不均勻等。透明质酸注射后的并发症分近期和远期并发症，近期并发症包括局部红肿、感染和过敏，多在一周左右逐渐消退。远期并发症是通常在注射后一两周才表现出来的不良反应，随着透明质酸不断降解，在2 3月后能自愈。而Coleman SR在文章中提到透明质酸注射严重并发症有慢性肉芽肿、血管栓塞造成失明或脑梗死， Patel VJ等研究认为透明质酸注射会出现迟发性过敏反应，这可能与透明质酸纯度有关。(四)无细胞真皮基质无细胞真皮基质是采用人的皮肤制成无细胞的真皮移植片经加工处理成无细胞的真皮蛋白基质和蛋白多糖，它主要用于丰唇、凹陷性瘢痕、隆鼻、鼻唇沟充填等。于1995 年，有学者报道制成了无细胞真皮基质，之后Wainwright用人的皮肤制成无细胞真皮进行异体移植成功并通过了美国FDA的批准进入了医用生物材料市场，被认为是良好的填充材料。它一般埋于真皮下层，没有抗原性，植入后宿主的成纤维细胞会浸润，并有血管长入，但是材料的置入与方法密切相关，置入的方法不当会引发感染。(五)异体真皮复合溶浆该物质是取自人尸体皮肤的无细胞胶原、弹性硬蛋白和糖胺多糖的混合物，包含了 I、III和VI型胶原。事先必需排除HIV、肝炎、梅毒等的感染。制品是悬浮于磷酸盐缓冲液中的无杂质的胶原蛋白，为不含利多卡因的0. 15ml或Iml的针剂。异体真皮复合溶浆注射在浅、中层真皮水平，并引起低度炎症反应，可保持3 6个月。主要用于治疗皮肤凹陷、老年皱纹、填充鼻唇沟，还包括烧伤和牙龈外科及骨移植体等。但此制剂价格昂贵，有与牛胶原相似的并发症，未能得到广泛应用。综上所述，目前国内外常用于皮肤美容的充填物根据来源可分为有以下几类，自体来源的自体脂肪，自体细胞，自体胶原等；同种异体来源的人尸体组织的胶原，人成纤维细胞培养生成的胶原；异种来源来自于牛、猪的胶原，来自于公鸡冠或细菌发酵的透明质酸及其衍生物类产品；人工合成来源的硅树脂类产品，聚甲基丙烯酸甲酯，羟基磷灰石，聚乳酸类，聚丙烯酰胺类等。虽然这些生物与非生物材料在皮肤美容填充上发挥了一定的作用，但不管是生物材料还是非生物材料均有各自的优缺点，有些应用较广泛，但尚存在一些不足之处或仍有并发症发生。如一些异体生物来源的材料，不仅会应为它们来源于异体而导致免疫反应， 对人体具有致敏反应。虽然近年来，采用了自体组织作为填充物，无排斥反应，没有毒副作用，但是自体组织作为填充物，其过程及实验室资质的安全标准性不好把控，价格昂贵，见效慢，一般在半年以上见效，疗程相对较长。 另外，非生物来源的材料虽然填充效果明显，“立竿见影”，维持时间长，但采用非生物材料填充，安全性低，且面部轮廓会随着年龄发生改变，填充剂会成为新的缺陷，从而美容医生必须针对填充部位做新的修补；再则，如果永久型填充剂出现任何问题，无法降解，只能连同人体原有组织一起切除。除此之外，对于一些效果很好的自体填充材料，没有排斥反应，效果明显，持续时间也较长，但由于其在皮肤内游走，填充后的皮肤不自然，影响皮肤的外观平衡，感官效果不理想，种种的原因导致应用受限。因此，如何让填充材料达到组织相容性好；无过敏反应，非致热源；不致癌、不致畸；与宿主组织具有一定的结合能力； 不引起或少引起炎症或异物反应；无抗原性，不导致免疫及组织相关性疾病；易于消毒、储藏；具有适当的流动性；置入宿主体内后易于成形、塑性及固定，效果持久或永久等等，这些都是我们需要去面对，并急需解决的问题。

发明内容
本发明的目的是针对用于皮肤美容填充材料背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，提供一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物的新产品，这种产品弥补了当前技术背景的不足，进一步促进了填充材料的发展；本发明的另一目的是提供该一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物的制备方法。1、为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案(1)本发明所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物， 其特征在于它是由下述重量配比的原料组成
5倍自体浓缩血浆
氯化钙亚硫酸钠
重组人源血管内皮生长因子冻干粉
重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒
10.0 95.0 0.001 0.10 1.0 15.0 0. 005 0.5
0. 005 0.5 0.1 10.0 5.0 90.0
O.lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液(2)本发明所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物， 其特征在于它是由下述优选重量配比的原料组成5倍自体浓缩血浆75
氯化钙0.08
亚硫酸钠5.0
重组人源血管内皮生长因子冻干粉0.01
重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.01
氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒1.0
0.1mol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液18.9(3)本发明所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物， 其特征在于所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物的制备方法包括以下步骤①严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血、并同时收集到含抗凝剂的采血管中；轻轻颠倒混勻6到8次，以4000rpm -min"1的转速离心IOmin此时， 肉眼可见离心后的采血管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为血浆；中间薄薄一层灰白色为白细胞和血小板；最下面一层红色为红细胞；取出上层的血浆于无菌容器中备用；②将准备好的自体血浆置于无菌超滤离心管中，以4000rpm · mirT1的转速离心 30min，浓缩至5倍；严格按照无菌要求和上述优选重量配比，将已离心浓缩好的血浆用匹配的专用无菌注射器吸取配方量的自体血浆，并小心转移至特制专用密封无菌血浆收集管中；③用分析天平分别准确称取配方量的氯化钙、亚硫酸钠置于经过洗消过的容器中，加入适量的0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水进行充分溶解，混合均勻，过滤除菌备用；④将获得的自体浓缩血浆加入配方量的重组人源血管内皮生长因子冻干粉和重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉，充分溶解；并加入步骤C3)制备好的液体中，轻轻混合均勻备用；⑤将配方量的氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒用戊二醛活化，用0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，再分散于0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水中；然后，加入上述自体浓缩血浆复合物中，混合均勻，反应30min之后，即为一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物。2、本发明的主要技术优点与以往的皮肤填充材料相比，本发明提供的复合蛋白支架来源于自体，其来源方便，制备简单，无刺激，无过敏，安全性高；另外，本发明的蛋白复合物，可形成很好的纤维蛋白支架，起效快，填充效果好，是一种很好的皮肤美容填充材料。(1)本发明中采用自体血浆作为形成蛋白支架的基础原料，其来源方便、制备简单，成本低廉；另外，正常情况下，完全避免了免疫原性和人体对异体材料的降解，其来源于自体，无任何排异反应，所以自体血浆使用副作用小、无过敏反应，具有良好的组织相容性，安全性高。(2)本发明采用whatman超滤离心管将自体血浆浓缩为5倍，whatman超滤离心管可将分子量10000以下的物质滤过，而像纤维蛋白原这样的高分子物质就被截留下来，所以浓缩后的自体血浆中含有高浓度的纤维蛋白原，能形成高强度、稳定性好的纤维蛋白支架，能快速填充皮肤凹陷。另外，浓缩后的自体血浆中，蛋白活性成分保护好，纯净，污染几率低。(3)本发明利用自体血浆制备的纤维蛋白支架，可以作为一种新型的组织工程支架，其形成的蛋白支架不仅能快速达到填充作用，而且对皮肤细胞是一种很好的生长基质， 可促进支架周围细胞的增殖、分化，并聚集在支架周围，从而形成自体细胞支架，这些细胞在自体的调控下既不过度生长，又可以长期存活、扩充，同时还可源源不断产生胶原蛋白。 这种相当于生理性的皮肤填充方法自然、作用时间长久，可以达到皮肤结构再生，永久性解决皮肤凹陷的问题。(4)组方中的亚硫酸钠及氯化钙可促进血浆中的纤维蛋白原及其它蛋白聚集，沉淀，在促进纤维蛋白支架的形成上，具有双重协同效果，可形成丰富的蛋白支架；血管内皮生长因子可促进支架周围的微循环，为支架周围的细胞提供营养，加强细胞的增殖和分化， 同时成纤维细胞生长因子可刺激皮肤中胚层细胞的增殖，强化皮肤凹陷处组织的形成，这两种细胞因子都可以促进血管形成，使纤维蛋白支架周围血管化迅速，增加了周围细胞及组织成活；另外由于本发明复合物有皮肤细胞所需的最适PH条件(7.0 7. 2)、离子浓度， 更加有利于细胞的分裂和增殖及生命活动。(5)本发明填充用的主要是自体材料，其作用前期是由于形成纤维蛋白支架而产生填充效果，与皮肤生物相容性强；而等自体纤维蛋白支架被分解吸收后，不会影响新形成组织的结构和功能，而且，其后期作用是由于形成自体细胞组织成分而产生填充效果。由于都是自体组织，所以其填充后凹陷处皮肤于正常皮肤无感官差异，填充效果自然、真实。(6)本发明的填充材料主要来源于自体，且使用方法简单，不需要动手术，只需注射即可，且注射疗程少，从而更易被人们所接受，具有顺应性的优点。