一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法

专利名称：一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法。
背景技术：
兔病毒性出血症俗称兔癌，是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性、致死性传染病，曾是兔的一种毁灭性传染病，因给养兔业带来巨大的经济损失而备受养兔业的关注。1984年中国首次报道了该病。 1989年，世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病 (王永坤等，兔瘟的诊断与防治，1992)。在2000年国际病毒分类委员会(ICTV)的第七次报告中，将兔出血热病毒列入了杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形，无囊膜，直径32-36nm，20面体对称(张丽红等，广东畜牧兽医科技，31 :9_11，2006)，其衣壳由32个高 5-6nm的圆柱状壳粒构成，由主要结构蛋白VP60多重拷贝所组成。负染电镜表面具有嵌杯样病毒典型的杯状形态结构，电镜下还可见少数没有核心的病毒空衣壳。RHDV基因组含2个开放阅读框，5’末端的长开放阅读框架(ORFl)编码一个2344 氨基酸的多聚蛋白前体，它被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白和多个非结构蛋白，其中衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称为VP60，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。3’ 末端的短开放阅读框架(0RF2)，位于7025-7378bp之间，编码病毒另一个小的结构成分，称为 VP10。VP60的N-端组成衣壳蛋白的内部区，C-端组成衣壳蛋白的外部。N-端的第 31-250之间的氨基酸是主要的抗感染免疫决定区。对VP60蛋白的研究发现，体外表达该衣壳蛋白时，在没有其他任何成分存在的条件下，可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV 病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(Rob N,Virus-like particle as immunogens, Trends in Microbiology, 11 :438-444,2003) 近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗的抗原载体越来越受到广大科学家的重视。病毒样颗粒是模拟病毒的颗粒形态特点，将外源基因片段产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒，它的外部形态与病毒颗粒相同，甚至还有某些病毒受体的天然配体，同时，还可将其他病原的特异性抗原等呈递在自己的表面，因而在病原体的疫苗研究中发挥着重要的作用。VLPs常可以诱导产生较灭活疫苗和可溶性多肽更为强烈的体液免疫应答，因为其表面是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原呈递过程来呈递糖蛋白抗原的，而该法提呈引起的免疫应答优于溶解状态，故在保护作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫应答可望更接近自然感染，这样，病毒样颗粒更有可能广泛用于疫苗的研制。而且，VLPs由于不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原载体(Nagesha H S，Virus-like particles of calicivirus as epitope carriers, Arch Virol, 144 :2429-2439,1999)。大量的实验表明，RHDV不能在鸡胚上增殖，也难于在各种原代或传代细胞中稳定增殖。目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。近来，新型疫苗的研究主要集中在基因工程苗的研制上，已在大肠杆菌、酿酒酵母、痘苗病毒以及植物等多种表达系统中表达了 VP60蛋白(刘怀然等，动物医学进展，24:7-9，2003)。Boga等在大肠杆菌中表达了 RHDV西班牙 AST/89株的主要衣壳蛋白VP60，发现当VP60以β -半乳糖苷酶融合蛋白表达时，仅与天然 VP60拥有部分相同抗原并不诱导产生保护性免疫；而在以T7RNA聚合酶为基础的表达系统中则可表达与天然VP60抗原性极为相似的蛋白质并可诱导产生有效的保护性免疫，能抵抗住提纯RHDV的致死性攻击；Boga等在酿酒酵母中表达VP60并能形成病毒样颗粒；Famos 等将Spanish isolate AST/89的VP60在酵母中进行高效表达，蛋白表达量高达1. 5g/L且大约70%表达蛋白进行了糖基化修饰；严维巍等将RHDV VP60基因插入pPICZ B经毕赤酵母表达的重组蛋白具有血凝特性且可被抗RHDV的高免血清所抑制(严维巍等，中国兽医学报，23 =447-449, 2003)。！^ernandez-Femandez等采用洋李痘马铃薯Y病毒构建的载体成功表达了 VP60，该表达产物接种兔能抵御致死剂量RHDV的攻击O^ernandez-Fernandez M R， Protection of rabbits against rabbit hemotthagic disease virus by immnization with the VP60 protein expressed in plan ts with a potyvirusbased vector, Virology, 280 :283-291, 2001) ；Castanon等采用马铃薯表达含VP60的抽提物对兔进行免疫，产生特异的抗体反应并可提供对RHDV强毒攻击的保护(Castanon S,The effect ofthe promoter on expression of VP60gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants, Plant Science, 162 :87-95,2002)。