专利名称：仙人掌果多糖在制备降血糖作用的药物或保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及仙人掌果及仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用，属于天然植物资源的利用技术领域。
背景技术：
广西北海涠洲岛是我国最大的死火山岛，岛上的熔岩给仙人掌生长提供了充足的养分，加之适宜的热带气候，形成了成片野生的仙人掌。而且岛上的仙人掌四季都可以结出数量可观的仙人掌果。涠洲岛产仙人掌果具有特有的胭脂红色，其中富含矿物质(如硒) 和硫磺酸。但迄今为止，涠洲岛盛产的仙人掌果除了极少量被当地居民或旅游者食用外，绝大部分都枯烂在地里，或被鸟、蛇等作为了腹中之餐，造成了资源的极大浪费，严重影响了仙人掌果的充分开发利用。中草药及其活性成分的药用功能具有多靶点、多途径、多环节的特点，成为现代药物开发的热点，因此近年来天然植物在疾病预防和治疗方面的作用引起人们的广泛关注和重视。仙人掌作为一种天然植物，具有良好的观赏价值、食用价值、保健价值和药用价值，并且药源丰富，无毒无异味，开发产品安全方便。近年来，动物实验及人体试验证明，仙人掌具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗菌、消炎等药理作用。仙人掌果(Opimtia ficus-indica)为仙人掌属(Opimtia)植物的果实，果肉含有丰富的微量元素、蛋白质、氨基酸、维生素、多糖类、黄酮类和果胶等。印第安人和墨西哥人将其作为食物和药物使用已有几千年的历史。国内外对仙人掌根茎具有降血脂和降血糖等作用均有报道，但仙人掌果是否也具有降血脂和降血糖等活性未见报道。鉴于仙人掌果资源充足，广西北海涠洲岛产仙人掌果颜色鲜艳，口感甘甜，维生素和多糖的含量高，因此本申请人对仙人掌果以及从其中分离出的有效部位仙人掌果多糖进行了相关的药理试验研究和探索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是根据仙人掌果所含的成分，将仙人掌果及从其中提取分离出的仙人掌果多糖用于制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中。本发明是这样构成的仙人掌果(Opuntia ficus-indica)在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用。
仙人掌果多糖在制备降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤作用的药物或保健品中的应用。所述仙人掌果多糖是从仙人掌果中提取出来的多糖类成分，其总糖含量为70% 80%。具体的仙人掌果多糖的制备方法为取仙人掌果，加4 10倍重量的水超声提取 0. 5 2. 5小时，提取液浓缩，加入40 95%的乙醇，调节浓缩液的乙醇浓度至40 90% 进行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm转速下离心2 lOmin，离心沉淀物加水溶解，用体积比为1 5 2 10的无水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓缩，干燥，即得。其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具体过程为用Sevage溶液(体积比氯仿正丁醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶液中加入 1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65°C保温20 ^h，1000 IOOOOrpm离心2 lOmin， 去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。具体的说，仙人掌果、仙人掌果多糖的应用方法为取仙人掌果或仙人掌果多糖， 加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。或者将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它药用成分组合，并加入或不加药用辅料， 按照常规方法制备成药物制剂。还可以取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健
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ΡΠ O或者将仙人掌果或仙人掌果多糖与其它物质组合，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。为了验证本发明的效果，下面将通过仙人掌果多糖的制备及对仙人掌果原汁和仙人掌果多糖进行的药效试验研究来进一步阐述本发明。一、仙人掌果多糖的提取纯化取仙人掌果，加4 10倍重量的水超声提取0. 5 2. 5小时，提取液浓缩，加入 40 95%的乙醇，调节浓缩液的乙醇浓度至40 90%进行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm 转速下离心2 lOmin，离心沉淀物加水溶解，用体积比为1 5 2 10的无水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓缩，干燥，即得仙人掌果多糖。Sevage+木瓜蛋白酶法用kvage溶液(体积比氯仿正丁醇=4 10 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶液中加入1 如/IOOml的木瓜蛋白酶，45 65°C保温20 ^h，1000 IOOOOrpm离心2 lOmin，去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。经测定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量达60 80%。二、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血压作用的试验研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖单次及连续9周给药对原发性高血压大鼠(SHR)的收缩压和心率(HR)影响1. 1实验动物选择16 周(w)龄雄性 SHR60 只，收缩压(SBP)彡 23. 94kPa (IkPa = 7. 5mmHg)，体重O50士50)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号SCXK(沪)2003-0003 ； 同龄雄性Wistar大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号桂动许字2000第 001号。饲养在配备空调的动物房内，室温(25士2) °C，自由饮水。1. 2实验方法1.2. 1分组及给药实验前驯化并行适应性测压训练2w，待适应环境，随机分为6组即模型组(NC) 给蒸馏水；CPFP高剂量组(HD)、中剂量组(MD)、低剂量组(LD)分别给3. 06g · kg-1 · cf1， 1. 58g · kg—1 · d—1，。· 79g · kg—1 · cf1 的 CPFP ；仙人掌果原汁组(NJ)给 3. 15g · kg—1 · cf1 仙人掌果原汁(CPNJ)；卡托普利组(PC)给0. Olg · kg-1 · cf1卡托普利；正常对照组(Wt) Wistar大鼠给蒸馏水。每组10只，给药途径为灌胃。1. 2. 2测压方法用小型电吹风机对准大鼠尾巴腹侧烘热，待大鼠尾巴皮肤变为微红时，将血压计的压脉套套至大鼠尾部近心端处，高敏换能器置于尾巴中上1/3处，换能器表面对准尾部腹侧，固定，松紧以换能器用手推不动为好。待大鼠平静之后，打开记录系统，可见有脉搏波出现，用充气囊使压脉套内的压力升高到脉搏波完全消失再加压升高3. 99kPa，然后通过充气囊阀门缓慢放气逐渐降低压脉套内压力，从开始放气到管道内压力为零一般维持时间 5 6秒。仔细观察脉搏波从被阻断到再次出现第一个波，这第一个波出现时所对应的压力即为SBP。