(7)本发明的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物中含有定位载体，氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒具有很好的生物相容性，能与纤维蛋白原相交联，可在外界磁场的作用下有效地富集、定位于待填充的部位，从而避免填充物移位于其他部位。(8)本发明一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物制备方法简单、操作方便、简单易学、不需要特殊设备，易于推广，适合用于有合法医疗美容资格的医疗美容机构。(9)本发明的纤维蛋白复合物能形成蛋白支架，可在真皮层内形成网状三维结构， 托起塌陷的皮肤，恢复自然健康的皮肤，能从根本上帮助凹陷肌肤形成健康的组织结构，有着安全自然、快速完成、迅速显效等特点。(10)本发明的是复合蛋白支架不仅能填充凹陷皮肤，且本身能促进细胞增殖分化，加上蛋白支架中混合了细胞因子等辅助成分，可给增殖细胞提供营养，并促进细胞增殖分化，启动肌肤的自我更新机制，高效达到填充修复效果，适合一般性皮肤皱纹以及皮肤凹陷问题。
3、本发明的主要创新点(1)生物相容性好本发明是通过组织工程学设计的，其主要材料来源于自体，是一种全新的自体填充材料，完全避免了异体生物材料的免疫原性，所以应用于人体后，无任何排斥反应，无过敏反应，具有极佳的生物相容性，应用安全性高。(2)填充效果好单纯的自体血浆注射作为填充物的效果达不到人们所期望的结果，其重要的原因就是形成的纤维支架不稳固，形成不了蛋白支架，没有很好发挥血浆中纤维蛋白聚集的填充作用；另外，血浆中纤维蛋白的制备一般是在异源性凝血酶的作用下可转化为丝状的、较好韧性的、具有三维多孔网状结构的纤维蛋白，但是一般加入凝血酶30 分钟内就会形成纤维蛋白，这就要求临床在很短的时间内就注射完，且凝血酶来源于异体， 具有抗原性。而本发明，采用的自体血浆为浓缩5倍的浓缩血浆，浓缩后的自体血浆中含有高浓度的纤维蛋白原，能形成高强度的纤维蛋白支架，可很好地发挥血浆中纤维蛋白聚集的填充作用；另外，本发明通过实验研究出在最低量氯化钙的作用下，能很好地促进纤维蛋白的形成，并在两个小时左右完全聚集，完全满足了临床治疗的需要。再者，氯化钙为小分子物质，安全性高。(3)组方协同效果好本发明的纤维蛋白复合物，第一能形成韧性很好的，具有网状结构的纤维蛋白，可达到很好的填充作用；同时纤维蛋白支架对皮肤细胞是一种有利的生长基质，可介导细胞间信号传导的作用，促进支架周围细胞的增殖、分化，并聚集在支架周围，形成自体细胞支架；另外组方中的血管内皮生长因子以及成纤维细胞生长因子可促进支架周围的微循环，为支架周围的细胞提供营养，加强细胞的增殖和分化，成纤维细胞生长因子还可刺激皮肤中胚层细胞的增殖，强化皮肤凹陷处组织的形成，加上复合物提供了细胞生存和生长的最佳环境条件，这些因素更加有利于细胞的分裂和增殖及生命活动，大大地促进了自体细胞的增殖和自体细胞支架的形成，从而达到皮肤组织细胞再生，可永久性解决皮肤凹陷问题。(4)填充感官效果好本发明是靠自体血浆形成纤维蛋白支架以及促进细胞支架形成，而达到皮肤填充作用的。纤维蛋白支架是三维网状结构，易顺应皮肤原来的结构状态，其被分解吸收后，也不会影响新形成组织的结构和功能，因此，填充后与正常部位无差异；另外细胞支架是在自体的调控下既不过度生长，又可以长期存活、扩充，所以其填充后凹陷处皮肤于正常皮肤无感官差异，填充效果自然、真实。(5)具有定位效果当前，由于填充物理化性质、自体动作、重力的影响，填充物会在填充部位发生移位现象，这也是很多理想材料所面对的一个问题。因此，在本发明中，我们采用氨基硅烷化的四氧化三铁O^e3O4)磁性微粒作为定位载体，氨基硅烷化的四氧化三铁(Fe3O4)磁性微粒可与纤维蛋白原交联。所以本发明的复合物可在外加磁场作用下可以在体内定向移动、富集、定位；另外，氨基硅烷化的四氧化三铁生物毒性低，可控性强，很多研究表明，当磁性微粒的粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化，所以氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒可作为药物定位的载体。4、本发明的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物作用原理
