专利名称：紫草在制备抑制甲型h1n1流感病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药应用领域，具体涉及紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒药物中的应用。
背景技术：
流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，具有流行面广，传染性高，发病率高等特点。流感可通过呼吸道、消化道、眼结膜等多种途径传播。迄今为止，爆发过5次流感的大流行和若干流感小流行。严重危害人类的健康和生命。1918年爆发的西班牙流感造成全球30%人感染，而将近2000万人死于这次大流感。最近全球爆发的甲型Hmi流感即是人、禽、猪三种不同来源流感病毒的杂合体，其特点是突然出现，传播迅速。虽然其致死率不高，但未来发展变化难以预料。09年6月11日，世界卫生组织正式宣布把甲型Hmi 流感警戒级别升至6级，世卫组织认为疫情已经发展为全球性“流感大流行”。紫草，为紫草科紫草属植物，又名山紫草，紫丹，紫草根。紫草的药理作用如下1、抗病原微生物作用紫草煎剂、紫草素、β - 二甲基丙烯酰紫草素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等具有抑制作用。紫草素对大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显抑菌作用。2、抗炎作用紫草的乙醚、水、乙醇提取物均有一定的抗炎作用。3、对心血管系统的作用紫草煎剂对心脏的作用为小量兴奋，大量则抑制，最后停止于舒张期。4、避孕作用国外所产路边紫草Lithospermum ruderale 50%的醇浸出液，能降低小白鼠的生育率，使正常小白鼠的动情间期延长，对未成熟的雄性或雌性小鼠，可引起性器官、胸腺、垂体重量减轻，生长发育延缓，。5、抗肿瘤作用有报道指出，紫草素对肝癌和Lewis肺癌有一定的放射增敏作用.紫草素加放射可能增强Lewis肺癌小鼠巨噬细胞对瘤细胞的直接杀伤力.带瘤小鼠生存期的延长间接增加了放疗效果。据报道，紫草根对绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎有一定的疗效.用美蓝试管法初筛，紫草根对急性淋巴细胞性白血病有极轻度的抑制作用.紫草可减少(鼠)自发性乳癌的发病率。迄今为止，尚未有关于紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒药物中的应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒药物中的应用。本发明是通过以下技术方案实施的紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒药物中的应用。所述紫草为生药材或紫草提取物中的一种。所述的紫草提取物的制备方法为将紫草用蒸馏水浸泡过夜后，过滤，得第一次浸泡过滤后所得液体和过滤后的紫草，将过滤后的紫草再加入蒸馏水浸泡过夜后，以文火加热煮中药3-5小时，过滤，得熬煮过滤后的液体，将第一次浸泡过滤后所得液体和熬煮过滤后所得液体混合，得到混合溶液，冻干混合溶液后得到紫草粉末，所述将苦楝皮用蒸馏水浸泡过夜后和将过滤后的苦楝皮再加入蒸馏水浸泡过夜后的步骤中的蒸馏水替换为甲醇或乙醇中的一种。将所述冻干后的紫草粉末溶解用蒸馏水溶解至浓度为10mg/mL，得紫草溶液。将神经氨酸酶溶解在MES缓冲液(PH 6. 5)和CaCl2中，得神经氨酸酶溶液，取神经氨酸酶溶液和紫草溶液在37°C培养箱中孵育30分钟，然后加入MUNANA的缓冲溶液，立即用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长360nm，发射波长450nm，测定时间为8min。对0. 001-0. IU的神经氨酸酶，对其具有抑制作用的紫草溶液浓度为 31. 25-250ug/mLo本发明的原理本发明的效果主要是通过对神经氨酸酶(neuraminidase，ΝΑ)的抑制能力来验证的。NA是甲型Hmi流感病毒最重要的蛋白之一，在病毒从感染细胞中的释放的过程中，特别是病毒复制周期后期，NA起主要作用。由于它具有酶功能，能水解细胞膜上各种糖蛋白受体末端的唾液酸，因此，NA能够清除病毒颗粒表面糖蛋白末端的唾液酸，防止病毒的自我聚积，促使子代病毒释放。另外，NA是一个重要的抗原，并且是病毒穿透呼吸道上皮黏液所必需的。NA—旦发生突变，可导致甲型Hmi流感病毒对神经氨酸酶抑制剂产生抗性作用。本发明的有益效果1、本发明为紫草发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。2、本发明以紫草生药材、紫草提取物抑制甲型Hmi病毒，效果显著，紫草对神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC5tl)为 IC5tl ( μ g/mL) = 184. 3 士 13. 1 和 IC5tl ( μ g/mL)= 0. 76士0. 27，本发明提供了紫草在作为抑制甲型Hmi流感病毒的药物中活性成分的应用， 为今后开发出一种新的抑制甲型Hmi流感病毒的药物奠定基础。
图1为细胞相对活力与紫草溶液浓度的关系；图2为紫草溶液浓度与病毒产量的MTT检测图。