取连续3次测压值的平均值作为应测SBP值，分别测定第一次用药前、用药后 2小时(h)、4hJh、8h、12h、24h及连续给药9w期间每周SHR的SBP和HR。然后再根据脉搏波间接推算出HR。1. 2. 3统计学处理应用SPSSl 1. 0软件进行统计学处理，计量资料均采用〒土 S表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析。1. 3实验结果 1. 3. 1单次给药对SHR的SBP和HR影响单次给予CPFP后池即有明显的降压效应，4h降压效应达到高峰。4h时HD与治疗前相比有显著性差异(P < 0. 05)，MD和LD降压效应较HD稍弱，与治疗前比较均无显著性差异(P >0.05)。PC给予卡托普利后，池血压下降达到高峰，与NC和治疗前比较有显著性差异(P < 0. 05)，降压幅度最大值为0. 80士8. 03kPa,优于HD降压幅度最大值 (0. 68士8. 02kPa)。从降压疗效维持的时间来看，PC给药他后SBP恢复到治疗前水平，CPFP 各给药组给药1 后恢复到治疗前水平，其降压稳定性优于PC ；从降压幅度来看CPFP降压呈现明显的量效和时效关系。上述各组给药后Mh内HR无明显变化(P > 0. 05)。1. 3. 2连续9w给药对SHR的SBP和HR影响各给药组在用药2w后SBP下降幅度开始明显，至8w SBP降幅减缓，基本稳定在一个较低的水平。PC、HD和MD分别在#、5w和6w开始与治疗前相比有非常显著性意义(P <0.01)，LD和NJ自身前后比较也有差异(P<0. 05)。NC在实验期间血压趋于升高，9w后 SBP平均升高了 1. OOkPa,与治疗前相比有非常显著性差异(P < 0. 01)。组间对比PC、HD、 MD、LD和NJ分别在3w3w、5w、6w和5w降压效果均显著优于NC (P < 0. 01)，其降压的最大均值分别为 2. 16士0. 18,1. 59士 1. 44,1. 42士0. 16,0. 87士0. 18 和 0. 82士0. 19kPa,从降压幅度来看PC的降压疗效优于CPFP给药组，但它们之间无显著性差异(P > 0. 05)。另外，从降压幅度来看CPFP连续给药9w降压也呈现明显的量效和时效关系。用药各组对HR的影响较小，用药前后经统计学处理无显著性差异(P > 0. 05)。2.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)血浆肾素(RA)和血管紧张素II (AngII)的影响2.1实验动物同实验1。2. 2实验方法2. 2.1分组及给药同实验1，给药时间为9w。2. 2. 2实验步骤连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml ·1 Ρ)，自腹主动脉取血各2ml分别置于预冷的含乙二胺四乙酸(EDTA)、二巯基丙醇和 8-羟基喹啉试管中，混勻，4°C，3000转/分(rpm)离心lOmin，分离血浆，_20°C密封保存待测。血浆RA活性的测定，即测定血浆中血管紧张素I (AngI)产生的速率。取双份血浆， 一份让其直接与抗体反应，测其AngI的浓度，作为对照管；另一份在37°C温育30min后再让其与抗体反应，测其AngI的浓度为测定管。测定管AngI的浓度减去对照管AngI的浓度并除以温育时间，则为单位时间内AngI的产生速度，称RA活性。AngII水平的测定操作步骤严格按照分析药盒使用说明书进行，待加样操作结束后混勻，室温放置15min，3500rpm离心15min，吸上清液测定各管沉淀的放射性计数(cpm)， 并由r计数器预先编制的程序直接给出有关参数、标准曲线和样品浓度。2. 2. 3统计学处理同实验1。2. 3实验结果HD和PC有降低血浆肾素活性的作用，与NC相比均有显著性差异(P < 0. 05)，但 HD与PC之间无显著性差异(P > 0. 05)。在降低血浆AngII方面，PC最强，HD次之，与NC 比较均有非常显著性差异(P < 0. 01)，但HD与PC之间相比无统计学意义(P > 0. 05) ；LD 和NJ相对较差，与NC比无显著性差异(P > 0. 05)。从而提示HD有类似于血管紧张素转换酶抑制剂的作用机制。3.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)血浆内皮素(ET)和一氧化氮(NO)的影响3.1实验动物同实验1。3. 2实验方法3. 2.1分组及给药同实验1，给药时间为9w。3. 2. 2实验步骤连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主动脉各取血2ml置于含10% EDTA30 μ 1试管中，混勻。4°C放置约2h 后，3000rpm离心IOmin分离血浆，_20°C密封保存待测。测试前复融，按照ΕΤ、Ν0分析药盒说明书进行严格操作。3. 2. 3统计学处理同实验1。3. 3实验结果与NC相比较，HD和MD有明显降低SHR血浆ET的作用(P < 0. 05)，但与PC相比
6无显著性差异(P > 0. 05) ；PC、HD和MD能显著增加NO含量(P < 0. 01或P < 0. 05)，但与 PC相比均无显著性差异(P > 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)血浆NA和肾上腺素 (Adr)的影响4.1实验动物同实验1。4. 2实验方法4. 2.1分组及给药同实验1，给药时间为9w。4. 2. 2色谱条件色谱柱为C18色谱柱O50mmX4. 0mm, 5 μ m)；柱温为室温；流动相为甲醇-0. 15mol化―1磷酸二氢钾缓冲液(1 9，ρΗ6· 0)；流速为Iml .mirT1 ；检测波长为280nm。 此条件下分别以NA和Adr计算理论塔板数不低于3000。4. 2. 3实验步骤连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg"1),自腹主动脉取血1.5ml置于含肝素试管中，混勻，4°C条件下2000rpm离心 15min，分离血菜；取血浆100 μ 1，加0. 05mol .171高氯酸200 μ 1，IOOOOrpm离心2min，倒入 Millipore Ultra-free-Mc 离心管，IOOOOrpm 离心 3min 后置 _20°C冰箱待测。4. 2. 4统计学处理同实验1。4. 3实验结果血浆样品的测定取“4. 2. 3”项处理好的血样超滤液按上述色谱条件分析，给药 9w后HD和PC与NC比较，NA显著降低(P < 0. 05)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)心脏重量及其指数的影响5.1实验动物同实验1。5. 2实验方法5. 2.1分组及给药同实验1，给药时间为9w。5. 2. 2实验步骤连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主动脉取血后，快速取心，置预冷生理盐水中洗净，剪去残余组织，用滤纸吸干表面水分，分离左右心室并称重，室间隔归左室。称取左心室重量，计算表示左心室肥厚程度的左室重量指数(左心室重与体重比)。5. 2. 3统计学处理同实验1。5. 3实验结果与NC相比，各给药组的左室重量、左室重量/右室重量和心室重量/体重有显著性差异(P < 0. 05或P < 0. 01) ；CPFP给药组与PC比较左室重量无明显差别(P > 0. 05)。6.仙人掌果及仙人掌果多糖对原发性高血压大鼠(SHR)主动脉和肾动脉组织形态学的影响6.1实验动物同实验1。6. 2实验方法6. 2.1分组及给药同实验1，给药时间为9w。