目前，RHDV基因工程疫苗研究仍然存在一些问题大肠杆菌表达的VP60具有不可溶性及免疫效果相对较差的缺点，其应用前景并不乐观；重组病毒疫苗存在向环境扩散经遗传修饰的生物体安全问题；采用转基因植物生产VP60的表达水平目前还不理想；因而研制RHD安全、高效的新型疫苗势在必行。兔瘟以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血及出血变化为特征，感染兔常在48-72 小时内死亡。根据病变特点可作出初步诊断，结合实验室检测病死兔组织中的病毒抗原进行确诊，主要用血凝实验(HA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫电镜技术及分子生物学方法。昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVQ自1983年建立以来(Smith，Mol. Cell Biol.， 3 :2156-2165,1983)，已有近千种外源基因在该系统中得到表达。其优点为A :BEVS表达效率高，表达产物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似；B 家蚕杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；C 应用晚晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平；D 借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能；E 杆状病毒对脊椎动物无病原性，家蚕没有与人畜共患的疾病，被认为遗传学上是安全的表达载体(景志忠等，中国兽医科技，31 :43-45，2001)。家蚕BmNPV表达系统(家蚕生物反应器)自1984年开发以来已在医学、兽医学和农业上得到广泛的应用。1997年，田鄂等以修饰的BmNPV为载体，在家蚕细胞和幼虫中成功表达了日本血吸虫中国大陆株^KD谷胱甘肽S-转移酶基因(生物化学与生物物理学报，1997，四(1) :33-38)。张传溪等把EPO基因在家蚕培养细胞和幼虫中获得了表达，表达产物具有良好的体外活性。1990年，储瑞银等把HBsiVg基因在家蚕培养细胞及其培养液中分别得到了表达。周耐明等在家蚕幼虫和蛹中成功表达了 HBsAg，其产量平均每只蚕约为750 μ g，每个蛹约为690 μ g，产物主要以糖基化形式存在。口蹄疫病毒等数十种动物病毒抗原蛋白先后被表达和纯化，其中相当一部分正在进行商品化开发(李志勇等，Plos one, e2273，2008)。用BmNPV体系生产的宠物(猫和狗)的预防重组IL制剂(Intercat)已由日本“T0RAY”株式会社生产并投入市场(木村滋，昆虫生物工厂[M]，日本工业调查会，2000， 124-127)。现今家蚕杆状病毒表达系统的有关技术已相对成熟，该系统表达外源基因，不仅经济、高效，而且可提供一条新的技术途径。利用家蚕生物反应器生产兔出血热病毒空衣壳抗原，保证其具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性，为兔出血热疫苗的商业生产奠定基石出。

发明内容
本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达兔出血热病毒空衣壳抗原的方法。本发明的另一目的是提供兔出血热病毒衣壳蛋白VP60优化基因。本发明的再一目的是提供包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60或上述优化基因的杆状病毒转移载体、及重组杆状病毒。本发明的再一目的是提供制备兔出血热病毒空衣壳抗原的昆虫生物反应器。本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的兔出血热病毒空衣壳抗原。本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的兔出血热病毒空衣壳抗原作为兔出血热疫苗的应用。根据本发明的兔出血热病毒衣壳蛋白VP60优化基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。进一步，本发明提供了包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60或上述优化基因的杆状病毒转移载体。本发明还提供了通过使用上述的杆状病毒转移载体感染杆状病毒获得的重组杆状病毒。本发明还提供了制备兔出血热病毒空衣壳抗原的昆虫生物反应器，通过使用上述重组杆状病毒感染昆虫宿主获得。因此，根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法包括以下步骤1)构建包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或上述优化基因的杆状病毒转移载体，其中，是按家蚕的密码子频率进行密码子优化；2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的兔出血热病毒空衣壳抗原，收获并纯化所表达的抗原。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因的原始序列及经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID
5NO. 2所示，其编码的病毒VP60的氨基酸序列SEQ ID NO. 3。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法包括，其中，所述的杆状病毒转移载体优选自 AcRP23-lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac, Bacmid、 p2Bac、p2Blue、BlucBacH(pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC 129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、 pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A,pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、 pAcUW4U pAcUW42、pAcUW43、pAcUW5U pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、 pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、ρJVETL, ρJVNheU pJVPIO、pJVrsMAG, pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSH0NEX 1. UpSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI_、pVL1391、 ρVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、或 pUAC-5，或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体，更优选为PVL1393杆状病毒运载载体。