专利名称：一种培养坐骨神经许旺细胞的方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种培养坐骨神经许旺细胞的方法，具体涉及一种通过体外预变性的坐骨神经培养及纯化许旺细胞的方法。
背景技术：
研究报道，组织工程化人工神经的发展为周围神经损伤修复提供了一种新的途径，其中，许旺细胞(Schwann cell, SC)作为组织工程化人工神经的种子细胞，在周围神经损伤的修复中发挥了重要作用。所述许旺细胞的存在为神经轴突的再生提供了良好的微环境，其通过分泌相应的神经生长因子及细胞外基质引导轴突向远端生长；但由于SC是一种终末期细胞，直接取材进行许旺细胞培养，细胞很难贴壁，扩增差，很难得到高纯度及大量的SC，因此，限制了人工神经在临床上的应用。目前，国内外许多学者研究将干细胞向类许旺细胞诱导来解决此难题，但存在诱导率低、诱导条件撤离后再次向干细胞形态转归及致瘤性等缺点，因此限制了其进一步的应用。·解决上述问题的根本是获得大量的高纯度的增值能力强的许旺细胞，而实现这一目的的较佳途径就是进行许旺细胞尤其是成年体的许旺细胞体外培养，从而扩增获得足够量的细胞满足人工神经的需要。但成年许旺细胞作为一种终末细胞，其增殖能力差，很难在体外培养、扩增。目前有研究表明，SC在生长发育的不同阶段及损伤修复过程中表达不同的标记，表明SC并不是一个功能结构同质体，其在不同阶段有不同的增殖生长能力。有研究显示，神经损伤的瓦勒变性过程中，SC发生去分化变化，表达神经营养因子、细胞粘附分子及不成熟SC标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、P75nte的上调，而上述变化有利于细胞的增殖及粘附，促进神经的再生，可能有利于SC的体外贴壁培养、扩增，从而能获得大量的SC满足人工神经的需要。有研究通过体内预变性(瓦勒变性)一周后体外再培养获得了大量的增殖能力强的SC(1999年Keilhoff等)，证实通过预变性再行细胞培养可以获得大量的增殖能力强的SC ;但所述的体内预变性需要进行两次手术，明显需要花费较长的时间，以至延误了治疗时机；同时，由于存在个体差异，体内预变性达到所需效果的时间点难以控制，故，临床应用受到限制。因此，有研究将成年小鼠的坐骨神经取出放在体外培养液(DMEM+10%FBS)中预先培养一段时间模拟体内的微环境，经培养获取许旺细胞SC，但其纯度尚不理想。本领域公知，作为组织工程人工神经的种子细胞需要有较高的纯度，目前尚未见有关获得高纯度许旺细胞方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种培养坐骨神经许旺细胞的方法，具体涉及一种通过体外预变性的坐骨神经培养及纯化许旺细胞的方法。该方法能简单、有效的获取大量、高纯度的许旺细胞。本发明方法将获取的试验动物坐骨神经通过体外预变性后，进行细胞培养获得大量高纯度许旺细胞，本发明的实施例中，采用获取的成年实验小鼠坐骨神经培养许旺细胞，培养的许旺细胞能满足组织工程人工神经的需要。本发明中，细胞培养的培养液中加入促进SC生长的因子Forskolin、heregulin-β-Ι、碱性成纤维细胞生长因子(b_FGF)制成SC培养液(SCCM)，能达到更好的
培养效果；本发明中，将获取的试验动物坐骨神经分别置于SCCM、DMEM+10% FBS培养液中，将Armin kram等的实验作为阳性对照，预变性一周后，结果显示，SCCM中获得细胞量为
2.56X IO6,明显高于DMEM+10% FBS组及未经预变性组；细胞接种48小时后，光学显微镜下见大量细胞贴壁生长，经免疫荧光染色证实大部分为许旺细胞SC，仅见少量成纤维细胞混杂。具体而言，本发明的培养坐骨神经许旺细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤 (I)将获取的神经段分别置于DMEM+10% FBS、许旺细胞培养液(SCCM)中，5%C02, 37°C培养箱中，孵育，进行预变性，每隔3天换液一次；(2) 一周后吸除培养液，剪碎处理上述神经段，用3-20倍组织量的质量体积比为