自体血浆(autogenous plasma，简称AP)注射技术在国内外临床医疗早已有人开展和应用，而近几年已成为整形美容和皮肤抗衰老及微创美容抗衰老学界等领域关注的焦点和应用的热点，不少整形美容医疗机构甚至正在将该技术直接应用于医疗美容中，并取得了不同程度的效果。然而，大家在实际应用和疗效评价过程发现，采用单纯的自体血浆注射的疗效并非人们所期待的疗效和理想的结果、甚至有许多不尽人意的地方，其重要原因之一就是未有很好发挥血浆纤维蛋白(plasma fibrous protein，简称PFP)聚集的填充作用。为了促进该技术应用的健康发展，也为了更加科学合理的完善该技术，使之达到人们期待的更好效果。本发明通过实验研究出在配方量氯化钙的作用下，能很好地促进纤维蛋白的形成，并在两个小时左右完全聚集，完全满足了临床治疗的需要。但事实上，单纯的自体血浆中形成的纤维蛋白量非常少，根本不能形成临床应用所需的纤维蛋白支架，因此，本发明采用的自体血浆为浓缩2到5倍的浓缩血浆，浓缩后的自体血浆中含有高浓度的纤维蛋白原，能形成高强度的纤维蛋白支架。纤维蛋白来源于血液的细胞外基质，是血液中的天然成分纤维蛋白原，在凝血酶的作用下可转化为丝状的纤维蛋白，其外观半透明具有较好的韧性，具有三维多孔网状结构，具有良好的生物相容性、有效的生物活性和可降解性且无细胞毒性，同时还具有介导细胞间信号传导的作用。因此，本发明中浓缩后的自体血浆在皮下形成的纤维蛋白支架，是一种很好的皮肤填充材料，具有良好的应用前景。同时，形成的纤维蛋白支架对皮肤细胞是一种有利的生长基质，可促进支架周围细胞的增殖、分化，并聚集在支架周围，形成自体细胞支架，从而达到皮肤结构再生，永久性解决皮肤凹陷问题。另外在本发明产品的配方中，添加了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)以及成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)。VEGF是一种血管内皮细胞特异性有丝分裂原，可诱导内皮细胞的移行从而促进血管发生，其作用机制为人体血管内皮细胞表面分布着一定数量的VEGF受体，称为VEGFR。血液中的VEGF与受体结合，从而激活胞内酪氨酸激酶，启动下游细胞信号级联，从而促使新脉管生。因此，VEGF可促进支架周围的微循环，为支架周围的细胞提供营养，加强细胞的增殖和分化，同时成纤维细胞生长因子可刺激皮肤中胚层细胞的增殖，强化皮肤凹陷处组织的形成；另外由于本发明复合物有皮肤细胞所需的最适PH条件(7. 0 7. 2)、离子浓度等，是皮下细胞生存和生长的最佳环境条件，，也是皮肤组织中新生细胞分裂和增殖的良好培养基，更加有利于细胞的分裂和增殖及生命活动。虽然本发明产品是一种很好的纤维蛋白复合物，能形成理想的皮肤填充材料，具有良好的组织相容性，能快速填充皮肤凹陷，维持时间长，且组方协同效果好，这对于达到快速填充效果来讲，具有非常重要的意义。但是，对于一种理想的填充材料，单具有快速填充效果还是不够的，而且还要填充物不会在皮肤内游走，能在特定需要的部位填充也是至关重要的。因此，本发明产品中还采用氨基硅烷化的四氧化三铁(Fe3O4)磁性微粒作为定位载体。氨基硅烷化的四氧化三铁能与纤维蛋白原交联，并在外加磁场作用下可以在体内定向移动、定位浓集，具有可控性，且其生物毒性低。而且，很多研究表明，当磁性微粒的粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。因此，氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒可考虑作为药物定位的载体。本发明通过在纤维蛋白复合物中添加磁性微粒，然后通过外磁场的作用而达到皮下软组织定位的效果。5、本发明制备注意事项(1)自体全血的采血部位通常来源于肘中静脉或其他肘静脉，如肘静脉不明显或采集不便、加上血液用量不是太大时，也可采集手背静脉和外踝静脉等，但采集的最好是空腹静脉血，以减少脂血等。(2)采集血液前，应认真检查血液收集管内是否干燥和消毒，还应仔细检查采血针与血液收集器是否正确合理连接；另外，血液收集管是否放好(严防打碎)。在采血过程中， 尤应将血液沿血液收集管的管壁自然而缓慢流入，严禁剧烈振摇，严防血液产生气泡，以免出现溶血和弓I起血浆纤维蛋白原变性。(3)采血过程中，如遇个别受术者“晕针”或出现抽血眩晕时不要慌张，可立即让其平卧休息片刻即可恢复。必要时，可让其嗅吸芳香氨汀。如仍未恢复，则可针刺(或拇指掐)人中及合谷等穴位，直至苏醒。(4)为了防止抽血时发生低血糖反应及紧张性休克，应首先做好受术者的思想工作，消除其紧张心理。抽血完成后，也可嘱受术者适当饮食一些饮料、稀饭之类的流质食物； 尤其应注意了解和观察受术者全身反应状况，严密防止高血压及心血管病等意外。(5)对于可能遇到患有高脂血症的患者，为了防止出现脂血或乳糜血，建议治疗头几天坚持清淡饮食、同时采集空腹12小时以上的静脉血。通常情况下，脂血或乳糜血、溶血、黄疸血等情况，不适合用于本发明。(6)特别应该注意的是，在抽血时，严禁将采血器的气泡或空气误入至静脉之中， 而且，在抽血时注射器只能向外抽、绝对不能向静脉内推，以免注射空气进去，形成气栓造成严重后果、甚至生命危险。(7)要特别防止血液收集管在离心过程中出现破损。为了避免出现此种情况，一方面收集血液的离心试管可采用符合注射要求的塑料制品，另一方面，离心前务必保持离心机罐重量的对称平衡和相等。(8)要注意保存好所采集的血液，自体全血最好是现采现用、当天或一次用完，以保持血液新鲜和治疗效果。如实在用不完，可密封保存于低温冰箱之中，但时间不要超过3 天，且在再次使用或治疗时，应置于37°C恒温水浴中稍加复温及强化。(9)受试者在接受治疗前，要彻底清洁面部。在这之前的一个星期开始戒酒。前两个星期禁止服用阿司匹林或其他解热镇痛的药物。在进行生物除皱之前医生需要详细了解病人有无重大疾病史、过敏史、是不是进行过其它的面部整形美容手术。(10)受试者在注射完成之后的5小时内，患者要静卧休息，自己不要按摩注射部位，以免注射物移位，让患者的身体保持直立状态。并且，在M小时内受试者不可以进行剧烈运动。