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所构建的转移载体为带有兔出血热病毒衣壳蛋白VP60原始序列的载体pVL1393-RHDV-VP60和带有兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因经密码子优化后序列的载体pVL 1393-RHDV-VP60-0。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的杆状病毒优选自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV 或 SpltNPV,更优选为家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8。根据本发明的优选实施方式，其中，所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV(RHDV-VP60)，(2)重组家蚕核型多角体病毒 rBmNPV(RHDV-VP60-0)。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的昆虫宿主选自麟翅目昆虫，如家香(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、菌麻香(Philosamia cynthia ricim)(Dictyoplca japanica)(Philosamia cynthia pryeri)、丰乍H (Antheraea pernyi)、日本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus) > 苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae) > ^4 1 ^ (Spodoptera littoralis)、H占虫(Spodoptera frugiperda) > 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾 (Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar) 等；更优选为家蚕(Bombyx mori)。根据本发明的兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其中，所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体(更优选为将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含兔出血热病毒空衣壳抗原的家蚕幼虫或蛹的体液或组织勻浆)；其中，所述的蛹体最优为1-2天的早期嫩蛹。本发明采用基因重组技术，对兔出血热病毒(RHDV)的衣壳蛋白基因序列进行密码子优化，将该蛋白的原始序列(SEQ ID NO 1)及优化后的序列(SEQ ID NO 2)克隆到杆状病毒转移载体(如 AcRP23_lacZ，AcRP6_SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid, BlueBacII (pETL)，p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3, pAcC129、C4、DZl, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2、7、8， pAcMPl、2， pAcRP23、25， pAcRW4, pAcsMAG, pAcUWl、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII， pBlueBacHis, pEV55、mXIV, pIEINeo, ρJVETL, pJVNhel, ρJVP10, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl，pPBac，pSHONEX 1. l,pSYN XIV VI+,pSYNVI+wp,pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393， pVL941、945、985，ρVTBac, pBM030, pUAC-5)上，在多角体启动子、plO启动子或别的病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，使RHDV衣壳蛋白的原始序列及优化后的序列整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒可通过添食或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体 (最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产兔出血热病毒空衣壳抗原。