O.05 O. 3%的消化酶溶液消化神经组织碎块45 90分钟；所述的消化酶为酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；(3)将步骤(2)得到的混悬液用吸管反复吹打3 5分钟，获得解离的细胞；(4)对步骤(3)解离的细胞在600_1500g离心3_10分钟，弃上清，得到细胞团块；(5)用许旺细胞培养液(SCCM)重悬步骤⑷得到的细胞，以1x104_5x104个/cm2接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿，获得许旺细胞。本发明的一个实施例中，所得到的许旺细胞进一步经过纯化获得高纯度的许旺细胞，所述的纯化过程包括吸去培养液,加入2 3ml质量体积比为O. 06 O. I %的酵素酶，置37°C、5% CO2培养箱作用15 30分钟；然后水平轻轻振荡所得细胞；收集细胞混悬液，以600g离心5 10分钟，弃去上清，获得高纯度细胞。本发明方法中，还包括检测分离获得的许旺细胞的标志物p75、slOO和GFAP的步骤。本发明中，所述的消化酶选自胶原酶NB4或酵素酶，其中，胶原酶NB4的浓度为
O.05 O. 3%，优选O. I O. 2%，酵素酶的浓度为O. 05 O. 3%，优选O. I O. 2%。本发明中，所述的DMEM培养基(可购自GIBCO，SIGMA等公司)；所述的DMEM培养基中，含有各种氨基酸和葡萄糖，根据其中的D (+)-葡萄糖的含量又分为高糖型(低于4. 5g/L)和低糖型(低于I. Og/L)。本发明中，所述的酵素酶即dispase(dispase又称为分散酶、中性蛋白酶)购自sigma公司ο本发明中，在DMEM培养基中力卩入2μΜ毛喉職(Forskolin), 10ng/mlheregulin-β-I制成许旺细胞培养液,其中，毛喉職(Forskolin)为多种组织细胞腺苷环化酶的特异性激动剂。本发明通常采用免疫荧光法和流式细胞仪鉴定细胞种类和纯度，可采用常规的操作方法或者按照下述方法进行；
(I)免疫荧光法将经过第一次纯化的许旺细胞种植在6孔板中，12小时待细胞贴壁后，用4%多聚甲醛固定20分钟，然后PBS洗三次，每次5分钟；再加入羊血清封闭30分钟，然后弃掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗体37°C孵育2小时，然后用PBS清洗三遍，每次5分钟，再加入PE表记的羊抗兔单克隆抗体常温孵育I小时后PBS清洗三遍，每次5分钟，然后加入DAPI染细胞核10秒钟，然后加入PBS Iml荧光显微镜拍照；随机取6个100倍视野计数，计算许旺细胞纯度；相同方法鉴定经过第二次纯化的许旺细胞，计算许旺细胞纯度；
(2)流式细胞仪鉴定许旺细胞纯度将纯化后的许旺细胞，收集到离心管中，加入O. 25%胰酶2分钟进一步分散，加入适量10%血清的培养液中和胰酶，然后用单细胞滤器过滤，用含4%血清的PBS即Buffer液清洗两边，然后加入一抗，37度孵育30分钟，然后用4% FCS清洗三遍，再加入二抗常温孵育30分钟，然后清洗三遍，重悬于O. 5ml 4% FCS中，流式细胞仪检测。本发明中，经测试鉴定，获得的许旺细胞(亦称原代细胞)的纯度达到91%，而阳性对照DMEM+10% FBS组仅为83% ;进一步纯化的许旺细胞的纯度高达98%，结果表明，由于体外的预变性促进了许旺细胞的增殖从而抑制了成纤维的增值，最终能获得有较高的纯度的许旺细胞。本发明的培养坐骨神经许旺细胞的方法，克服了现有技术中由于成年小鼠许旺细胞活性差很难体外培养扩增的缺陷，通过体外预变性的坐骨神经培养及纯化步骤，能简单、有效的获取大量、高纯度的许旺细胞，为损伤神经修复提供了丰富、优质的许旺细胞，可用于在组织工程中作为神经种子细胞；本方法为一种组织工程学中获得种子细胞的新方法，应用前景广泛。
图I显示了本发明原代细胞计数及原代与纯化后许旺细胞纯度比较情况。图2为本发明原代培养的许旺细胞图，其中，A为未发生预变性下，原代培养的许旺细胞图，B为DMEM+10% FBS中发生预变性下，原代培养的许旺细胞图，C为SCCM中发生预变性下，原代培养的许旺细胞图。图3为本发明中原代培养的许旺细胞P75N S疫荧光染色图，其中，A为未发生预变性下，原代培养的许旺细胞P75ntk免疫荧光染色图，B为DMEM+10% FBS中发生预变性下，原代培养的许旺细胞P75 免疫荧光染色图，C为SCCM中发生预变性下，原代培养的许旺细胞P75 免疫荧光染色图。图4为本发明中许旺细胞光镜观察图，其中，A为SCCM中发生预变性下，原代培养的许旺细胞光镜观察图，B为与A相对应的SlOOii蛋白荧光染色图，C为SCCM中发生预变性下，经过纯化后的许旺细胞光镜观察图，D为与C相对应的SlOOii蛋白荧光染色图。图5为本发明中坐骨神经切片SlOOP蛋白荧光染色激光共聚焦扫描图，其中，A为未发生预变性下，坐骨神经切片SlOOP蛋白荧光染色激光共聚焦扫描图，
