专利名称：一种trail重组卡介苗的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的卡介苗穿梭表达载体 pMW61-Ag85B-TRAIL及其构建方法，即一种TRAIL重组卡介苗的构建及应用，具体涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片段和TRAIL基因片段的穿梭表达载体及其构建方法，得到的穿梭表达载体pMW6l-Ag85B-TRAIL用于构建重组卡介苗rBCGTRAIL， rBCGTRAIL可应用于治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发以及预防结核病发生。
背景技术：
卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)膀胱灌注已被公认为是治疗浅表性膀胱肿瘤及预防术后复发最有效的治疗方法，其在减少肿瘤复发数目、降低复发频率以及预防低分化膀胱肿瘤进展三个方面，均优于传统的化疗药物。但随着BCG在临床的广泛应用，也出现了膀胱肿瘤患者对BCG灌注的免疫反应性差及BCG副作用大等问题。所以，改造BCG、 开发新疫苗成为膀胱肿瘤免疫治疗中的研究热点。近年来国内外日益重视BCG作为新型活疫苗载体的作用，并利用基因工程技术改造BCG，以加强其免疫原性。基因重组卡介苗(rBCG)是将BCG作为工程菌，利用DNA重组技术将外源基因导BCG中，依靠BCG在宿主的复制，分泌表达外源抗原，以诱导对疾病的特异性体液和细胞免疫，提高BCG激发的抗肿瘤免疫效应。用于治疗膀胱癌的rBCG可以分为两种，一种是表达结核杆菌的抗原Ag85B的 rBCG,可以降低活BCG剂量，提高其免疫效果，降低副作用；由于一些细胞因子(IFN- γ、 mIL-2、mIL-18等)可以提高机体的细胞免疫，对肿瘤细胞可以进行杀伤作用，但半衰期短、临床用量大，费用昂贵且副作用大，因此可利用BCG持久存在的特性，构建可分泌细胞因子的rBCG;构建rBCG除了选择有效的外源基因外，选择适当的穿梭载体也非常重要，构建rBCG除了选择有效的外源基因外，选择适当的穿梭载体也非常重要，如何将外源基因导入BCG并分泌表达是rBCG的关键所在，1987年Jacobs等首先构建穿梭载体(shuttle vector)并将外源基因成功导入BCG菌体内，方法是将分枝杆菌噬菌体DNA和大肠杆菌质粒 DNA连接获得重组质粒，将其转染到耻皮垢分枝杆菌(非致病性的快生长类分枝杆菌)中， 获得重组噬菌体。用重组噬菌体直接感染BCG从而将外源基因导入构建rBCG。这种穿梭载体既可作为质粒在大肠杆菌中复制，又可作为噬菌体在分枝杆菌中复制。但存在分子量大、 缺乏有用的单一酶切位点和抗性标志及在BCG中表达不稳定等缺点。1991年Mover构建大肠杆菌一分枝杆菌的穿梭质粒PMM61，添加了 aph基因(即karf抗性标记)、多克隆位点、分枝杆菌强启动子hsp60和转录终止子，pMV261在大肠杆菌和结核杆菌中均有正常表达，并且可随大肠杆菌的扩增而迅速扩增，所以很容易获得所需质粒。具有拷贝数高、高效表达重组蛋白以及对BCG基因组的非破坏性等优点。pMV261的构建成功为外源基因在BCG 中表达提供了理想的载体。细胞因子TRAIL可有效地抑制膀胱癌细胞的形成和生长，诱导肿瘤细胞的凋亡，可导致肿瘤缩小甚至消失，但对绝大多数正常细胞不产生杀伤作用，这是目前临床上使用大多数细胞因子“敌我不分”、具有强烈毒副作用所不能比拟的，因此TRAIL 是构建rBCG最有效的外源基因之一，rBCG-TRAIL有望成为治疗膀胱癌，降低临床BCG剂量和副作用的有效生物剂。目前，并没有有效的卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL的构建。
发明内容
本发明的目的是提供一种TRAIL重组卡介苗的构建，其中的分泌型卡介苗穿梭表达载体 pMV261-Ag85B-TRAIL,具有 SEQ ID NO 1 所示序列，是在 pMV261 的 EcoR I 和 Hind III间插入TRAIL，然后在BamHI和EcoR I间插入Ag85B。