专利名称：一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因工程疫苗，尤其是一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗及其制备方法。
背景技术：
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，广泛分布于世界各地。据报道， 有170多个国家和地区有布鲁氏菌病的疫情。在畜牧业，有牛布鲁氏菌病、羊布鲁氏菌病、 猪布鲁氏菌病等，其中牛的布鲁氏菌病最为严重。在海洋哺乳动物体内也分离出该细菌。 历史上该病在我国曾是危害极为严重的人畜共患病。近年来我国布鲁氏菌感染率更是呈现上升趋势，这为布鲁氏菌病防治提出了新的挑战。现有的畜用疫苗有减毒活疫苗和灭活疫苗。传统的减毒活疫苗仍存在一些缺点，对人仍是致病菌；并且可引起怀孕动物的流产；成年动物接种后干扰血清学诊断，使感染与免疫难于鉴别。随着分子生物学、分子免疫学发展与应用，基因工程疫苗已经成为人们研究的热点，但目前尚未有关于重组牛痘病毒疫苗用于防治布鲁氏菌病的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗。本发明还提供了该重组牛痘病毒疫苗的制备方法为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗，其将牛种布鲁氏菌主要外周浆蛋白 bp26重组于牛痘病毒，构建重组牛痘病毒。上述重组牛痘病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤
①以牛种布鲁氏菌基因组为模板，PCR扩增牛种布鲁氏菌基因；
②将目的基因克隆至牛痘病毒载体中，构建重组牛痘病毒穿梭质粒；
③利用脂质体将重组牛痘病毒穿梭质粒转染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，筛选得到牛种布鲁氏菌重组牛痘病毒(最终筛选纯化得到的重组牛痘病毒应至少占总病毒的80%)。所述的重组即牛种布鲁氏菌外周浆蛋白bp^基因整合至牛痘疫苗株病毒。本发明的创新点在于将牛种布鲁氏菌基因组中高度保守且免疫原性较好的重要外周浆蛋白的编码基因bp^重组于牛痘病毒构建重组牛痘病毒。所用牛种布鲁氏菌可以为现有菌株，如野生菌(包括标准株和野毒株)、疫苗株。本发明所用牛种布鲁氏菌S19购自中国疾病预防控制中心。所述编码基因bp^5，又名CP^ 或0MP28，是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白，是一种可以由细胞内向外释放的可溶性蛋白。有报道显示，在牛、绵羊、山羊和人类的布鲁杆菌感染中均可以检测到原的存在。所述外周浆蛋白可以在NCBI中查到，登陆号为U45996，bp^基因全长75!3bp，其可以通过利用生物软件设计引物，以牛种布鲁氏菌基因组为模板，进行PCR扩增得到。然后将扩增得到的因定向插入牛痘病毒载体，用脂质体转染法与牛痘弱毒株病毒共转染 BHK-21细胞，最终筛选得到重组牛痘病毒。和现有技术相比，本发明的有益效果本发明通过对布鲁氏菌基因组中功能基因的筛选，将具有良好免疫原性的牛种布鲁氏菌基因重组于牛痘病毒，可刺激机体产生抵抗各种血清型的布鲁氏菌病的感染，从而为我国布鲁氏菌病的防治提供了新的方法，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除与净化具有十分重要的意义。实验证明，所述的重组病毒毒力明显低于野毒株，并且低于市面上的疫苗株，而其免疫保护效力与现有疫苗相当，因此，此重组病毒可用于牛种布鲁氏菌疫苗的开发。该重组疫苗，活性成分上主要是上述牛种布鲁氏菌。
图1为PCR扩增产物bp^的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图2为PCR扩增得到的基因片段的测序结果；
图3为重组牛痘病毒穿梭质粒的构建流程图； 图4为重组牛痘病毒穿梭质粒的PCR鉴定结果； 图5为牛种布鲁氏菌重组牛痘病毒的PCR鉴定结果。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例所用LB液体培养基组成为1% 胰蛋白胨、1%氯化钠和0. 5%酵母提取物；LB固体培养基组成为1%胰蛋白胨、1%氯化钠、 0. 5%酵母提取物和1. 5%琼脂。实施例1
一种重组牛痘病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤 (一)PCR扩增bp洸基因
以牛种布鲁氏菌S19基因组为模板，以bp261和为引物，PCR扩增牛种布鲁氏菌 bp^基因，引物序列如下
Bp261 (上游引物)5，-ATGAACACTCGTGCTAGC-3， Bp262 (下游引物)5，-TTACTTGATTTCAAAAACG-3，
反应体系如下表1 ；反应参数为96°C预变性^iin ；94°C变性30s，65°C退火30s，72°C 延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin，置于冰箱4°C保存。
权利要求
1.一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗，其特征在于，将牛种布鲁氏菌外周浆蛋白bp^重组于牛痘病毒，构建重组牛痘病毒。
2.权利要求1所述重组牛痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤①以牛种布鲁氏菌基因组为模板，PCR扩增牛种布鲁氏菌基因；②将目的基因克隆至牛痘病毒载体中，构建重组牛痘病毒穿梭质粒；③利用脂质体将重组牛痘病毒穿梭质粒转染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，筛选得到牛种布鲁氏菌重组牛痘病毒。
全文摘要
本发明涉及一种治疗牛种布鲁氏菌病的重组牛痘病毒疫苗，其将牛种布鲁氏菌外周浆蛋白bp26重组于牛痘病毒，构建重组牛痘病毒。具体方法如下先以牛种布鲁氏菌基因组为模板，PCR扩增牛种布鲁氏菌bp26基因；然后将目的基因bp26克隆至牛痘病毒载体中，构建重组牛痘病毒穿梭质粒；最后利用脂质体将重组牛痘病毒穿梭质粒转染至已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，筛选得到牛种布鲁氏菌重组牛痘病毒。本发明将具有良好免疫原性的牛种布鲁氏菌bp26基因重组于牛痘病毒，可刺激机体产生抵抗各种血清型的布鲁氏菌病的感染，重组病毒的毒力明显低于野毒株，为我国布鲁氏菌病的防治提供了新方法。
文档编号A61P31/04GK102258775SQ20111020317
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者张海涛, 张遂平, 李明魁, 李贞 , 赵全成, 辛瑞祥, 郭芳茹, 闫树森 申请人:河南亚卫动物药业有限公司