根据本发明的优选实施方式，对兔出血热病毒(RHDV)的衣壳蛋白基因序列进行密码子优化，将该衣壳蛋白的原始序列及优化后的序列，即SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2 所示的碱基序列克隆到杆状病毒运载载体PVL1393上，再通过体内重组将兔出血热病毒衣壳蛋白基因的原始序列VP60及密码子优化后的序列VP60-0分别转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR 检测技术，获得携带兔出血热病毒衣壳蛋白基因的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(HDV-VP60)、 rBmNPV(HDV-VP60-0)；将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1_5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖 rBmNPV (HDV-VP60)、rBmNPV (RHDV-VP60-0)；当 rBmNPV (RHDV-VP60)、rBmNPV (RHDV-VP60-0) 在蚕体内复制时，VP60及VP60-0基因在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，并自我组装成为兔出血热病毒空衣壳抗原；在感染3-6天(最佳为5天，25°C饲养温度)后收集含兔出血热病毒空衣壳抗原的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体勻浆)，经过辐射照射杀灭杆状病毒、蛋白纯化后便得到安全、高效的兔出血热病毒空衣壳抗原，此抗原可用于制备预防兔病毒性出血症的注射用疫苗。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产兔出血热病毒抗原，其生产成本显著低于传统的制备兔出血热病毒抗原的方法，建厂，三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。总体而言，本发明方法可以大幅度降低兔出血热病毒空衣壳抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。


图1为家蚕生产的RHDV空衣壳粒子的电镜扫描图；图2为家蚕生产的空衣壳免疫金标记电镜扫描图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图详细产生本发明，本领域的普通技术人员可以理解这些实例完全是例证性的，不限制本发明的保护范围。实验材料大肠杆菌株E. coli DH5a购自Promega公司；克隆载体pEASY_T3购自全式金公司；克隆载体PMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET48a+、受体菌E. coli T0P10和BL21 (DE3)均为均为常规菌株购自Novagen公司，运载载体pVL1393购自于hvitrogen公司；兔出血热病毒衣壳蛋白基因的原始序列VP60是从发病动物病变组织中提取并克隆到载体上得到，密码子优化后的序列VP60-0直接基因合成得到；家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJS由中国科学院生命科学院吴祥甫研究员惠赠，中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；高表达家蚕品种JYl由中国农业科学院蚕业科学研究所选育，中国农业科学院生物技术研究所保存。酶与试剂所用限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司；T4 DNA Ligase及缓冲液为Promega公司产品；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；foiaseA、 dNTPs购自Sigma公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为iTranGen Biotech公司产品；DEPC、M-MLV-Rtase (逆转录酶)购自Promega公司。t it i式 M :bisacrylamide> acrylamide> IPTG、X-Gal _ 自 Promega 目； Tris, Ampicillin、Kanamycin, IPTG、SDS,尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N, N，N ‘， N ‘ -Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素 (Kanamycin)、细胞培养基TC-100购自Sigma公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0. 2um、0. 45um滤器购自Gelman kiences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；琼脂粉为日本进口分装；Ni-NTA树脂、Proteinase K、胎牛血清购自hvitrogen公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物均由三博远志生物技术有限责任公司合成培养基大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕细胞培养基为TC-100培养基。兔出血热病毒衣壳蛋白基因表达产物的动物实验在隔离实验室进行。实施例1、兔出血热病毒衣壳蛋白基因的原始序列VP60在家蚕生物反应器中的可溶性表达及表达产物的检测1、兔出血热病毒衣壳蛋白基因的原始序列VP60的获得TRIzol法提取兔患病组织基因组RNA。设计引物，通过RT-PCR的方法扩增出兔出血热病毒衣壳蛋白基因的原始序列VP60(SEQ ID NO. 1)。所设计反转录特异引物为=RHDV-RT 5' -GGATTAAAACCTAACCTACC-3‘。衣壳蛋白基因的原始序列VP60的扩增引物为VP60上游5' -GGAATTCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3‘ (EcoR I) ;VP60 下游5‘ -GAAGATCTTC AGACATAAGAAAAGCCATTG-3‘ (Bgl II)。PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分析片段大小。回收目的基因片段，与克隆载体连接(PMD18-T)连接。转化E. coli热激感受态细胞，鉴定阳性重组质粒。将鉴定为阳性克隆(命名为PT-RHDV-VP60)的菌种重新加入含有Amp的LB培养液，220r/min摇培过夜后后，吸取ImL新鲜菌液至无菌的Eppendorf管中，加入少量甘油，以封口膜封好后，到北京三博生物技术有限公司测序部进行测序，结果如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示。