所述的分泌型卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL通过以下构建方法实现(1) PCR扩增Ag85B信号肽片段和RT-PCR获取目的基因TRAIL，并对其筛选、鉴定；(2)利用DNA重组技术，将以上两个片段插入质粒PMM61的HSP60启动子下游， TRAILDNA与pMW61分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，得重组质粒pMW61_TRAIL， BCG基因组DNA的抽提，并且PCR扩增信号肽基因BCG-85B-SS，将pMV261_TRAIL和 BCG-85B-SS分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，得重组质粒pMV261_Ag85B_TRAIL ；(3)分泌型BCG穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL转化大肠杆菌、抽提和纯化；(4)对pMV261-Ag85B-TRAIL进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定。TRAIL PCR 扩增上游引物序列 5，-GACGAATTCTACATGTACTTCACCAACG-3，，F 5'端引入 EcoRI 识别序列 G' AATTC，下游引物序列 5，-CGCAAGCTTCTAGTTAATTAAAAAGGCTCC-3，， R 5'端引入Hind III识别序列A' AGCTT0本发明的另一个目的是提供所述的TRAIL重组卡介苗在制备预防和治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用，以及在制备预防和治疗结核病的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用，通过以下步骤实现(1)将经过pMM61-Ag85B_TRAIL转化感受态细菌E. coli DH5 α或X_blue的克隆菌落进行PCR、酶切、和测序鉴定；(2)将冻干BCG制剂用生理盐水融化，加入2ml细菌溶液，纱布封口后轻轻摇勻，倒入三角烧瓶置于37°C，转速为150rpm的恒温摇床中培养；BCG培养两周左右，OD600值约为 0. 6时，进行接种，分别移种于新培养基中大量培养或者冻存；(3)制备感受态BCG =BCG在Middlebrook 7H9培养基37 °C摇床培养，待培养液 OD600值约0. 6时将BCG菌液加入离心管中，冰浴2hr将BCG菌液加入离心管中，在冰盒中预冷air，4°C离心8000rpmX15min，丢弃上清；用原始体积的1/10、预冷的浓度为10%甘油重悬菌体；重复上述操作共五次，弃上清，加入原始体积1/50的10%甘油重悬菌体即得到感受态细菌，放置室温下备用；(4)构建重组卡介苗rBCGTRAIL:在一微量离心管中温和混勻200 μ L感受态 BCG (约 lX109cfu/ml)和 10 μ L 穿梭表达质粒 pMV261_Ag85B_TRAIL (约 2 μ g)；冰浴 IOmin 后，转入预冷的0. 2CM的电击转化杯中，置于基因脉冲仪中进行电转，电转参数Voltage: 1250V, Capacitance :25 μ F，Resistance :600 Ω ；质粒 pMV261-Ag85B_TRAIL，pMV261 及单纯BCG的作用时间分别为11. 6，13，12毫秒；电转完成后，迅速加Middlebrook7H9培养基 800 μ L入电转化杯中混勻，再转入离心管37°C 200rpm/minX3h培养；取100 μ L涂布在含30mg/L卡那霉素的MiddlebrOOk7H10固体培养基的离心试管内斜面上，37°C继续培养直至发现克隆；3 4周后挑选阳性克隆，先进行抗酸染色初步鉴定，明确后在含20ml液体培养基的离心试管里摇床培养生长重组卡介苗rBCGTRAIL。此处感受态BCG在转化时各做一阳性对照pBCG(BCG中只含有空白质粒pMM61)及阴性对照(BCG)；(5)重组卡介苗的培养重组卡介苗rBCGTRAIL在试管中摇床培养三周左右， 0D600值约为0. 6时，接种于三角烧瓶中进行培养，rBCG的接种、大量培养及冻存步骤同 BCG，不同的是液体及固体培养基里均含有50mg/L卡那霉素；(6)重组卡介苗rBCGTRAIL鉴定与功能检测进行抗酸染色初步确定rBCGTRAIL 为抗酸杆菌；抽提rBCGTRAIL质粒DNA后，PCR扩增得到TRAIL的基因片段；WesternBlot 检测到rBCGTRAIL培养上清中和菌体中有TRAIL蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTRAIL 培养上清中有高含量的TRAIL。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下可见一条特异的片段，和TRAIL 780bp相吻合；酶切鉴定2kb DNAMaker ；以EcoR I和Hind III双酶切为4600bp，780bp两条，条带同预期结果。重组卡介苗rBCGTRAIL包含Ag85B信号肽和TRAIL基因片段。