6. 2. 2实验步骤6. 2. 2. 1主动脉HE染色病理形态观察连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主动脉取血后，迅速摘取胸主动脉，用福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。 用光学显微镜观察并拍照。6. 2. 2. 2主动脉和肾动脉bFGF、Ki_67的免疫组化检测连续给药9w，末次给药后禁食(不禁水) 小时，以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (5ml · kg—1)，自腹主动脉取血后，迅速摘取胸主动脉和肾动脉，福尔马林固定，脱水、透明、 浸蜡、包埋、切片。组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。酸性修复取配置好的柠檬酸缓冲液(pH = 6.0士0. 1)800 1500ml于压力锅中，电炉加热至沸腾。脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料染色架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始记时，1. 5min后压力锅离开热源，冷却至室温。取出玻片，先用自来水冲洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 ‘ 12H20 6. 0g+NaH2P04 ·2Η20 0. 4g+ 蒸馏水 1000ml)冲洗三次，每次间隔 3min, 除去PBS液。每张切片加50μ1 3%过氧化氢，室温下孵育lOmin，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。每张切片加50μ 1的bFGF-2 (sc-79)或Ki_67 (cloneSP6)兔抗大鼠多克隆抗体 (均按1 50稀释)，在4°C下孵育过夜。PBS冲洗三次，每次间隔;3min，除去PBS液，每张切片加50 μ 1即用型二步法(非生物素)PV6001兔二步法检测试剂盒，室温下孵育15min。 PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。DAB显色850 μ 1蒸馏水与DAB试剂中Α、B、C试剂各50 μ 1混勻，配制成ImlDAB 显色液。每张切片加50 μ 1新鲜配制的DAB溶液，自来水冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、中性树胶封固。结果判定①bFGF染色结果判定参考Mattern方法，从以下两方面评分阳性染色深度(未见染色为0，轻度染色为1，中度染色为2，深度染色为幻和阳性细胞的百分比 (未见染色记为0，染色细胞< 25%为1，25-50%为2，> 50%为幻，将这两方面得分相加。 在未知病理诊断的条件下，在高倍镜下分别观察10个视野后，平均得分、记录。得分0-2分为阴性表达，超过2分(3-6)为阳性表达，其中3-4分为弱阳性，5-6分为强阳性。
②Ki-67标记指数判定参照文献，以胞核染成均一棕黄色，胞浆及胞膜不着色为阳性细胞，随机计数5个以上高倍视野1000个细胞，平均每100个细胞中阳性染色细胞核数为 Ki-67 指数(Ki-671)。6. 2. 3统计学处理同实验1。6. 3实验结果 6.3.1对SHR组织病理形态的影响6. 3. 1. 1组织学检查各组变化不明显。6. 3. 1. 2光镜下检查Wt 主动脉大部分接近正常，个别内皮细胞肿胀，中膜未见明显增厚(6-8层)，外膜结缔组织未见沉积物。NC 主动脉动脉壁厚薄不一，内膜增生，呈现小的高低起伏状，内皮下间隙可见少量沉积物，内皮细胞不完整，内膜表面可见红细胞附壁，部分中膜平滑肌细胞
8增生，管壁中膜明显增厚(达11-13层)，外膜结缔组织未见沉积物。HD 主动脉内膜轻度增生，部分增厚，内皮细胞肿胀，部分中膜轻度增厚(8-10层)，外膜结缔组织未见沉积物。MD 主动脉内膜轻度增生，可见小的突起。内皮细胞不完整，部分中膜增厚(10-11层)，外膜结缔组织未见沉积物。LD 主动脉内膜轻度增生，呈现小的高低起伏状，内皮下间隙可见少量沉积物，内皮细胞不完整，内膜表面可见红细胞附壁，部分中膜平滑肌细胞增生，中膜明显增厚(10-12层)，外膜结缔组织未见沉积物。NJ:主动脉内膜轻度增生，可见小的突起。内皮细胞不完整，部分中膜增厚(9-11层)，外膜结缔组织未见沉积物。PC:主动脉内膜轻度增生，部分增厚，内皮细胞肿胀，部分中膜轻度增厚(8-10层)，外膜结缔组织未见沉积物。6. 3. 2对SHR主动脉和肾动脉平滑肌细胞(VSMC) bFGF和Ki_67的影响6. 3. 2. 1对各组主动脉和肾动脉VSMC bFGF含量的影响bFGF阳性染色主要弥漫性分布于动脉中膜VSMC胞浆中，在高倍视野下观察呈颗粒状；细胞核几乎不着色。与NC相比，Wt主动脉和肾动脉VSMCbFGF含量明显降低(P
<0. 01)，HD和MD主动脉VSMC bFGF含量显著下降(P < 0. 01或P < 0. 05)，HD的肾动脉 VSMC bFGF的含量也明显下降(P < 0. 05)；与PC相比，HD、MD和NJ的VSMC bFGF含量均无明显差异(P > 0. 05)。6. 3. 2. 2对各组主动脉和肾动脉VSMC Ki-671的影响Ki-67阳性反应均分布于主动脉中膜VSMC的细胞核中，胞浆无染色。与NC相比， Wt、HD和PC的主动脉和肾动脉VSMC Ki-671明显减少(P < 0. 01或P < 0. 05), NJ的肾动脉VSMC Ki-671也明显降低(P < 0. 05)；与PC相比，HD、MD和NJ的VSMC Ki-671均无明显差异(P > 0. 05)。降压实验研究表明单次给予仙人掌果多糖后池即有明显的降压效应，4h降压效应达到高峰，降压幅度最大值为0. 68士8. 02kPa。4h时HD与治疗前相比有显著性差异(P
<0.05)。从降压疗效维持的时间来看，仙人掌果多糖各给药组给药1 后SBP恢复到治疗前水平。从降压幅度来看仙人掌果多糖降压呈现明显的量效和时效关系。在连续9W给药过程中，仙人掌果多糖对SHR显示持续的降压作用，各剂量组之间呈现量效和时效依赖趋势，其作用特点是平缓、稳定。HD和MD与治疗前和NC相比有显著性差异(P<0.01) ；LD和 NJ与NC相比也有显著性差异(P <0.01)，但自身前后比较不是非常明显，但也有差异(P
<0. 05)。HD、MD、LD 和 NJ 降压的最大均值分别为 2. 16士0. 18、1. 59士 1. 44、1. 42士0. 16、 0.87士0. 18和0.82士0. IQkPa0由此说明仙人掌果多糖具有良好的降血压的作用。因此，仙人掌果多糖可明显降低SHR的收缩压，并呈明显的时效和量效关系；能明显降低SHR血浆RA、AngII、ET、去甲肾上腺素(NE)和升高NO的含量；保护SHR主动脉内皮细胞，逆转平滑肌细胞增殖，在某种程度上具有逆转SHR靶器官损害的作用。三、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血脂作用的试验研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(HLP)大鼠血脂及肝脏形态学的影响1. 1实验动物SD大鼠60只，雄性，体重160士 10g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK桂2003-0003 ；动物饲料由广西医科大学实验动物中心生产(标准饲料)。实验期间大鼠自由摄食、饮水、通风和自然采光。1.2实验方法