β为DMEM+10% FBS中发生预变性下，坐骨神经切片SlOOP蛋白荧光染色激光共聚焦扫描图，C为SCCM中发生预变性下，坐骨神经切片SlOOii蛋白荧光染色激光共聚焦扫描图，D为A中阴影部位的放大图，E为B中阴影部位的放大图，F为C中阴影部位的放大图。
具体实施例方式实施例I未发生预变性坐骨神经下细胞培养 实验材料15ml离心管,C57小鼠,50ml培养瓶，复合胶原酶、dispasell兔抗鼠多克隆SlOO抗体(一抗A)、兔抗鼠P75 抗体(一抗)羊抗兔PE标记抗体(二抗)等。如非特别说明，本发明的试剂均购自Sigma公司。常规无菌情况下取得成年C57小鼠双侧坐骨神经。(I)剪碎取得的坐骨神经，用3-20倍组织量的质量体积比为O. 2%胶原酶NB4与
O.2% dispase混合酶DMEM溶液消化神经碎块60 90分钟；(2)将步骤⑴得到的混悬液用吸管反复吹打3 5分钟；(3)对步骤⑵中解离的细胞在600g离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；(4)用许旺细胞培养液重悬步骤(3)得到的细胞,血细胞计数板行细胞计数；(5)以1χ104-5χ104个/cm2接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿，5% C02，37°C培养箱中，孵育；(6) 24h，48h光镜下观察细胞细胞生长状况，48h后行P75 免疫荧光染色。光镜下观察细胞生长较差，较少许旺细胞贴壁生长，大部分成为悬浮的死细胞。实施例2DMEM+10% FBS中预变性的坐骨神经下细胞培养实验材料15ml离心管，C57小鼠,50ml培养瓶，复合胶原酶、dispasell兔抗鼠多克隆SlOO抗体(一抗A)、兔抗鼠P75 抗体(一抗)羊抗兔PE标记抗体(二抗)等。如非特别说明，本发明的试剂均购自Sigma公司。常规无菌情况下取得成年C57小鼠双侧坐骨神经。(I)将获取的神经段置于DMEM+10%FBS中，5%C02，37°C培养箱中，孵育一周发生预变性；(2)每隔3天换液一次；(3)剪碎取得的坐骨神经，用3-20倍组织量的质量体积比为O. 2 %胶原酶NB4与
O.2% dispase混合酶DMEM溶液消化神经碎块60 90分钟；(4)将步骤(3)得到的混悬液用吸管反复吹打3 5分钟；(5)对步骤(4)中解离的细胞在600g离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；(6)用许旺细胞培养液重悬步骤(5)得到的细胞，血细胞计数板行细胞计数；(7)以1χ104-5χ104个/cm2接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿，5% C02，37°C培养箱中，孵育；⑶24h，48h光镜下观察细胞细胞生长状况，48h后行P75 免疫荧光染色，随机选取3个视野行细胞计数，计算许旺细胞纯度。光镜下观察细胞生长状况，较多双极或三极样的许旺细胞贴壁生长，但较多的成纤维细胞混杂，双极或三极样的许旺细胞P75ntk免疫荧光染色均为阳性，经细胞计数后的纯度计算为83%。实施例3SCCM中预变性的坐骨神经下细胞培养实验材料15ml离心管,C57小鼠,50ml培养瓶，复合胶原酶、dispasell兔抗鼠多克隆SlOO抗体(一抗A)、兔抗鼠P75 抗体(一抗)羊抗兔PE标记抗体(二抗)等。如非特别说明，本发明的试剂均购自Sigma公司。常规无菌情况下取得成年C57小鼠双侧坐骨神经。 (I)将获取的神经段置于SCCM中，5% C02，37°C培养箱中，孵育一周发生预变性；(2)每隔3天换液一次；(3)剪碎坐骨神经，用3-20倍组织量的质量体积比为O. 2%胶原酶NB4与O. 2%dispase混合酶DMEM溶液消化神经碎块60 90分钟；(4)将步骤(3)得到的混悬液用吸管反复吹打3 5分钟；(5)对步骤(4)中解离的细胞在600g离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；(6)用许旺细胞培养液重悬步骤(5)得到的细胞，血细胞计数板行细胞计数；(7)以1χ104-5χ104个/cm2接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿，5% C02，37°C培养箱中，孵育；⑶24h，48h光镜下观察细胞细胞生长状况，48h后行P75·、SlOO β免疫荧光染色，随机选取3个视野行细胞计数，计算许旺细胞纯度；(9) 48h后对上述的细胞进行纯化；(10)再次培养48h后光镜下观察细胞生长，SlOO β免疫荧光染色，随机选取3个视野行细胞计数，计算许旺细胞纯度。