本发明构建卡介苗穿梭表达载体的目的是确保在rBCG中合成的细胞因子能够分泌到细胞外表达。为此，利用结核分支杆菌主要分泌蛋白Ag85B的特点，将其信号肽基因片断克隆至hsp60启动子下游的多克隆位点上，使其与TRAIL连接，起到将TRAIL经胞膜转运并分泌到胞外的作用。酶切及DNA测序结果表明，外源基因已包含了 Ag85B的信号肽序列， 并有起始密码子ATG和终止密码子TAA，且序列结果完全正确，证明该信号肽基因确已加在 PMV261多克隆位点上。本实验经酶切、PCR和DNA测序鉴定，证实所克隆的信号肽Ag85B片段和TRAIL片段与文献结果完全一致，pMV261-Ag85B-TRAIL的连接方向正确，阅读框与预期完全一致，说明卡介苗穿梭表达载体的构建完全符合本实验的设计要求。我们应用基因工程技术，在质粒PMW61中先后克隆TRAIL基因和BCG_Ag85B信号肽基因，构建了新一代卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL，克服了最为关键的技术难题，进一步通过电穿孔技术把载体导入BCG中，使BCG分泌表达TRAIL，从而达到构建重组卡介苗的目的。本发明的优点是⑴重组卡介苗rBCGIL-TRAIL具有TRAIL和BCG的双重功能，可以更好地发挥两者的协同增效作用；(2)由于rBCGIL-TRAIL能够分泌TRAIL，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下用量可低于BCG，从而降低了毒副作用；( rBCGIL-TRAIL能够直接在局部高效分泌TRAIL，这既可协同rBCGIL-TRAIL杀伤肿瘤细胞，又避免了使用外源细胞因子所带来的高额费用。
图1为卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B_TRAIL构建示意图。
图2为甲醛变性凝胶电泳图。图3为TRAIL基因PCR扩增后的电泳鉴定结果。图4为Ag85B信号肽基因PCR扩增后的电泳鉴定结果。图5为PCR产物行1 %琼脂糖凝胶电泳。图6为酶切鉴定。图7为穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL用BCG85B的正向引物测序。
图8为穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL用BCG85B的反向引物测序。图9为穿梭表达载体pMW61-Ag85B-TRAIL用TRAIL的正向引物测序。图10为穿梭表达载体pMW61-Ag85B-TRAIL用TRAIL的反向引物测序。图11为重组卡介苗的抗酸染色结果。图12为重组卡介苗质粒DNA PCR扩增结果。图13为重组卡介苗分泌蛋白Wfestern Blotting结果。图14为BTT739荷瘤小鼠不同治疗组的肿瘤生长趋势。图15为不同治疗组肿瘤生存期的比较。图16为治疗后组织学检查(HE染色400 X)。图17为治疗后组织学检查(HE染色)。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1本发明构建卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B_TRAIL的流程图参见图1。一、实验方法1.获取目的基因小鼠TRAIL基因1. 1组织中总RNA的抽提1.1.1 总 RNA 抽提(1)取-80°C冰箱中保存的小鼠脾脏，每50-100mg小鼠脾脏组织加Iml TRIZ0L， 用勻浆器勻浆；于室温静置5min ； (2)按每Iml TRIZOL试剂加入0. 2ml氯仿，盖上盖子，充分震荡15sec，室温静置2-;3min，4°C，12000rpm,离心15min ； (3)将上层水相吸入新管，按每 Iml TRIZOL试剂加入0. 5ml异丙醇，混勻，室温静置IOmin, 4°C，12000rpm,离心IOmin,倾去上清；(4)用75%乙醇清洗RNA沉淀，每ImlTRIZOL加入Iml 75%乙醇，震荡，4°C，7500rpm， 离心5min，静置晾干；(5)加入RNase-free water溶解，保存于_70°C。1. 1. 2 总 RNA 的鉴定1. 1. 2. 1分光光度仪检测从-70°C冰箱中取出75%乙醇溶解的RNA标本，4°C 离心(13000rpmX5min)，弃上清，用枪头吸干，加DEPC水100 μ 1溶解、混勻(可用离心机 13000rpm 甩数秒)。吸取 DEPC 水溶解的 RNA 2 μ 1，加 98 μ 1 DEPC 水，测定 0D260, 0D280, 其比值大于1.8，证明没有蛋白质残余。1. 1. 2. 2甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量将电泳槽、电泳板、梳子用3 % H2A 泡15min(取30% H2A 35ml，加蒸馏水350ml)，DEPC水冲淋一次，用透明胶封好电泳板边缘；用事先已处理过的烧瓶、量筒、电泳板配置甲醛变性凝胶；准备RNA电泳缓冲液 (1XM0PS) 250ml。吸 4μ1 RNA 力Π 4 μ 1 DEPC 水稀释，65°C 水浴变性 5min (或 70°C，3min) 后马上置冰上，加8 μ 1 RNA上样缓冲液，在1 XMOPS电泳缓冲液中点样、电泳至满意为止。 紫外灯下观察、拍照。可见^S、18S、5S三条明带(参见图2)。1. 2RT合成小鼠脾脏总cDNA建立40 μ 1逆转录反应体系，见表1-1。加样后在离心机上甩IOmin左右，置42°C 水浴反应lh，70°C加热15min以终止反应。然后置冰上，或_20°C保存备用。
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表I-I逆转录反应体系(40 μ 1体系)
权利要求
1.一种TRAIL重组卡介苗的构建方法，其特征在于，其中的分泌型卡介苗穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL具有SEQ ID NO :1所示的序列，所述载体是在pMM61的EcoR I和 Hind III间插入TRAIL，然后在BamHI和EcoR I间插入Ag85B，分泌型卡介苗穿梭表达载体 pMV261-Ag85B-TRAIL的构建方法通过以下步骤实现(1)PCR扩增Ag85B信号肽片段和RT-PCR获取目的基因TRAIL，并对其筛选、鉴定；(2)利用DNA重组技术，将以上两个片段插入质粒pMM61的HSP60启动子下游， TRAILDNA与pMW61分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，得重组质粒pMW61_TRAIL， BCG基因组DNA的抽提，并且PCR扩增信号肽基因BCG-85B-SS，将pMV261_TRAIL和 BCG-85B-SS分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，得重组质粒pMV261_Ag85B_TRAIL ；(3)分泌型BCG穿梭表达载体pMM61-Ag85B-TRAIL转化大肠杆菌、抽提和纯化；(4)对pMV261-Ag85B-TRAIL进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定；其中 TRAIL PCR 扩增上游引物序列为 5，-GACGAATTCTACATGTACTTCACCAACG-3，，F 5' 端引入 EcoR I 识别序列 G' AATTC，下游引物序列为 5，-CGCAAGCTTCTAGTTAATTAAAAAGGCTC C-3’，R 5'端引入 Hind III 识别序列 A' AGCTT0
2.根据权利要求1方法构建的一种TRAIL重组卡介苗在制备预防和治疗浅表性膀胱肿瘤及预防其术后复发的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用。
3.根据权利要求1方法构建的一种TRAIL重组卡介苗在制备预防和治疗结核病的重组卡介苗rBCGTRAIL中的应用。
全文摘要
本发明提供一种TRAIL重组卡介苗的构建，涉及一种包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信号肽片段和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段的穿梭表达载体及其构建方法，得到的穿梭表达载体pMV261-Ag85B-TRAIL用于构建重组卡介苗rBCGTRAIL，可在制备治疗浅表性膀胱肿瘤和预防其术后复发以及预防结核病发生的TRAIL重组卡介苗中应用。本发明的重组卡介苗具有TRAIL和BCG的双重功能，可更好地发挥两者的协同增效作用；由于rBCGIL-TRAIL能够分泌TRAIL，在达到同样甚至增加免疫效果的条件下用量可低于BCG，从而降低了毒副作用；rBCGIL-TRAIL能够直接在局部高效分泌TRAIL，既可协同rBCGIL-TRAIL杀伤肿瘤细胞，又避免了使用外源细胞因子所带来的高额费用。
文档编号A61P31/06GK102327604SQ201110241850
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者周卸来, 沈周俊, 章国卫, 金晓东, 陈善闻 申请人:沈周俊