专利名称：一种制备用于体内递送药理活性物质的转铁蛋白纳米粒的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备转铁蛋白纳米粒的方法，属于药理活性物质的体内递送及其临床应用领域。具体来说，本发明是一种药理活性物质包裹进入转铁蛋白，从而形成纳米粒。
背景技术：
静脉注射给药能够快速直接地作用于机体。为了降低静脉注射给药的副作用，有效的方法之一就是将药理活性物质包入微米或纳米级的粒子中。一方面，静脉注射的粒子可以缓释药理活性物质并延长药理活性物质的半衰期；另一方面，靶向材料可以将粒子中的药理活性物质靶向地释放。在现有技术涉及的蛋白粒子的制备方法中，如Abraxane 的制备方法(美国专利 No. 6，749，868，美国专利No. 5，560，933)，将蛋白溶液与有机溶剂均勻混合形成乳化液，高压勻浆，形成以紫杉醇为核心的转铁蛋白纳米粒。除了这种制备方法比较复杂之外，还需要用高压及相应的高温来去除有机溶剂，从而获得纳米粒。二氯甲烷，乙腈等有机溶剂具有毒性，需要控制其残留量。此外，这些方法包载药理活性物质的能力是有限的。同时，由于制备过程中的高压和剪切力，蛋白和多肽还可能失去生物活性。蛋白粒子还被众多文献报道作为药理活性物质和诊断试剂的载体。其中，转铁蛋白微球可以用热交联和化学交联的方法来制备。热交联微球是在100 150°C下从乳化混合物(如转铁蛋白、需包载的药理活性物质和适当的油相)中制备。然后微球用适当的溶剂洗涤并保存。Leucuta等报道了热交联微球的制备方法[International Journal of Pharmaceutics Vol. 41 :213-217 (1988)]；化学交联微球的制备，如文献[Science Vol. 213 :233-235 (1981)]所报道，用戊二醛交联蛋白，然后洗涤并保存。现有技术中蛋白纳米粒的制备方法很难保持蛋白的生物活性。同时，白蛋白作为纳米粒的衣材，其本身不具有靶向性，不能将药物靶向的递送到肿瘤组织。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种制备用于体内递送药理活性物质的转铁蛋白纳米粒的方法，以解决某些药理活性物质由于其疏水的性质而导致无法体内递送，以及形成药物的靶向递送问题。为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a) 第一种溶剂溶解转铁蛋白；(b)在二硫苏糖醇的条件下将药理活性物质加入步骤(a)中所述的转铁蛋白溶液中，把药理活性物质包入蛋白，形成蛋白纳米粒。本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒平均粒径为5 2000nm，优化的为25 500nm，最优的为50 300nm。
本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒可包载占蛋白纳米粒总重量 40%的药理活性物质。本发明技术方案所述的药理活性物质是疏水性药理活性物质，如抗肿瘤药物，心血管药物，抗炎药物，降糖药物，中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。其中，所述的疏水性药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、 卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼臼毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、 地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、Telaprevir (CAS号 4(^957-28-2)、洛匹那韦、或它们的组合。本发明技术方案所述的药理活性物质是亲水性药理活性物质。其中，所述的亲水性药理活性物质是环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其类似物、钼或其类似物、长春碱或其类似物、高三尖杉酯碱或其衍生物、放线菌素-D、丝裂霉素-C、依托泊苷、或它们的组合。本发明技术方案所述的步骤(a)的第一种溶剂是水或者生理盐水。下面是对本发明技术方案的进一步描述除上述总的技术方案以外，本发明进一步提出了一种制备用于体内递送疏水性药理活性物质的转铁纳米粒制备方法，所述方法包含以下几个步骤(a)用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液；(b)在二硫苏糖醇存在的条件下，将疏水性药理活性物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液，把药理活性物质包入蛋白。形成的纳米粒平均粒径为5 500nm， 可包载占粒子总重量约1 40%的疏水性药理活性物质。这里的疏水性药理活性物质可以包括但不局限于紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、 他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、冬凌草甲素、鬼日毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、Telaprevir、洛匹那韦，以及它们的组合。其中，所述的纳米粒子的平均直径优选为25nm 500nm ；最优为50nm 300nm。对本发明所述技术方案的说明本发明所述的“纳米粒”，指的是小的单位，而在转运和性质方面特指为一个整体。 