测序结果用DNAMar、DNAMAN软件对序列进行分析。2、杆状病毒转移载体pVL1393-RHDV-VP60的构建测序鉴定过的重组质粒PT-RHDV-VP60用EcoR I酶切，使其线性化。真核表达载体质粒PVL1393作同样酶切处理。酶切回收的RHDV-VP60目的片段与经EcoR I/Bgl II双酶切酶切后的转移载体PVL1393的连接。重组质粒经EcoR I/Bgl II双酶切、菌液PCR鉴定和基因测序，鉴定正确的重组质粒命名为PVL1393-RHDV-VP60。3、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJS的繁殖及病毒DNA的制备按Sigma公司产品说明配制培养基，27°C下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJS感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3 4天后收集病毒感染液，离心(IOOOOrpmX lOmin)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用Iml 病毒 DNA 抽提液(IOOOml 中含 Tris 12. lg, EDTA 33. 6g, KCl 14. Ig, ρΗ7· 5)悬浮病毒粒子沉淀，抽提DNA，放4°C保存备用。4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV (RHDV-VP60)的构建和获得接种大约IXlO6细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1. 5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1 μ g家蚕杆状病毒亲本株Bm-NPV-ZJ8DNA, 2 μ g重组转移质粒pVL1393-RHDV_VP60DNA和5 μ 1月旨质体，用无菌双蒸水补足体积到60 μ 1，轻轻混勻，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。显微镜观察，将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2 3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV (RHDV-VP60)。将重组家蚕杆状病毒rBmNPV (RHDV-VP60)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmNPV (RHDV-VP60)。利用PCR方法分析外源基因整合，寡核苷酸引物为VP60 上游5' GGAATTCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3 ‘ (EcoR I) ;VP60 下游 5' -GAAGATCTTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3‘ (Bgl II)。结果证明获得了重组病毒。6、RHDV-VP60在家蚕蛹和蚕体中高效表达所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1。JYl品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后4 选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1. OX 105rBmNPV (RHDV-VP60)， 4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20°C冻存以进行双抗体夹心ELISA法检测。7、RHDV-VP60病毒样颗粒的收集与纯化。将含表达有RHDV-VP60的蚕蛹用预冷的PBS (料液比为1 9)在勻浆器中研磨后， 用0. 45um滤器过滤。在30%蔗糖溶液中，1. 5 X 10 超高速离心2小时。用含0. IM NaCl的 Tris-HCl (PH7. 0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP (GE公司)，0. 5M NaCl的Tris-HCl (PH7. 0)洗脱。再通过分子筛层析S200 (GE公司)。纯度可达95%，得率可达40%以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成病毒空衣壳粒子的，而且还建立了相应的家蚕表达基因工程兔出血症病毒空衣壳抗原的纯化方法。8、表达产物的检测(I)ELISA 及 Western blotting 检测注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测RHDV-VP60抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的RHDV-FR2蛋白免疫新西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。任取所收蚕血中的样品，用包被液做梯度稀释，从50X两倍倍比稀释到6400倍，每个梯度处做双孔检测，计算时取平均值，各取100 μ L包被到酶标板上。结果如表1，表明RHDV-VP60基因在家蚕中表达量高，平均每头家蚕或蚕蛹中的表达量至少lmg，在3200倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。表IELISA检测家蚕生物反应器表达的VP-60基因