1. 2. 1模型建立及实验分组取大鼠60只，随机分成为空白组(KB) 10只和高脂造模型组(ZM)50只。常规饲养 1周(w)后，禁食不禁水12小时(h)，采血，检测基础血脂。参照文献方法制备高脂饲料，即由87. 3%基础饲料、10%猪油、2%胆固醇、0. 5%猪胆盐、0. 2%丙基硫氧嘧啶配制而成。ZM 大鼠以高脂饲料喂饲3w后，禁食(不禁水)1池，采血，检测血脂。与造模前的血脂比较以确定HLP模型是否建成。HLP模型造成后，将HLP大鼠按血清总胆固醇(TC)水平分为5组: CPFP高剂量组(HD) XPFP低剂量组(LD)、仙人掌果原汁组(NJ)、阳性对照组(LF)及HLP模型组(HL)，每组10只。1.2. 2给药方法大鼠造模结束各组分别给予相应药物灌胃。HD和LD分别给3. 06g · kg—1 · cf1和 0. 79g · kg—1 · CT1CPFP，NJ 给 3. 15g · kg—1 · cf1 仙人掌果原汁；LF 给 3. Omg · kg—1 · cf1 洛伐他汀，空白组(KB)及HL以IOml · kg—1生理盐水灌胃。每日1次，连续3w。各组均自由饮水。1.2. 3摄食量和体重每日同一时间记录进食量，每w同一时间记录各组大鼠体重，以便调整给药剂量。1.2.4TC、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇 (LDL-C)、载脂蛋白AI (apoAI)和载脂蛋白B(apoB)的测定给药3w，末次给药前禁食12h，给药Ih后，取血，装入抗凝或不抗凝试管中，在4°C 下3000转/分(rpm)离心lOmin，分别取血清或血浆，在全自动生化分析仪上分别测定TC、 TG、HDL-C, LDL-C, apoAI 和 apoB 的含量。1. 2. 5LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值和动脉硬化指数(Al)的计算根据单项的血脂测定结果(TC、TG、HDL-C和LDL-C含量)分别计算血脂综合指数(LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C比值以及Al)，其中AI根据Frieldwald公式计算AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。1.2. 6肝重和肝脏系数各组大鼠处死后，迅速摘取肝脏，用预冷生理盐水漂洗再用滤纸吸干表面水分后， 称重。根据肝重计算肝脏系数肝脏系数=肝脏重量(g)/体重(g)X100%。1.2.7肝组织病理学观察取肝组织，切成4_5mm3小块，10 %中性福尔马林固定，梯度乙醇脱水75%乙醇 90min 95% 乙醇 90min 100% 乙醇 90minX3 次 100%二甲苯 60minX 2 次，62°C浸石蜡》!X2次，包埋后切片6 μ m，贴于普通载玻片上。经HE染，光学显微镜下观察并拍照。1. 2. 8统计学处理应用SPSSl 1. 0软件进行统计学处理，计量资料均采用〒土 S表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析。1.3实验结果1. 3. 1造模期间大鼠摄食量和体重变化造模期间大鼠平均日摄食量和体重均有不同程度的增加。ZM大鼠平均日摄食量均低于KB，其中第Iw有显著性差异(P < 0. 05)，可能由于初食高脂饲料不适应有关；第2、3w 均无显著性差异(P>0.(^) ；ZM大鼠体重均高于KB，但无显著性差异(P >0.05)。1. 3. 2大鼠HLP模型的建立喂饲高脂饲料的ZM大鼠3w后测血脂。与造模前相比，血清TC、TG、LDL-C水平显著升高(P < 0. 01), HDL-C水平明显下降(P < 0. 05)。说明ZM大鼠存在着血脂代谢紊乱， HLP模型复制成功。1. 3. 3对大鼠摄食量和体重的影响给药期间，各组大鼠生长良好，活动正常。给药前各组大鼠摄食量和体重均无明显差别(P>0.05)。给药3w后，大鼠平均日摄食量和体重均稳步增加，与KB、HL相比，各给药组大鼠平均日摄食量和体重无显著性差异(P > 0. 05)，说明CPFP对大鼠摄食量和体重变化无不良影响。L 3. 4 对 HLP 大鼠 TC、TG 和 LDL-C 的影响给药前，各HLP模型组间大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平相互比较无显著性差异 (P > 0. 05)，但都明显高于 KB (P < 0. 01)。给药3w后，各组与给药前比较，KB大鼠血清TC、TG和LDL-C分别升高1.84%、 6. 06%和7. 14%，均无显著性差异(P > 0. 05) ；HL大鼠血清TC、TG和LDL-C分别升高 23. 84%,27. 27%和31. 82%，均有显著性差异(P < 0. 05) ；HD、LD、NJ及LF血脂分别降低 TC(23. 10%U8. 29%U9. 60%禾口 31. 64% ) ,TG(34. 37%,27. 27%,24. 64%禾口 35. 48% )和 LDL-C(26. 70%,24. 76%、19.四％和38. 42% )，各组 TC、TG和 LDL-C均显著降低(P < 0. 01 或 P < 0. 05)。与HL比较，各给药组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均非常明显下降(P < 0. 01)； 与LF比较，HD大鼠血清TC、TG和LDL-C水平均无显著性差异(P > 0. 05)，说明CPFP能显著降低HLP大鼠血清TC、TG和LDL-C，HD和LF效果均较好。L 3. 5对HLP大鼠HDL-C的影响给药前，各HLP模型组间大鼠血清HDL-C水平相互比较无显著性差异(P > 0. 05)， 但都明显低于KB (P < 0.01)。给药3w后，与给药前比较，KB大鼠血清HDL-C水平升高0. 85%，但无显著性差异 (P > 0. 05) ；HL 降低 8. 70%,无显著性差异(P > 0. 05) ；HD,LD,NJ和 LF分别升高 19. 78%、 8. 51%、8. 60%和13. 83%，HD大鼠血清HDL-C升高有显著性差异(P < 0. 05)，其余给药组均无显著性差异(P > 0. 05)。与HL比较，各给药组大鼠血清HDL-C水平均有所升高，HD和LF有显著性差异(P < 0. 05)，说明CPFP能升高HLP大鼠血清HDL-C01. 3. 6 对 HLP 大鼠 apoAI 和 apoB 的影响给药3w 后，与 HL 比较，HD、LD、NJ 禾口 LF 血清 apoAI 分别升高 33. 49%,5. 58%, 3. 49%和21. 16%，但均无显著性差异(P > 0. 05) ；HD, LD、NJ和LF血清apoB分别降低 49. 26%,40. 16%,47. 18%和50. 15%，均有非常显著性差异(P < 0. 01)。各给药组间apoAI 和apoB水平均无显著性差异(P > 0. 05)。1. 3. 7对HLP大鼠血脂综合指数(LDL_C/HDL_C、TG/HDL-C比值和Al)的影响给药3w后，与HL比较，HD、LD、NJ和LF血脂综合指数分别降低LDL_C/ HDL-C(57. 68%,52. 66%,49. 84 % 和 62. 38 % ), TG/HDL-C(63. 89 %,57. 41 %,52. 78 % 和 66. 67% )、AI (62. 23%,53. 68%,51. 54%和 65. 80% )，均有非常显著性差异(P < 0. 01)。 与LF比较，HD无显著性差异(P > 0. 05)，LD和NJ大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI比值有显著性差异(P < 0. 01或P < 0. 05)。
1. 3. 8对HLP大鼠肝重和肝脏系数的影响给药3w后，与HL比较，HD、LD、NJ和LF大鼠的肝重和肝脏系数都有不同程度的降低，肝重依次降低15. 16%、10. 15%、11. 25%和16. 99%, HD和LF降低有显著性差异(P < 0. 05)；肝脏系数依次降低 12. 10%,9. 80%、10. 09%和 13. 26%，HD、LD、NJ 和 LF 降低有显著性差异(P < 0. 01或P < 0. 05)。与LF比较，各给药组肝重和肝脏系数均无显著性差异(P > 0. 05)。1. 3. 9对HLP大鼠肝脏脂肪变性的影响1.3.9. 1组织学检查KB 肝脏无异常变化，肝脏表面光滑，有光泽，未见充血、水肿等现象；HL 肝脏体积增大，包膜紧张，边缘圆钝，切面油腻，无光泽，呈奶黄色，可见针头大的细小颗粒，属典型肝细胞脂肪变性；各给药组肝脏色泽、质地、体积均有明显改善。1.3. 9. 2 光镜观察KB 肝组织的形态学表现正常，肝小叶结构清晰，肝细胞排列呈条索状，以中央静脉为中心放射状走行，未见肝细胞浊肿、脂变和坏死，汇管区可见小叶间小血管和毛细胆管，未见炎细胞浸润和淤胆形成等改变，10只大鼠肝细胞均未见脂肪变性(0/10)；HL:肝小叶结构欠清晰，10只大鼠均出现了中度至重度的肝细胞脂肪变性 (10/10)，胞浆中出现大小不等的脂肪空泡，肝细胞体积普遍变大变圆，细胞核被挤在一边， 肝窦明显变窄或消失，肝细胞着色较正常细胞为浅，胞浆淡染，腺泡内多见点状或灶状坏死，汇管区伴有轻-中度炎症细胞浸润，未见明显肝纤维化，大部分肝小叶中央静脉周显现胆固醇结晶；各给药组肝组织均有不同程度的改善，尤其是HD和LF肝组织有较大程度改善。2.仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(HLP)大鼠血液流变学的影响2.1实验动物同实验1。2. 2实验方法2. 2. 1血液流变学的测定给药3w，末次给药前禁食12h，给药Ih后，取血3. 5ml，用血清洗旋转式粘度计，测全血粘度(高、中、低切)，血浆粘度和红细胞压积值等血液流变学指标。2. 2. 2统计学处理同实验1。2. 3实验结果对HLP大鼠血液流变学的影响给药3w后，与HL比较，HD、LD、NJ和LF全血粘度(高切、中切、低切)、血浆粘度、 红细胞(RBC)压积值均有显著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)；与LF比较，HD的RBC压积值、全血粘度(高切)和血浆粘度均显著性降低(P < 0. 01或P < 0. 05)，效果优于LF ；LD 和NJ的RBC压积值也显著降低(P < 0. 05)，说明CPFP对HLP大鼠的血液流变学异常具有