具体实施例方式以下通过实例形式的具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明。实施例1称取IOg粉碎的紫草，IOOml蒸馏水浸泡过夜，过滤，得第一次浸泡过滤后所得液体和过滤后的紫草，在过滤后的紫草中再加入IOOml蒸馏水，浸泡过夜后，以文火加热煮中药4小时，过滤，得熬煮过滤后的液体，将第一次浸泡过滤后所得液体和熬煮过滤后所得液体混合，得到混合溶液，冻干混合溶液后得到紫草粉末。将紫草粉末用蒸馏水溶解至浓度为 10mg/mL，得紫草溶液。实施例2将神经氨酸酶(A/California/7/2009(HlNl) NYMC X-179A c 流感病毒株，经鸡胚传代，收尿囊液，_70°C保存备用)溶解在32. 5mmol/L的MES缓冲液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神经氨酸酶溶液，取49 μ L神经氨酸酶溶液和1 μ 1紫草溶液在37°C培养箱中孵育30分钟，然后加入终浓度为20 μ mol/L的MUNANA的缓冲溶液50 μ 1，立即用Bio-RedFLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长360nm，发射波长450nm，测定时间为8min。检测结果为，紫草对神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC50)为IC50(yg/mL) = 184. 3 士 13. 1。实施例3将神经氨酸酶(Clostridiumperfringens (C. welchii)，拟876，购于 Sigma)溶解在32. 5mmol/L的MES缓冲液(PH 6. 5)和4mmol/L CaCl2中，得神经氨酸酶溶液，取49 μ 1神经氨酸酶溶液和1 μ 1紫草溶液在37°C培养箱中孵育30分钟，然后加入终浓度为20 μ mol/ L的MUNANA的缓冲溶液50 μ 1，立即用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长 360nm，发射波长450nm，测定时间为8min。抑制程度的强弱可以从加或不加紫草的初始反应速率来决定检测结果为，紫草对神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC5tl)为IC5(l(yg/mL)= 0. 76 士 0. 27。实施例4结合图1图2说明本实施例。为了检测紫草在细胞水平的抗流感作用，我们将由实施例1得到的紫草溶液按梯度稀释成不同的浓度，分别为31. 25ug/ML、62. 5ug/ML、125ug/ML和250ug/ML，将上述紫草溶液分别与100TCID50的病毒等体积孵育2小时，总体积为200 μ L，并且稀释液都用维持液(即无血清，含10ug/ml胰酶的DMEM)，然后将上述一系列紫草溶液与100TCID50的病毒的混合物接种到已经长成单层的MDCK细胞培养板上，2小时后，换不含FBS的维持液，24小时后换含2% FBS的维持液，连续观察2-3天，用MTT法检测细胞病变效果。同时设只加维持液、只加同稀释度的病毒液或者只加不同浓度药物稀释液作为对照组，于371、5%0)2培养，对中药紫草进行抗病毒活性研究。结果如图1所示，在没有加入Hmi病毒时，细胞活力随着紫草浓度的增加呈现降低趋势，说明紫草提取物具有细胞毒性；在同时加入紫草提取物和Hmi病毒时，随着紫草提取物浓度的增加，细胞活力也随着增加。说明紫草可以抑制流感病毒，保护MDCK细胞免受病毒破坏，而且保护效应随着紫草提取物浓度的增加而增加即呈现浓度依赖性。图2为紫草溶液浓度与病毒产量的MTT检测图，由图可见，随药物浓度的提高，病毒产量逐渐下降，这同时辅证了紫草有较好抗流感病毒作用。
权利要求
1.紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒的药物中的应用，其特征在于所述紫草为生药材或紫草提取物中的一种。
3.根据权利要求2所述的紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒的药物中的应用，其特征在于，所述的紫草提取物的制备方法为将紫草用蒸馏水浸泡过夜后，过滤，得第一次浸泡过滤后所得液体和过滤后的紫草，将过滤后的紫草再加入蒸馏水浸泡过夜后，以文火加热煮中药3-5小时，过滤，得熬煮过滤后的液体，将第一次浸泡过滤后所得液体和熬煮过滤后所得液体混合，得到混合溶液，冻干混合溶液后得到紫草粉末。
4.根据权利要求3所述的紫草在制备抑制甲型Hmi流感病毒的药物中的应用，其特征在于，所述紫草提取物的制备方法中，所述将紫草用蒸馏水浸泡过夜后和将过滤后的紫草再加入蒸馏水浸泡过夜后的步骤中的蒸馏水替换为甲醇或乙醇中的一种。
全文摘要
紫草在制备抑制甲型H1N1流感病毒药物中的应用，属于中药应用领域。本发明是通过以下技术方案实施的首先制备紫草溶液，取神经氨酸酶溶液和紫草溶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入MUNANA的缓冲溶液，用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测。本发明为紫草发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；本发明以紫草生药材、紫草提取物抑制甲型H1N1病毒，效果显著，为今后开发出一种新的抑制甲型H1N1流感病毒的药物奠定基础。
文档编号A61K36/30GK102293807SQ20111025308
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者徐经纬, 房学迅, 杨卫, 杨艳琴, 王晨旭, 田莉, 肖延蒙 申请人:中国科学院长春应用化学研究所