稀释度1501100120014001 8001 16001 32001 6400表达抗原1.2070.7690.8750.5980. 5760. 4880. 4160. 318阴性对照0.4170.3350.3230.2980. 2810. 2300. 2610. 173空白对照0.2130.2480.2800.232 Western blotting结果表明在重组病毒感染后家蚕血淋巴样品的上清液中可检测到60kD大小的特异性条带。(2)家蚕中表达的兔出血症病毒空衣壳抗原的血凝实验检测取人的“0”型红细胞于阿氏液中保存，用20倍的生理盐水洗涤红细胞三次，最后将红细胞用生理盐水配成悬液。在U形板的每孔加入灭菌的生理盐水50ul ；用微量移液器取适当倍数稀释的含病毒空衣壳溶液稀释液50ul加入第1孔内，混勻后，吸取50ul后加入到第二孔中，如此连续稀释至第10孔，第10孔吸取50ul液体弃掉；第11孔和第12孔为生理盐水对照，阴性蚕血按相同方法稀释。每孔加入50ull%人的“0”型红细胞悬液，混勻后，4°C下反应45分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。初步纯化的兔出血症病毒空衣壳抗原稀释到64000倍时为仍为阳性。(3)动物免疫实验。将收集的纯化抗原RHDV病毒衣壳粒子经肌肉注射和口服途径各免疫10只家兔为试验组，另设5只家兔只注射佐剂和喂食抗原的为对照组，家兔均为RHDV阴性。5ug RHDV 空衣壳抗原与油佐剂等体积混合试制疫苗，Iml/只在家兔上进行动物试验，21天后取血， 进行ELISA抗体效价检测，试验组全部产生针对RHDV的抗体，注射组检测效价可达3200倍以上；将初步纯化的空衣壳病毒粒子，按每只家兔50 μ g的量与同样体积的含25% -35%脂肪酸和8% -12%的蜂胶混合，最佳浓度为脂肪酸30% +蜂胶10% (脂肪酸组成为棕榈酸 8%、油酸19%、其它成分为3% )，经超声波乳化后灌注，一个月后，口服组检测IgA效价也达到1600倍。结果试验组100%产生保护抗体，而对照组没有检测到抗体；在取血的同时进行攻毒实验，免疫组的不论注射还是口服均没有兔子死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的兔出血热症状。实施例2、兔出血热病毒衣壳蛋白基因经密码子优化后的序列VP60-0在家蚕生物反应器中的可溶性表达及表达产物的检测1、优化后序列VP60-0的获得根据家蚕密码子偏好性对实施例1测得的兔出血热病毒衣壳蛋白基因原始序列 VP60进行优化，不改变氨基酸序列，优化后序列VP60-0如SEQ ID NO. 2所示，原始序列中含有串联的稀有密码子，这减少了翻译序列或者甚至解除翻译装置，优化后序列CAI值由 0. 72提高为0. 79，调整了 GC含量及不宜峰以延长mRNA的半衰期，GC含量由54. 9%调整为 53. 34%，那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构被破坏，原始序列中在90位点有Bam HI酶切位点，487位点有B10 I酶切位点，优化后的序列无此两个酶切位点。直接合成优化后的序列VP60-0并克隆到载体pUC57上，两端分别带有Bam HI.EcoR I酶切位 点。测序鉴定后经分析得SEQ ID NO :2以及相应的氨基酸序列SEQ ID NO. 3。2、重组杆状病毒转移载体pVL1393-RHDV-VP60-0的构建测序鉴定过的重组质粒pUC57-RHDV-VP60-0用Bam HI酶切，使其线性化。真核表 达载体质粒PVL1393作同样处理。将质粒pUC57-RHDV-VP60-0 经 Bam HI/EcoR I 双酶切的产物与 Bam HI/EcoR I 双 酶切后的转移载体PVL1393的连接。将连接产物转化感受态細胞，鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-RHDV-VP60-0。3、家蚕核型多角体病毒亲本株Bm-NPV-ZJS的繁殖及病毒DNA的制备同实施例1。4、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(RHDV-VP60_0)的构建和获得同实施例1。将重组家蚕杆状病毒rBmNPV (RHDV-VP60-0)感染正常生长的BmN細胞，培养3天 后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV (RHDV-VP60-0)。利用PCR方法分析 外源基因整合。寡核苷酸引物为按优化的VP60-0基因序列内部设计两条引物鉴定序列RHDV-F 5' -ACCTTGGTCCTTTCCGTATATAA-3‘；RHDV-R 5' -CTTGGCGACAGTTTGAGCAC-3‘。结果证明获得了重组病毒。5、RHDV-VP60-0在家蚕蛹和蚕体中高效表达所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1。JYl品种家蚕饲养按吕鸿声主编的 《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后4 选择平 均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约 1. OX 105rBmNPV(RHDV-VP60-0)，4-5天后收集发病蚕蛹和取蚕血，_20°C冻存以进行双抗体 夹心ELISA法检测。6、RHDV-VP60-0病毒样颗粒的收集与纯化将含表达有RHDV-VP60-0的蚕蛹用预冷的PBS (料液比为1 9)在勻浆器中研磨 后，用0. 45um滤器过滤。在30%蔗糖溶液中，1.5X 10 超高速离心2小吋。用含0. IMNaCl 的Tris-HCl (PH7. 0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交換层析填料SP(GE公司)， 0. 5M NaCl的Tris-HCl (PH7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200 (GE公司)。纯度可达95%， 得率可达40%以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白是可溶的，而且还建立了相应的家 蚕表达基因工程兔出血症病毒空衣壳抗原的纯化方法。7、兔出血症病毒检测抗体的制备设计三对特异引物将优化后的衣壳蛋白序列VP60-0分三段进行原核表达，引物 设计如下RHDV-Fl 5' -CGGGATCCATGGAGGGAAAAGCGAGGACAG-3‘ (BamHI)RHDV-Rl 5' -CAAGCTTCTAGACCTGAATAGCATTGGTAGAAC-3‘ (Hind III)RHDV-F2 5' -CGGGATCCACCTTGGTCCTTTCCGTATATAA-3‘ (Bam HI)RHDV-R2 5' -CAAGCTTCTACTTGGCGACAGTTTGAGCAC-3' (Hind III)RHDV-F3 5' -CGGGATCCACCGGAGCGCCCAACAATTTG-3' (Bam HI)