具体实施例方式下面结合具体实施例子来进一步说明本发明的产品和制备方法实施例1 氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒的制备步骤(1)采用液相共沉淀方法，分别将一定浓度的FeCl3 · H2O和FeCl2 · 4H20在氨性溶液中共沉淀，静止分层并去掉上层清液后，立即加入浓度为20-30%的四甲基氢氧化铵溶液，再用超声法分散后，过滤除去其中较大的磁性微粒，即可得到颜色为灰褐色、颗粒大小均勻一致的溶液；(2)取一定剂量的磁性微粒溶液，并加入至在100_200ml异丙醇溶液中；用超声法将磁性纳米颗粒进行分散；同时，边搅拌边加入3-6g聚乙二醇(PEG-4000)，继续搅拌 10-20min后加入适量蒸馏水，然后加入0. 1-0. 3ml正硅酸乙酯(TESO)水解形成硅壳层；在特定磁场作用下，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤干净后，分散于无水乙醇中；再加入适量蒸馏水后，在不断搅拌下加入0. IUml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，形成氨基化硅烷壳层；在特定磁场作用下，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤干净后，所得物质即为氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒。实施例2 —种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物的制备方法一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物是由下述优选重量配比的原料组成
5倍自体浓缩血浆75氯化钙0.08亚硫酸钠5.0重组人源血管内皮生长因子冻干粉0.01重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.01氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒1.00.1mol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液18.9一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物的具体制备方法 (以配制IOOml为例)(1)严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血、并同时收集到含抗凝剂的无菌干燥采血管中；轻轻颠倒混勻6到8次，以4000rpm · mirT1的转速离心IOmin ；此时，肉眼可见离心后的采血管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为血浆；中间薄薄一层灰白色为白细胞和血小板；最下面一层红色为红细胞；取出上层的血浆于无菌容器中备用；(2)将准备好的自体血浆置于无菌whatman超滤离心管中，以4000rpm · mirT1的转速离心30min，浓缩至5倍；严格按照无菌要求和上述优选重量配比，将已离心浓缩好的血浆用匹配的专用无菌注射器吸取配方量的自体血浆，并小心转移至特制专用密封无菌血浆收集管中；(3)用分析天平分别准确称取配方量的氯化钙0. 08g、亚硫酸钠5g置于经过洗消过的容器中，加入配方量的生理盐水进行充分溶解，混合均勻，过滤除菌备用；(4)将获得的自体浓缩血浆加入配方量的重组人源血管内皮生长因子冻干粉0. Olg和重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉O.Olg，充分溶解；并加入步骤C3)制备好的液体，轻轻混合均勻备用；(5)精确称取氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒lg，用戊二醛活化，用0. lmol/L 磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，再分散于0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水中；然后，加入上述自体浓缩血浆复合物中，混合均勻，反应30min之后，即为一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物。本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中的学者或工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记在权利要求书中。