明显改善作用。3.仙人掌果及仙人掌果多糖对高脂血症(HLP)大鼠抗氧化作用的影响3.1实验动物同实验1。3. 2实验方法3. 2.1样本处理
给药3w，末次给药前禁食12h，给药Ih后，取血，装入不抗凝试管中，在4°C下 3000rpm离心lOmin，取血清，分装，_20°C保存。3. 2. 2血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定测定原理以黄嘌呤氧化酶法测定，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色。严格按照SOD 测试盒说明书操作，在550nm处测定SOD的吸光度(OD)，根据下列公式计算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(对照管OD值-测定管OD值)+对照管OD值+ 50 % X 样品测试前稀释倍数。注每Iml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD 活力单位⑶。3. 2. 3血清丙二醛(MDA)含量的测定测定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA 缩合，形成红色产物。严格按照SOD测试盒说明书操作，在532nm处测定MDA的OD值，根据下列公式计算血清MDA含量MDA含量(nmol/ml)=(测定管OD值-测定空白管OD值)+ (标准管OD值-标准空白管OD值)X标准品浓度X样品测试前稀释倍数。3. 2. 4统计学处理同实验1。3. 3实验结果对HLP大鼠抗氧化作用的影响给药3w 后，HD、LD、NJ和LF血清S0D活性分别升高 50.06%、40.64%、37. % 和34. 33% ；与HL比较，HD、LD和NJ有非常显著性差异(P < 0. 01)，LF有显著性差异(P < 0. 05)。血清MDA含量分别降低36. 33%,32. 72%,27. 78%和28. 66%，各给药组均有非常显著性差异(P < 0. 01)。另外，各给药组组间SOD和MDA均无显著性差异(P > 0. 05)。实验结论1.仙人掌果多糖具有降脂及调节脂蛋白代谢的作用能降低高脂血症大鼠血中的TC、TG、LDL-C和apoB水平，升高HDL-C和apoAI水平；并保护肝脏细胞结构功能的改变，增强其对脂质代谢的作用。2.仙人掌果多糖能改善血液粘度和流变性，直接改善血液成分能降低高脂血症大鼠的全血粘度(高、中和低)、血浆粘度、RBC压积，而改善血液流变性。通过改善血液浓、 粘、聚状态，促进脂类物质的代谢。3.仙人掌果多糖能清除自由基，减少脂质过氧化物的产生可以有效降低高脂血症大鼠血清中MDA含量，升高血清中SOD活性，提示仙人掌果多糖可能通过提高自由基清除酶的活性，维护体内自由基稳态与平衡，增加LDL的抗氧化能力，减少脂质过氧化物的产生，从而发挥防治高脂血症和动脉粥样硬化的作用。因此，仙人掌果多糖具有降脂及调节脂蛋白代谢的作用，能改善血液粘度和流变性，直接改善血液成分，清除自由基，减少脂质过氧化物的产生，从而发挥防治高脂血症和动脉粥样硬化的作用。四、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血糖作用的试验研究1.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠糖代谢和一般体征的影响1.1实验动物SD大鼠，雌雄各半，体重QOO 士 10) g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK桂2003-0003 ；动物饲料由广西医科大学实验动物中心生产(标准饲料)。DM模型鼠自由摄食、饮水，通风，自然采光。1.2实验方法1. 2. IDM大鼠模型建立及指标测定1.2. 1. IDM大鼠模型建立及分组SD大鼠禁食12小时(h)，以60mg · kg—1链脲霉素(STZ)腹腔注射(STZ溶解于 0. Imol · L—1、pH4. 2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，现配现用，置于冰上)。正常对照组 (Sd)大鼠腹腔注射等量上述缓冲液。7 后(大鼠采血前禁食12h)用血糖(BG)测定仪测定空腹血糖(FBG)值，凡FBG彡13mmol · L—1视为DM大鼠模型。将成模DM大鼠按BG浓度由高到低排序进行物理编号，随机将DM大鼠分为DM模型对照组(NC)、胰岛素组(IN)、原汁组(NJ)、CPFP中剂量组(MD)和CPFP高剂量组(HD)。1.2. 1.2给药剂量与方法IN 给 10U. kg—1 · Cf1 胰岛素(Ins)，NJ 给仙人掌果原汁 3. 15g · kg—1 · d-1，MD 和 HD 分别给1. 58g · kg-1 · (1^,3. 06g · kg-1 · cf1。每天上午空腹给药1次，连续灌胃8周(w)。1. 2. 1. 3—般体征观察观察大鼠的精神活动、毛发改变、饮水量、进食量和大小便等一般状况，并记录体重变化情况。1.2. 1.4血糖的测定给药第#和第8w，用BG测定仪测定各组FBG，计算并统计分析药物对DM大鼠BG 水平的影响。1. 2. 1. 5糖化血红蛋白(GHB)的测定给药8w末，拔大鼠眼球采血2_鈿1置于离心管中，以500 1000转/分(rpm)，离心5 10分钟(min)，弃上清留沉淀的红细胞，然后用生理盐水洗涤2 3次。用GHB测定试剂盒测定GHB含量，具体操作详见试剂盒说明书，计算并统计分析药物对DM大鼠GHB水平的影响。计算公式每IOg GHB吸光度(OD)=测定管0D/2ml血液中GHB克数X2X IOg1. 2. 2统计学处理应用SPSSl 1. 0软件进行统计学处理，计量资料均采用〒士 S表示，两组间计量资料比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析。1.3实验结果1. 3. 1对STZ所致DM大鼠的一般状况的影响1. 3. 1. 1—般状态观察Sd大鼠精神振奋，活动频繁，毛发纯白有光泽，垫料干燥；NC大鼠精神萎靡，活动度低，尾巴湿冷，毛发枯黄、无色泽、脱落，竖毛弓背，垫料极潮，下腹部及外阴部毛浸湿，大便稀澹，出现“三多一少”的症状；给予CPFP和hs后，DM大鼠精神逐渐好转，活动增多，皮毛光泽渐好，垫料比较干燥，大便稀塘减少，“三多一少”的症状减轻。1. 3. 1. 2对DM大鼠体重的影响在实验中Sd和IN大鼠体重呈持续增长趋势；NC大鼠体重逐步下降，说明DM大鼠体内产生代偿，代谢紊乱；给予CPFP后，DM大鼠体重8w时显著高于NC同期体重(P < 0. 05)。1.3.2药物对STZ所致MD大鼠FBG的影响