RHDV-R3 5' -CAAGCTTCTACACATACGAGAAACCGTTG-3‘ (Hind III)(1)构建重组质粒 pT3-RHDV-FRl、pT3-RHDV-FR2 及 pT3_RHDV_FR3以质粒pUC57-RHDV-VP60-0为模板，分别用上述三对引物扩增目的片段 RHDV-FRl、RHDV-FR2、RHDV-FR3 ；玻璃奶法纯化回收PCR产物，PCR纯化产物与克隆载体PEASY-T3连接，连接产物转化已制备的大肠杆菌热击感受态细胞，挑斑培养进行重组质粒的鉴定，细胞破碎法快速鉴定后挑取质粒带退后的菌株，碱裂解法提取重组质粒 PT3-RHDV-FR1、pT3_RHDV_FR2 及 pT3_RHDV_FR3，用 Bam Hi/Hind III 进行双酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的重组菌菌液送三博远志公司进行DNA测序验证。将测序结果与先前质粒 PUC57-RHDV-VP60-0的序列进行核酸序列比对，结果表明三个重组质粒中的目的序列与先前质粒序列结果一致，没有发生移码突变并含有设计的酶切位点。(2)重组质粒 pEI^8a-RHDV-FRl、pEI^8a-RHDV-FR2、pET28a-RHDV-FR3 的构建测序正确的重组质粒pT3-RHDV-FRl、pT3_RHDV_FR2 及 pT3_RHDV_FR3 经 Bam HI/ Hind III双酶切消化后，玻璃奶法纯化回收酶切产物，将其连接到已被Bam Hi/Hind III 双酶切消化的表达载体pET-28a上，连接产物转化ToplO感受态细胞，挑斑后先进行细胞破碎法快速鉴定，而后碱法少量快速抽提重组质粒pET28a-RHDV-FRl、pET28a-RHDV_FR2、 pEI^8a-RHDV-FR3，用 Bam Hi/Hind III 双酶切鉴定。(3)重组质粒在大肠杆菌中诱导融合表达酶切正确的上述重组质粒分别转化BL21感受态细胞，IPTG诱导4h后收集菌液， 用SDS-PAGE电泳分析表达情况，结果显示与阴性对照相比，转化重组质粒PT3-RHDV-FR2的菌株出现的融合蛋白表达条带最浓集。挑取效果最好的表达菌株单菌落振荡培养后进行诱导，经超声破碎后，SDS-PAGE电泳分析显示表达的融合蛋白(His-RHDV-FM)存在于沉淀中，表明表达蛋白以包涵体形式存在。(4)融合蛋白的纯化及其抗体的制备挑取成功重组的表达菌株单菌落振荡培养后进行大量诱导表达，采用处理包涵体蛋白的相关溶液与方法将包涵体溶解后，用Ni+_NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲 NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、 洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。结果显示大小正确的单一条带，表达的目标蛋白His-RHDV-FR2大小与阳性对照一致，用脲NTA-100进行洗脱时，洗脱峰最大，SDS-PAGE胶纯化蛋白后用灭菌小刀割下纯化条带蛋白，并切成Imm3的小胶块，送中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室进行质谱分析，方法为二级质谱的数据库搜索鉴定法，结果显示样品蛋白序列检测覆盖率34. 82%，分析显示，该样品kore Delta Cn超过30，有2段肽段能够匹配得上且其中1段肽段氨基酸序列大于50，能够检测出来的AA序列与预期序列匹配率高达 34. 68%，所以能够确定纯化蛋白就是目标基因RHDV-FR2的表达产物。纯化表达的融合蛋白并进行蛋白浓缩，采用Bradford法测浓缩后蛋白溶液的浓度。将纯化好的浓度大于Img/ ml，总量不低于;3mg的融合蛋白进行SDS-PAGE后，割下目的条带，把胶粒磨碎后送于中科院遗传与发育研究所，免疫RHDV阴性兔子制备多克隆抗体。(5)多克隆抗体效价检测纯化的RHDV-FR2蛋白免疫新西兰大白兔4次后获得多克隆抗体，用纯化的融合蛋白作包被抗原，用 PBS 稀释不同倍数 100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、 51200的多克隆抗血清作一抗，夹心ELISA检测法测抗体效价图，免疫前兔血清作阴性对照，在A492nm处吸光值，以各个稀释倍数为X轴，各稀释倍数下的吸光值平均值为Y轴。通常大于规定的阴性对照OD值的2. 1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)，结果显示 自制的抗体在抗原蛋白浓度为10μ g/ml时抗体的效价可达1 3200。8、表达产物的检测(I)ELISA 及 Western blotting 检测注射病毒后的家蚕，待发病时收集蚕血。ELISA法检测RHDV-VP60-0抗原蛋白表达量的高低，包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的RHDV-FR2蛋白免疫新西兰大白兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。任取所收蚕血中样品，用包被液做梯度稀释，从100X两倍倍比稀释到6400倍。每个梯度处做双孔检测，各取100 μ L包被到酶标板上。结果如表2，表明RHDV-VP60-0基因在家蚕中表达量高， 比RHDV-VP60基因在家蚕中表达量高出2-3倍，在6400倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应(如表2所示)。表2ELISA检测家蚕生物反应器中表达的VP60-0基因
稀释度11001200140018001 16001 32001 6400表达抗原2.5842..5662.2981.4340. 8560. 6350. 576阴性对照0.2450.2020.2310.2120. 2020. 2030. 2空白对照0.1980.193Western blotting结果表明在重组病毒感染后家蚕的血淋巴样品的上清液中可检测到60kD大小的特异性条带。(2)家蚕中表达的兔出血症病毒空衣壳抗原的血凝实验检测取人的“0”型红细胞于阿氏液中保存，用20倍的生理盐水洗涤红细胞三次，最后将红细胞用生理盐水配成悬液。在U形板的每孔加入灭菌的生理盐水50ul ；用微量移液器取纯化的空衣壳抗原稀释液50ul加入第1孔内，混勻后，吸取50ul后加入到第二孔中， 如此连续稀释至第10孔，第10孔吸取50ul液体弃掉；第11孔和第12孔为生理盐水对照， 阴性蚕血按相同方法稀释。每孔加入50ul 人的“0”型红细胞悬液，混勻后，4°C下反应 45分钟，待对照的红细胞完全沉积后观察结果。初步纯化的兔出血症病毒空衣壳抗原稀释到10万倍时仍为阳性。(3)电镜及胶体金免疫电镜观察病毒样颗粒收集与纯化后的样品用水稀释10倍，放上铜网，滤纸片吸干液体后用 ddH20滴洗后再用滤纸片吸干，将铜网置于醋酸铀液滴上，滤纸片吸干液体后放入新的醋酸铀液滴上，重复3次后电镜观察，如图1，可观察到兔出血热病毒空衣壳粒子，大小与预期相符。样品用水稀释40倍后放铜网，滤纸片吸干液体后用ddH20滴洗后再用滤纸片吸干，将铜网置于稀释的一抗液滴上约3min，滴洗吸干后置于稀释的胶体金二抗液滴上，滴洗吸干后铜网置于醋酸铀液滴上，洗染3次后电镜观察，如图2，可观察到吸附胶体金的兔出血热病毒空衣壳粒子，数量不少，表明兔出血热病毒蛋白VP60能自主在家蚕体内组装为病毒空衣壳粒子。