权利要求
1. 一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料组成5倍自体浓缩血浆10.0 95.0氯化钙0.001 0.10亚硫酸钠1.0 15.0重组人源血管内皮生长因子冻干粉0. 005 0.5重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0. 005 0.5氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒0.1 10.0O.lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液5.0 90.0。
2.根据权利要求1所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物，其特征在于它是由下述优选重量配比的原料组成5倍自体浓缩血浆75氯化钙0.08亚硫酸钠5.0重组人源血管内皮生长因子冻干粉0.01重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.01氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒1.00.1mol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液18.9c
3.根据权利要求1或权利要求2所述一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物，其特征在于所述的一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物包括以下步骤(1)严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血、并同时收集到含抗凝剂的采血管中；轻轻颠倒混勻6到8次，以4000rpm · mirT1的转速离心IOmin ；此时， 肉眼可见离心后的采血管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为血浆；中间薄薄一层灰白色为白细胞和血小板；最下面一层红色为红细胞；取出上层的血浆于无菌容器中备用；(2)将准备好的自体血浆置于无菌超滤离心管中，以4000rpm· mirT1的转速离心 30min，浓缩至5倍；严格按照无菌要求和上述优选重量配比，将已离心浓缩好的血浆用匹配的专用无菌注射器吸取配方量的自体血浆，并小心转移至特制专用密封无菌血浆收集管中；(3)用分析天平分别准确称取配方量的氯化钙、亚硫酸钠置于经过洗消过的容器中，加入适量的0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水进行充分溶解，混合均勻，过滤除菌备用；(4)将获得的自体浓缩血浆加入配方量的重组人源血管内皮生长因子冻干粉和重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉，充分溶解；并加入步骤C3)制备好的液体中，轻轻混合均勻备用；(5)将配方量的氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒用戊二醛活化，用0.lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，再分散于0. lmol/L磷酸盐缓冲生理盐水中；然后，加入上述自体浓缩血浆复合物中，混合均勻，反应30min之后，即为一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物。
全文摘要
本发明涉及一种可用于面部美容的皮下软组织填充定位纤维蛋白复合物及其制备方法。该复合物由下述重量配比原料组成5倍自体浓缩血浆10.0～95.0，氯化钙0.001～0.10，亚硫酸钠1.0～15.0，重组人源血管内皮生长因子冻干粉0.005～0.5，重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.005～0.5，氨基硅烷化的四氧化三铁磁性微粒0.1～10.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲生理盐水注射液5.0～90.0。自体浓缩血浆在氯化钙和亚硫酸钠的双重作用下，可在数小时内形成稳定的复合纤维蛋白支架，满足了整形美容的需要；同时该复合物在外加磁场作用下，可达到精确定位填充的效果；另外该复合物无过敏性，安全性高，制备简单，填充效果好并能促进填充周围细胞的增殖，修复凹陷处组织，达到强化填充修复的作用。
文档编号A61L27/22GK102284082SQ201110184090
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者丁克祥, 丁宇, 丁振华, 左夏林, 杨永鹏, 罗迎霞, 董萍, 黄学忠 申请人:丁克祥, 董萍