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给药#和8w后，各组FBG均有不同程度的降低。与同期NC比较HD、MD和NJ均有显著降血糖作用(P <0.01)，降糖效果呈现一定的量效和时效关系。HD、MD和NJ之间均无显著差异(P > 0. 05)。1.3.3药物对STZ所致DM大鼠GHB的影响结果显示与NC相比，HD、MD和NJ的GHB含量显著降低(P < 0. 01或P < 0. 05)， 但HD、MD和NJ之间无显著差异(P > 0. 05)。提示HD、MD、NJ均能较稳定地降低血糖。2.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠脂代谢的影响2.1实验动物同实验1。2. 2实验方法2.2.1血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、L DL_C和高密度脂蛋白-胆固醇 (HDL-C)的测定给药8w末，取血，4 °C，3500rpm离心IOmin，在全自动生化分析仪上测定血清 TC、TG、LDL-C和HDL-C含量，并根据Frieldwald公式计算动脉硬化指数(Al) =AI = (TC-HDL-C)/HDL-C。2. 2. 2统计学处理同实验1。2. 3实验结果与Sd相比，NC大鼠TC、TG和LDL-C显著升高(P < 0.01)，HDL-C含量显著下降 (P < 0. 05)；给药8w后，与NC相比，HD和IN的TC和TG含量显著下降(P < 0. 05)，LDL-C 含量也有所减少，其中HD的LDL-C含量降低效果显著(P < 0. 05)；同时，HD和IN的HDL-C 含量显著升高(P < 0. 05)。3.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠胰腺组织形态学的影响3.1实验动物同实验1。3. 2实验方法3. 2. 1胰腺组织HE染色形态观察给药8w末，取血后，迅速取胰腺，用福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色。光镜下观察心肌组织病理学变化并拍照。3. 2. 2胰腺组织α细胞和β细胞的免疫组化检测给药8w末，剖腹取胰腺，福尔马林固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。酸性修复取配置好的柠檬酸缓冲液(pH = 6. 0士0. l)800_1500ml于压力锅中，电炉加热至沸腾。脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料染色架上，放入已沸腾的缓冲液中， 盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始记时，1. 5min后压力锅离开热源，冷却至室温。取出玻片，先用自来水冲洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 · 12H20 6. 0g+NaH2P04 · 2H20 0. 4g+蒸馏水1000ml)冲洗三次，每次间隔3min,除去PBS液。每张切片加50 μ 1 3%过氧化氢，室温下孵育lOmin，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗三次，每次间隔3min,除去PBS液。每张切片加50 μ 1的Glucagon Ab-I或 Insulin Ab_5 (均按1 50稀释)，在4°C下孵育过夜。PBS冲洗三次，每次间隔;3min，除去 PBS液，每张切片加50 μ 1即用型快捷免疫组化Maxvision 抗兔-HRP检测试剂盒，室温下孵育15min。PBS冲洗三次，每次间隔3min，除去PBS液。
DAB显色850 μ 1蒸馏水与DAB试剂中Α、B、C试剂各50 μ 1混勻，配制成ImlDAB 显色液。每张切片加50 μ 1新鲜配制的DAB溶液。自来水冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥、中性树胶封固。镜下观察各组免疫组化片进行综合评分。1、表达面积①阳性表达细胞数为0计为0分。②阳性表达细胞数< 25%计为1分；③阳性表达细胞数为沈 50%计为2分；④ 阳性表达细胞数占51 75%计为3分；⑤阳性表达细胞数>75%计为4分。2.表达强度 ①阳性信号强烈，呈棕褐色，小块状，计为3分，②阳性信号中等，呈棕色，粗颗粒状，计为2 分；③阳性信号较弱，呈淡棕色，细颗粒状，计为1分；④无阳性信号，计为0分。两项相加， 0分为阴性(_)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性(++)，6-7分为强阳性(+++)。计数采用双盲法。3. 3实验结果3. 3. 1对DM大鼠组织病理形态的影响Sd胰腺中胰岛数量较多，体积较大，胰岛呈圆形或椭圆形的细胞团，边界清晰，胰岛内细胞数量较多，排列整齐，胞浆丰满，核多为圆形；NC胰岛数量明显减少，结构破坏，轮廓消失，胰岛内细胞数量明显减少，细胞排列不规则，边界不清，部分细胞肿胀或皱缩坏死， 胰岛内出现空泡；IN胰岛数量明显增多，轮廓完整，分布规则，细胞边界清晰；HD和MD与NC 相比胰腺病变较轻，胰岛轮廓完整，胰岛内细胞数量增多，分布规则，胞浆疏松，淡染，细胞边界较清晰。3. 3. 2药物对STZ所致MD大鼠胰岛β细胞和α细胞的影响3. 3. 2. 1胰岛β细胞hs表达情况结果显示与NC相比较，各给药组Ins表达阳性率显著升高(P < 0. 05)，表明各给药组对STZ所致胰岛β细胞损伤具有明显的保护作用。免疫组化染色显示各组表达hs 程度NC胰岛中央部分着色程度较正常组明显变浅，面积缩小；各给药组中胰岛β细胞着色加深且面积增大。3. 3. 2. 2胰岛α细胞胰高血糖素表达情况结果显示与NC相比，各给药组胰高血糖素表达无显著差异(P > 0. 05)。免疫组化染色显示各组表达胰高血糖素程度与NC相比，Sd和各给药组α细胞胰高血糖素表达无显著差异(P > 0. 05)。4.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠抗氧化作用的影响4.1实验动物同实验1。4. 2实验方法4. 2. 1心肌中丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)测定给药8w末，取血后，取心脏，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干，称重后，用生理盐水配成10%心肌勻浆，于冷冻离心机3000rpm离心15min，取上清液，按要求用生理盐水稀释成一定倍数后用于心肌MDA和SOD测定。4. 2. 1. 1血清MDA含量的测定测定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA 缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收。严格按照SOD测试盒说明书操作，在532nm 处测定MDA的OD值，根据下列公式计算血清MDA含量
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MDA含量(nmol/ml)=(测定管OD值-测定空白管OD值)+ (标准管OD值-标准空白管OD值)X标准品浓度X样品测试前稀释倍数。4. 2. 1. 2血清SOD活性的测定测定原理以黄嘌呤氧化酶法测定，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色。严格按照SOD 测试盒说明书操作，在550nm处测定SOD的吸光度(OD)，根据下列公式计算血清SOD活性血清SOD活性(U/ml)=(对照管OD值-测定管OD值)+对照管OD值+ 50 % X 样品测试前稀释倍数。注每Iml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD 活力单位⑶。4. 3实验结果4. 3. 1药物对DM大鼠心肌MDA和SOD的影响链脲霉素(STZ)所致NC大鼠心肌MDA含量较Sd有显著增高，SOD活性则显著降低，显示DM大鼠心肌抗氧化能力下降。用药8w后，与NC比较，HD、MD和NJ心肌MDA值均显著降低(P <0.01)，相应SOD活性明显增高(P <0.01)，但与IN相比均有显著差异(P < 0. 01)。5.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠心肌超微结构的影响5.1实验动物同实验1。5. 2实验方法给药8w后，取血后，摘取心脏，迅速放入预冷的2. 5%戊二醛(用磷酸缓冲液配制， PH7. 2)固定，之后用PBS (pH7. 