(4)动物免疫实验实验步骤同实施例1，将收集的纯化抗原RHDV病毒衣壳粒子经肌肉注射和口服途径各免疫10只家兔为试验组，另设5只家兔只注射佐剂和喂食抗原的为对照组，家兔均为 RHDV阴性。5微克的RHDV空衣壳抗原与油佐剂等体积混合试制疫苗，Iml/只在家兔上进行动物试验，21天后取血，进行ELISA抗体效价检测，试验组全部产生针对RHDV的抗体，注射组检测效价可达3200倍以上；将初步纯化的空衣壳病毒粒子，按每只家兔50 μ g的量与同样体积的含25% -35%脂肪酸和8% -12%的蜂胶混合，最佳浓度为30%脂肪酸和10%蜂胶(脂肪酸组成为棕榈酸8%、油酸19%、其它成分为3% )，经超声波乳化后灌注，一个月后，口服组检测IgA效价也达到1600倍。结果试验组100%产生保护抗体，而对照组没有检测到抗体；在取血的同时进行攻毒实验，免疫组的不论注射还是口服均没有兔子死亡，而对照组攻毒后3天内全部死亡，表现典型的兔出血热症状。
权利要求
1.一种兔出血热病毒衣壳蛋白VP60优化基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一种重组杆状病毒，其特征在于，通过使用包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或权利要求1所述优化基因的杆状病毒转移载体DNA与杆状病毒DNA进行重组或转座反应后而获得。
3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒为包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV，或包含权利要求1所述优化基因的重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV。
4.一种制备兔出血热病毒衣壳蛋白VP60的昆虫生物反应器，其特征在于，通过使用表达兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或权利要求1所述优化基因的重组杆状病毒感染昆虫宿主获得。
5.一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)构建包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或权利要求1所述优化基因的杆状病毒转移载体；2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒进行共转染，获得重组杆状病毒；3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的兔出血热病毒衣壳抗原颗粒，收获并纯化所表达的抗原。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、 HaNPV,HzNPV,LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV 或 SpltNPV，优选为家蚕核型多角体病毒BmNPV0
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主选自鳞翅目昆虫，优选为家香(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟香 (Dictyoplca japanica)、樗香(Philosamia cynthia pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、 曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾 (Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫 (Heliothis zea)(Heliothis assulta) λ ^^^ (Heliothis virescens) 粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)，更优选为家香。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的昆虫宿主是家蚕幼虫和蛹，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5 龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集家蚕幼虫或蛹的体液或组织勻浆。
9.由权利要求5 8中任一项所述方法制备的兔出血热病毒衣壳蛋白VP60。
10.权利要求9所述兔出血热病毒衣壳蛋白VP60作为兔出血热疫苗的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种兔出血热病毒空衣壳抗原的制备方法。根据本发明的方法包括以下步骤1)构建包含兔出血热病毒衣壳蛋白VP60基因或优化基因的杆状病毒转移载体，其中，是按家蚕的密码子频率进行密码子优化；2)将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA进行共转染，以发生同源重组或转座，获得重组杆状病毒；3)将重组杆状病毒感染昆虫宿主细胞；4)培养被感染的昆虫宿主，表达相应的兔出血热病毒空衣壳抗原，收获并纯化所表达的抗原。本发明方法可以大幅度降低兔出血热病毒空衣壳抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
文档编号A61P31/14GK102304529SQ201110254439
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者张志芳, 张渭蛟, 易咏竹, 李轶女, 王树坤, 王石宝, 石小峰, 舒惠国 申请人:中国农业科学院生物技术研究所