光镜下观察细胞生长状况，双极或三极样的许旺细胞贴壁生长，较少细胞悬浮，双极或三极样的许旺细胞Ρ75 免疫荧光染色均为阳性，而仅少量阴性的成纤维细胞混杂，经细胞计数后的纯度计算为91%，而经过一次简单的纯化后许旺细胞纯度达到了 98%。结果显示，实施例1-3均能获得许旺细胞，且经过P75n 、SlOO β免疫荧光染色证实，双极或三极样许旺细胞均为阳性；其中，实施例3的效果最好，获得细胞量2. 56 X IO6明显高于实施例I、2，其原代细胞纯度91%，经过一次简单纯化后达到98%。上述实施例的结果表明，本发明的培养坐骨神经许旺细胞的方法，克服了现有技术中由于成年小鼠许旺细胞活性差很难体外培养扩增的缺陷，通过体外预变性的坐骨神经培养及纯化步骤，能简单、有效的获取大量、高纯度的许旺细胞，为损伤神经修复提供了丰富、优质的许旺细胞，可用于在组织工程中作为神经种子细胞；本方法为一种组织工程学中获得种子细胞的新方法，应用前景广泛。
权利要求
1.一种培养成年小鼠坐骨神经许旺细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将获取的神经段分 别置于DMEM+10%FBS、许旺细胞培养液(SCCM)中，5% C02，37°C培养箱中，孵育，进行预变性，每隔3天换液一次； (2)—周后吸除培养液，剪碎处理上述神经段，用3-20倍组织量的质量体积比为O. 05 O. 3%的消化酶溶液消化神经组织碎块45 90分钟； (3)将步骤(2)得到的混悬液用吸管反复吹打3 5分钟，获得解离的细胞； (4)对步骤(3)解离的细胞在600-1500g离心3-10分钟，弃上清，得到细胞团块； (5)用许旺细胞培养液(SCCM)重悬步骤(4)得到的细胞，以1χ104-5χ104个/cm2接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿，获得许旺细胞。
2.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤 步骤(5)获得许旺细胞，吸去培养液，加入2 3ml质量体积比为O. 06 O. I %的酵素酶，置37°C、5% CO2培养箱作用15 30分钟；水平振荡；收集细胞混悬液，以600g离心5 10分钟，弃上清，获得高纯度细胞。
3.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的消化酶选自酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶NB4的浓度为O.05 O. 3%。
5.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶NB4的浓度为O.I O. 2%。
6.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酵素酶的浓度为O.05 O. 3%。
7.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酵素酶的浓度为O.I O. 2%。
8.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤 检测分离获得的许旺细胞的标志物P75、slOO和GFAP。
9.按权利要求I所述的方法，其特征在于，获得的许旺细胞作为组织工程中神经种子细胞的用途。
全文摘要
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种培养成年小鼠坐骨神经许旺细胞的方法。本发明还包括经过纯化过程获得更高的纯度的许旺细胞的方法。获得的许旺细胞纯度达到91％，再纯化后其纯度高达98％，结果表明，由于体外的预变性促进了许旺细胞的增殖从而抑制了成纤维的增值，能获得有较高的纯度的许旺细胞。本发明方法通过体外预变性的坐骨神经培养及纯化步骤，能简单、有效的获取大量、高纯度的许旺细胞，为损伤神经修复提供了丰富、优质的许旺细胞，可用于在组织工程中作为神经种子细胞。
文档编号A61L27/38GK102899290SQ20111021691
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者王晓盼, 沈尊理, 秦金保, 金羽青 申请人:上海市第一人民医院