2)漂洗IOmin三次，放入1 %锇酸(四氧化锇)，固定池，PBS 漂洗IOmin三次，50 % 90 %乙醇逐级脱水，丙酮脱水，环氧树脂包埋，38°C、45°C、60°C依次聚合36h，LKB-V超薄切片机切片，约70nm，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在H-500型透射电子显微镜下观察心肌线粒体和心肌纤维等超微结构的变化并拍照。5. 3实验结果电镜下观察Sd心肌纤维未见异常，心肌肌节对位整齐，无肌原纤维溶解，线粒体结构完整，嵴排列规则，清晰可见。NC可见心肌肌节对位错乱，呈过度收缩，部分肌原纤维溶解，线粒体肿胀，线粒体边界不清，部分嵴断裂溶解，形成线粒体内小空泡，表明链脲霉素 STZ所致DM大鼠心肌有一定损伤。各给药组大鼠心肌肌节对位基本整齐，仅见少部分错位， 肌原纤维溶解较少，线粒体稍见肿胀和空泡。6.仙人掌果及仙人掌果多糖对糖尿病(DM)大鼠肝和骨骼肌胰岛素受体(InsR)及骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLuT4)mRNA表达的影响6.1实验动物同实验1。6. 2实验方法6. 2. IRNA 抽提6. 2. 2RNA纯度和完整性分析6. 2. 3 总 RNA 逆转录成 cDNA6. 2. 4逆转录-聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)6. 3实验结果6. 3. 1药物对链脲霉素(STZ)所致DM大鼠肝脏和骨骼肌hsR的影响
结果显示各给药组DM大鼠肝脏和骨骼肌hsR的数量较NC均有增加(P < 0. 01)。6. 3. 2药物对STZ所致DM大鼠骨骼肌GLuT4的影响结果显示各给药组大鼠骨骼肌GLuT4的数量较NC均有增加(P < 0. 01)。实验结论通过观察仙人掌果多糖对STZ所致糖尿病大鼠糖代谢、脂代谢及抗氧化作用的影响，并从组织学上研究了仙人掌果多糖对胰腺及糖尿病心肌病的影响。然后从基因水平探讨了仙人掌果多糖降糖作用的可能机制。提示1.本研究采用60mg · kg—1 —次腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，以适宜剂量给糖尿病大鼠灌胃仙人掌果多糖8w后，结果显示仙人掌果多糖能改善糖尿病“三多一少”的症状，显著降低BG和GHB。同时，也降低糖尿病大鼠的TC、TG、LDL-C和Al，升高HDL-C的含量，这表明仙人掌果多糖促进了糖和脂肪的利用，减轻了糖毒性和脂毒性对机体的损伤，有利于糖尿病的恢复和防止并发症的产生。2.组织形态学观察显示仙人掌果多糖在降糖和降脂的同时，改善了 STZ所致糖尿病大鼠胰腺的损伤程度，增加胰岛β细胞和胰岛素的分泌，因此促进胰岛β细胞修复， 增加胰岛素分泌可能是仙人掌果多糖作用机制之一。3.糖尿病降低了大鼠抗氧化功能，使MDA水平升高，SOD活性降低。给予仙人掌果多糖后降低了 MDA水平，升高SOD活性，这表明仙人掌果多糖能提高机体的抗氧化功能，减轻过氧化损伤。4.电镜观察显示仙人掌果多糖对STZ所致糖尿病大鼠心肌肌节对位错乱、肌原纤维溶解和线粒体肿胀有不同程度的改善，表明其能减轻糖尿病导致的心肌损害。5.通过RT-PCR对肝脏和骨骼肌InsR、骨骼肌GLuT4分析可知，仙人掌果多糖能提高MsR和GLuT4的含量，说明其降糖机制可能是通过增加MsR和GLuT4含量而产生降糖作用的。因此，仙人掌果多糖能降低血糖、糖化血红蛋白和血脂，改善糖代谢和脂代谢紊乱，提高机体的抗氧化能力，延缓并发症的发生发展，改善机体的状况，这与其修复受损的胰岛β细胞、促进胰岛素分泌、增加InR和GLuT4含量有关。五、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)抗肿瘤作用的试验研究(一 )体外抗肿瘤作用的研究1.实验材料1. 1细胞株人肝癌细胞株HEPG-2、人卵巢癌细胞株SK0V3、人胃癌细胞株SGC7901 由医学科学实验中心细胞室提供；人肝癌细胞株HCC-LM3、人肝正常细胞株L02等由第二军医大学肿瘤所提供。2.实验方法2. 1细胞的培养、冻存与复苏本实验选用人肝癌、胃癌、卵巢癌4种细胞株，于37°C、5% CO2的培养箱中，10%新生牛血清以及青链霉素各100U/ml的1640培养液中培养。倒置显微镜观察细胞生长情况， 0. 25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。冻存时，取对数生长期细胞，消化、离心、去上清。加入冻存液，使细胞密度约为 1 X IOVml分装于冻存管中，先置于4°C 60分钟，再置于-20°c 60分钟，再置_80°C超低温冰箱中保存。复苏时，将超低温冰箱中的肿瘤细胞冻存管迅速转入37°C水中，保持冻存管管口部位于水面之上，搅拌加速解冻，待完全解冻后，用75%酒精棉球擦拭冻存管壁。将解冻后细胞转移到离心管中，加入约6倍冻存液量的培养基IOOOrpm离心5分钟，弃上清，重复此步一次。再加入培养液，混勻细胞，转至培养瓶中培养。2. 2噻唑蓝(MTT)法确定仙人掌果多糖提取物对肿瘤细胞的抑制作用本实验选择胃癌7901、肝癌HEPG_2、LM3卵巢癌SK0V3、人正常肝细胞L02细胞株， 采用MTT法研究仙人掌果多糖的抗癌效果。取对数生长期的肿瘤细胞株，浓度为5X IO4个 /ml，加入到96孔板，每孔加含细胞的培养液100μ 1，置37°C，5% CO2培养箱孵育4 后， 分别加入不同浓度的仙人掌果多糖，用PBS溶液调整每孔细胞总体积为200 μ 1，4 后加入 2(^说17(^^/1111)，371，5%0)2培养箱孵育411后，弃上清，每孔加入01^0 200 μ 1，放入酶标仪，中速振荡5分钟后，于490nm波长处测定吸光度(0D值)，每个浓度平行测定3孔。以 PBS溶液为空白对照，按下列公式求出生长抑制率(IR)。
实验组平均OD值
抑制率(IR，%) 二 (1- -‘- ) X100%
空白对照平均OD值2. 3Annexin V-FITC染色观察细胞凋亡(1)将LM3细胞于6孔板内生长，处于对数生长期内加入CPFP (2. 500mg/ml)诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；(2)用PBS洗涤细胞两次；(3)在 500 μ 1 的 Binding Buffer 中力口入 2 μ 1 Annexin V-FITC, 5 μ 1 Propidium Iodide，混勻；(4)将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均勻覆盖；(5)避光、室温反应5分钟。将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC和罗丹明)观察，Armexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。2. 4流式细胞术定量检测细胞凋亡率取对数生长期的肿瘤细胞，经各浓度CPFP作用后，收集细胞，用结合缓冲液调节细胞密度为1 X106/ml，取100 μ 1悬液，加5μ 1 Annexin-v/FITC和10 μ 1碘化丙锭溶液， 常温避光孵育15分钟，加400 μ 1 PBS混勻，流式细胞仪分析。2. 5RT-PCR 检测 Ρ53 基因 mRNA 的表达2. 6蛋白质印迹检测P53相关蛋白表达2. 7统计学分析应用SPSS13. 0软件进行统计学处理，计量资料均采用1±S表示，两组间计量资料比较采用t检验，两组率的比较采用X2检验，多组均数比较采用方差分析。3.实验结果3. ICPFP对肿瘤细胞的抑制作用结果表明，CPFP不同剂量及5-FU的常用剂量对人体卵巢癌SK0V-3、胃癌7901、肝癌HEPG-2、肝癌LM3细胞的增殖有不同的抑制作用。CPFP与5-FU比较，抑制能力较弱。相同浓度下，CPFP对LM3细胞的抑制作用较其他株细胞明显，但考虑到药物浓度较大，总体来说一定剂量仙人掌果多糖对肿瘤细胞的抑制作用不大。在比较对同一种肿瘤细胞抑制率相近的条件下，CPFP对人正常肝细胞L02的抑制作用很小而阳性对照药物5-FU对人正常肝细胞L02抑制作用明显。3. 2CPFP对细胞凋亡的影响CPFP (2. 500mg/ml)作用LM3细胞48小时后，Annexin V-FITC染色可以观察荧光显微镜下的凋亡细胞。