本发明所制备的蛋白纳米粒平均粒径分布于5nm到2000nm之间。一个更好的区间是25nm 到500nm，再一个更好的区间是50nm到300nm。而且，本发明所制备的纳米粒能够结合高达 40%的药理活性物质。本发明中所述的将药理活性物质包入蛋白，指的是药理活性物质可以进入蛋白中心区域。一般来说，药理活性物质包括在给病人服用时，能够产生药理反应的任何的物质。 本发明中的药理活性物质包括疏水和亲水的化合物。本领域技术人员清楚疏水性药理活性物质的水溶性不好，亲水性药理活性物质能够优化的溶解在水中。疏水性的药理活性物质包括如下的化合物，但是不仅仅限于此抗肿瘤药物，心血管药物，抗炎药物，降糖药物， 中枢神经系统药物，免疫抑制药物，以及抗病毒药物。本发明涉及的疏水性药理活性物质可以包括，但是不仅仅局限于此紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、藤黄酸、 冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、 Telaprevir、洛匹那韦，以及它们的组合。更优化的说，具有药理活性的疏水性物质包括抗肿瘤药理活性物质如紫杉醇，多西紫杉醇，伊立替康，卡氯芥，阿霉素，胆留醇对苯乙酸氮芥，哌泊舒凡，他莫昔芬，环己亚硝脲，藤黄酸，冬凌草素甲，鬼白毒素以及它们的衍生物，以及它们的组合。在一个更优化的范围中，疏水性药理活性物质包括紫杉醇和多西紫杉醇。上述的药理活性物质包括晶体形式和无定形形式，其晶体形式包括带有结晶水和不带有结晶水的形式。本发明所涉及的药理活性物质还包括亲水性物质。亲水性物质可以包括如下化合物，但是不仅仅局限于此环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶及其类似物、钼及其类似物、长春碱及其类似物、 高三尖杉酯碱及其衍生物、放线菌素-D，丝裂霉素-C，依托泊苷以及它们的组合。本领域技术人员能够理解本发明中使用的药理活性物质的量会根据蛋白的量的变化而变化，同时根据纳米粒的量的变化而变化。同时，有经验的人能够意识到本发明中使用的药理活性物质，可以是纯的物质，或者是混合物，这些都没有背离本发明的范围。本发明的有益效果在于首先，经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到90%的包封率，超过现有技术，形成了一种高效低耗的方法；其次，本发明所提供的方法能够获得最高达40%的载药量，即纳米粒中含有40%的药理活性物质。由于有更高的载药量，在治疗时，可以获得更小的用药体积，更短的用药时间，对病人更方便。较高的载药量降低了递送药理活性物质时蛋白的使用量，提高了产品的成本效率；最后，现有技术提供的较低载药能力不能满足高剂量给药，因为高剂量的给药需要很大的给药体积。然而，本实验发明的具有高载药能力的纳米粒不会受给药体积的限制。通过本发明制备的纳米粒的另一个有益效果是，纳米粒能够特异性的递送药理活性物质。通过本发明制备的纳米粒子能够靶向一些身体器官和系统。比如，当用转铁蛋白作为载体时，通过改变纳米粒子的大小，靶向肝脏，肺，脾脏或者淋巴系统等。当用转铁蛋白作为载体的时候，它们的受体在细胞表面高表达，通过载体和肿瘤细胞表面的亲和性，可以特异性的将药理活性物质输送到肿瘤组织。因此可以说，本发明提供了一种高效低耗的方法来输送药理活性物质到身体的不同部位。
图1紫杉醇-转铁蛋白纳米粒子扫描电镜图片图2紫杉醇-转铁蛋白投射电镜照片图3紫杉醇-转铁蛋白纳米粒粒子粒径分布4紫杉醇-转铁蛋白纳米粒XRD图
具体实施例方式以下均是基于本发明的代表性实施例，但下述实施例不会在任何方面限制本发明的保护范围。
实施例1.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的制备IOOmg转铁溶于IOmL的含0. 05M 二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液，加入1. 6mL10mg/ mL的紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分钟，加入IOmL的0. 08M的磷酸盐缓冲液搅拌，溶解混合物。得到的悬液透明，载药粒子的平均粒径为80 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱测定紫杉醇的包封率，流动相为乙腈水 (60 40)，检测波长227nm。HPLC分析表明本实验的紫杉醇包封率达到90%以上。实施例2.多西紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的制备IOOmg转铁蛋白溶于IOmL的含0. 05M 二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液，加入 3. 8mL20mg/mL的多西紫杉醇(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分钟，加入IOmL的0. 08M 的磷酸盐缓冲液搅拌，溶解混合物。得到的悬液透明，载药粒子的平均粒径为80 200nm， (BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱测定紫杉醇的包封率，流动相为乙腈水(60 40)，检测波长227nm。HPLC分析表明本实验的紫杉醇包封率达到90%以上。实施例3.阿霉素-转铁蛋白纳米粒的制备IOOmg转铁蛋白溶于IOmL的含0. 05M 二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液，加入 3. 