流式细胞术检测CPFP作用下LM3细胞凋亡率可知，NS组的凋亡率为 9. 76% ；CPFP(0. 625mg/ml)组凋亡率为 19. 77% ；CPFP(2. 500mg/ml)组凋亡率为 34. 12%, 由此推测CPFP可能具有诱导凋亡的作用。3. 3CPFP对P53表达的影响结果表明，随CPFP剂量增加，LM3细胞中P53基因mRNA的表达有一定下调趋势。 蛋白质检测的结果也发现同样的趋势。4.结论(1)仙人掌果多糖对肿瘤细胞的抑制作用本实验研究表明仙人掌果多糖不同剂量对人正常肝细胞L02的抑制作用很小，但阳性对照抗肿瘤药物5-FU的常用剂量对L02的抑制作用明显。仙人掌果多糖不同剂量和阳性对照抗肿瘤药物5-FU的常用剂量对人体卵巢癌SK0V-3、胃癌7901、肝癌HEPG-2、肝癌LM3细胞的增殖均有不同的抑制作用。仙人掌果多糖的抑制作用与5-FU比较，抑制能力较弱，且用药浓度较大。即仙人掌果多糖的细胞毒性较小，直接杀伤细胞的能力较弱。推测仙人掌果多糖对肿瘤的抑制可能通过其他途径发挥作用。(2)仙人掌果多糖对细胞凋亡的作用本实验研究表明仙人掌果多糖作用LM3细胞48小时后，Annexin V-FITC染色可以观察荧光显微镜下的生长活跃的肿瘤细胞和药物诱导下已凋亡的肿瘤细胞。可以观察到正常LM3细胞，其轮廓清晰；其中的凋亡细胞皱缩、 颜色发白，形状较周边正常细胞均有所改变，呈绿色荧光。根据流式细胞术检测LM3细胞调亡率可知，NS组的凋亡率为9. 76% ；仙人掌果多糖(0. 625mg/ml)组凋亡率为19. 77% ；仙人掌果多糖(2. 500mg/ml)组凋亡率为34. 12%，由此可以推测仙人掌果多糖可能具有一定的促凋亡作用。(3)仙人掌果多糖作用下的P53的表达分析本实验RT-PCR结果研究表明，不同剂量仙人掌果多糖作用下LM3细胞P53基因mRNA的表达强度变化具有一定趋势，随仙人掌果多糖剂量的增加，P53基因mRNA的表达下调。根据flfestern blot结果可以看出，不同剂量仙人掌果多糖作用下LM3细胞P53基因蛋白的表达强度不同，其变化具有一定趋势，随仙人掌果多糖剂量的增加，P53基因蛋白的表达有所减弱。由此推测仙人掌果多糖降低突变型P53在分子及蛋白水平的表达可能是其抗肿瘤机制之一。( 二)体内抗肿瘤作用的研究1.实验材料1. 1实验动物昆明种小鼠，雌雄各半，18 20g，由广西医科大学实验动物中心提供(试验动物生产许可证SCXKG桂2006-0003，试验动物使用许可证SYKG桂2003-0005)。 S180荷瘤小鼠种源，由上海细胞所提供。2.实验方法2.1动物急性毒性试验
因受仙人掌果多糖(CPFP)浓度和体积的影响，一次给药无法测出其LD50，故依据动物能耐受的最大浓度、最大体积的药量，每隔1 给药1次，共给药2次，测定CPFP最大给药量。按急性毒性试验常规方法分剂量分组灌胃。2. 2 S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制实验2. 2. 1 S180荷瘤小鼠瘤株保种、传代及移植瘤模型制备(1)S180瘤株的保种取体重20g的昆明小鼠4 5只，腹腔接种S180瘤株，定期7 9天传一代，腹腔保种。(》S180腋下移植瘤模型的建立取腹腔传代7天且生长良好的S180肉瘤小鼠，脱颈椎处死，75%乙醇消毒动物皮肤，无菌条件下操作，小心剪开小鼠腹腔，吸取生长良好的动物腹水，注意观察腹水颜色，腹水为乳白色无絮状沉淀物者为佳，血性腹水则不可用。台盼蓝染色证明活细胞数> 98%，腹水用生理盐水按1 2比例稀释，吹打混勻，细胞计数板计数，调整细胞数为2X106个活细胞/ml。取昆明种小鼠50只，右侧腋部皮肤常规酒精消毒，持Iml注射器予小鼠腋下皮下注射0. 2ml瘤细胞悬液，制成局灶性肿瘤模型。操作过程中注意紧贴皮下进针，勿将瘤细胞悬液漏出。在造模后第4天和第6天观察S180腋下移植瘤模型的成瘤情况。2. 2. 2实验动物分组及给药接种24h后，小鼠按性别、体重随机分成五组，每组10只，连续给药10天生理盐水组(NS)生理盐水 0. 2ml · IOg-I · d_l，po ；CTX 组=CTX 0. 02g · kg-1 · d_l，ip ；CPFP 高中低剂量组:1. 97g · kg-1 · d-l、0. 99g · kg-1 · d-l、0. 49g · kg-1 · d_l，po。质评标准为具有下列一项实验资料作废(1)生理盐水组小鼠肿瘤平均瘤重小于Ig或20%小鼠的瘤重小于0. 4g，表示肿瘤生长不良。(2)给药组小鼠死亡超过20%，或去瘤后平均体重下降超过15%，表示药物的不良反应。2. 2. 3计算抑瘤率第11天称体重并处死动物，剪开小鼠右腋下皮下组织，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，按下列公式计算抑瘤率，胸腺指数，脾指数。
权利要求
1.仙人掌果多糖在制备降血糖作用的药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于仙人掌果多糖是从仙人掌果中提取出来的多糖类成分，其总糖含量为60% 80%。
3.根据权利要求2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于仙人掌果多糖的制备方法为取仙人掌果，加4 10倍重量的水超声提取0. 5 2. 5小时，提取液浓缩，加入40 95%的乙醇，调节浓缩液的乙醇浓度至40 90%进行沉淀，然后在1000 IOOOOrpm转速下离心2 lOmin，离心沉淀物加水溶解，用体积比为1 5 2 10的无水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水层用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，浓缩，干燥，即得。
4.根据权利要求3所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于=Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白的过程为用体积比为氯仿正丁醇=4 10 1 5的Sevage溶液萃取水溶液 1 3次后，取水层液，调pH至5 7，向水溶液中加入1 如/IOOml的木瓜蛋白酶，45 65°C保温20 ^h，1000 IOOOOrpm离心2 lOmin，去除底层沉淀，得仙人掌果多糖脱蛋白液。
5.根据权利要求1或2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于取仙人掌果多糖，加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。
6.根据权利要求1或2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于将仙人掌果多糖与其它药用成分组合，并加入或不加药用辅料，按照常规方法制备成药物制剂。
7.根据权利要求1或2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于取仙人掌果多糖，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。
8.根据权利要求1或2所述仙人掌果多糖的应用，其特征在于将仙人掌果多糖与其它物质组合，加入或不加辅料，按照常规方法制备成保健品。
全文摘要
本发明公开了从仙人掌果中提取的仙人掌果多糖在制备降血糖作用的药物或保健品中的应用。由于仙人掌果多糖可控制高血压的发生发展，对防治高脂血症和肝脂肪变性的发生发展有积极意义，对防治糖尿病及其并发症有良好的潜在应用价值，并具有一定的抗肿瘤作用，因此本发明为开发防治糖尿病的药物或保健品奠定了基础，有效促进了仙人掌果资源的充分利用。而且仙人掌果属于天然植物资源，其药用和保健效果好，对人体多个脏器及系统具有调节和保护作用，价格相对低廉，副作用相对较少，因此仙人掌果多糖在制备降血糖作用的药物或保健品方面将具有良好的应用前景。
文档编号A61P35/00GK102397286SQ20111023230
公开日2012年4月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者刘华钢 申请人:刘华钢