8mL20mg/mL的阿霉素(乙醇溶解)溶液到沉淀中，混合2分钟，加入IOmL的0. 08M的磷酸盐缓冲液搅拌，溶解混合物。得到的悬液透明，载药粒子的平均粒径为80 200nm，(BIC 90plus Particle Size Analyzer) 0用反相C18柱测定紫杉醇的包封率，流动相为乙腈 水(60 40)，检测波长227nm。HPLC分析表明本实验的紫杉醇包封率达到90%以上。实施例4.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的动态光散射(dynamic light scaterring, DLS)分析对按照本发明的方法制备的紫杉醇-转铁蛋白纳米粒进行粒径分析，所用仪器为 BIC 90plus Particle Size Analyzer。结果如图3所示，平均粒径为119nm，且粒径分布在较窄的范围内。实施例5.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)表征按照本发明制备载药量为10. 59%的紫杉醇-转铁蛋白纳米粒进行透射电镜的分析。所用仪器为EM 2100型200KV高分辨率透射电镜(日本)。结果如图2所示，显示纳米粒子呈球形。实施例6.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的扫描电镜表征按照本发明制备载药量为10. 59%的紫杉醇-转铁蛋白纳米粒进行扫描电镜的分析。结果如图1所示，显示纳米粒子呈球形，粒子在IOOnm左右，表面光滑。实施例7.紫杉醇-转铁蛋白纳米粒的X射线粉末衍射(x-ray powder diffraction, XRD)表征紫杉醇在水溶液中超过1 μ g/mL时就会结晶。因此，无定形态的紫杉醇非常有利于注射。为了检测本发明中紫杉醇-转铁蛋白纳米粒中紫杉醇的固体形态，我们使用了 X 射线粉末衍射来进行表征。共制备了四个样品a)紫杉醇；b)转铁蛋白纳米粒；c)紫杉醇转铁蛋白纳米粒(载药量为12.9% ) ；d)紫杉醇和转铁蛋白的物理混合物(12.9% )。每个样品的 Zeta 角测定范围从 5 度到 50 度(ARL，X，TRA，Applied Research Laboratories, Switzerland)。
结果如图4所示图a)显示了紫杉醇晶体的特征峰；在2 θ角为15度到45度范围内，图b)显示出了转铁蛋白的晕型峰；图c)表明在2Θ角为15度到45度范围内，也显示了转铁蛋白的晕型峰，说明在纳米粒中紫杉醇是以无定形的状态存在；在与纳米粒相同比例(12.9%)的紫杉醇和转铁蛋白的物理混合物中，图d)显示了晶体状态的紫杉醇和无定形状态的转铁蛋白的存在。因此，我们可以得到结论本发明制备的紫杉醇-转铁蛋白纳米中紫杉醇以无定形状态存在。
权利要求
1.一种制备用于体内递送药理活性物质的转铁蛋白纳米粒的方法，包括以下步骤(a)溶解转铁蛋白获得转铁蛋白溶液；(b)在二硫苏糖醇存在的条件下，将药理活性物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液中， 形成蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白纳米粒的平均粒径为25nm 500nmo
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质在纳米粒中所占的重量比是 40%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、卡莫司汀、阿霉素、苯芥胆留醇、哌泊舒凡、他莫昔芬、洛莫司汀、 藤黄酸、冬凌草甲素、鬼白毒素、阿托伐他汀、斯伐他汀、非诺贝特、硝苯地平、布洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、格列本脲、地西泮、利哌利酮、齐拉西酮、他克莫司、雷帕霉素、茚地那韦、利托那韦、Telaprevir、洛匹那韦、环磷酰胺、博莱霉素、道诺霉素、表柔比星、甲氨蝶呤、5_氟尿嘧啶或其类似物、钼或其类似物、长春碱或其类似物、高三尖杉酯碱或其衍生物、放线菌素-D、丝裂霉素-C、依托泊苷、或它们的组合。
5.据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的药理活性物质是紫杉醇、多西紫杉醇、 阿霉素或它们的组合。
6.一种包含有紫杉醇的转铁蛋白纳米粒，用于体内药物递送；其特征在于所述的纳米粒的制备步骤通过以下方法(a)溶解转铁蛋白获得转铁蛋白溶液；(b)在二硫苏糖醇存在的条件下，将紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中，将紫杉醇包裹在所述蛋白中所述的纳米粒子直径为50nm 300nm，所述蛋白纳米粒含有 40%重量比的紫杉
7. 一种包含有多西紫杉醇的转铁蛋白纳米粒，用于体内药物递送；其特征在于所述的纳米粒的制备步骤通过以下方法(a)溶解转铁蛋白获得转铁蛋白溶液；(b)在二硫苏糖醇存在的条件下，将多西紫杉醇加入到步骤(a)所述的蛋白溶液中，将多西紫杉醇包裹在所述蛋白中所述的纳米粒子直径为50nm 300nm，所述蛋白纳米粒含有 40%重量比的多西紫杉醇。
全文摘要
本发明是利用二硫苏糖醇将药理活性物质包入转铁蛋白，形成纳米粒，用于体内递送。
文档编号A61K31/337GK102293747SQ20111019573
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者吴锦慧, 王永毅, 陈晶 申请人:南京从一医药咨询有限公司