专利名称：枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及枸杞提取物的新用途，具体涉枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用。
背景技术：
慢性应激障碍是指个体面对长期特殊环境变化而不能调整和稳定内稳态时所经历的持续的情感变化及心理压力。其致病机制在于应激原刺激机体失稳态应激刺激持续或反复存在，则应激的效应累积形成稳态应变负荷，循环和组织中的应激相关神经内分泌介质和细胞因子持续升高，进而发展为稳态应变超负荷。由于大量神经内分泌介质和细胞因子的长期作用，导致各系统器官、组织和细胞功能异常。其中创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)是指由于生命受到威胁、遭遇悲剧导致的精神、躯体症状持续的临床综合征。1980年美国精神病协会《精神障碍统计诊断手册》 DSM-III(第三版)中确立了 PTSD的诊断标准。1993年PTSD正式纳入《国际疾病分类》 ICD-10(第十版)。随后1994年美国精神障碍诊断统计分类手册-第四版(DSM-IV)将 PTSD归在焦虑障碍中，并将其分为三种类型急性(症状持续小于3个月)、慢性(症状至少持续3个月)、伴延迟起病(症状在应激后至少6个月才出现)。PTSD症状主要表现为对创伤事件的闯入性记忆为特征的病理性重现、对创伤相关线索的回避、持续性的高唤醒，以及对创伤经历的选择性遗忘和情感麻木，患者因此而感到痛苦不堪。PTSD症状一般在遭受创伤后数日甚至数月后出现，病程可长达数年。不同类型导致的创伤后应激障碍发病率不同，有调查发现在美国经历过创伤事件的普通人群有25% 30%的人患有PTSD ；—些特殊创伤，如性暴力等，可以导致更高的发病率。在职业卫生领域，因突发事故造成的PTSD，也有较高的发病率。据美国精神病协会统计，美国PTSD的人群总患病率为1 % 14%，平均为8%，个体终身患病危险性达3% 5%， 女性约为男性的2倍。德国研究结果显示患病群体为1. 3%，而阿尔及利亚显示高达37. 4%。 而我国伍志刚、张本等分别对洞庭湖严重洪涝灾区成人和唐山大地震所致孤儿PTSD发病率调查情况显示为33. 89%和23%。2008年“5. 12”汶川地震极重灾区幸存者三个月后罹患失眠、梦魇、闪回等PTSD典型症状困扰的人约有18.4 %。PTSD以其发病率高，病程长，疗效差等严重影响创伤救治，是医学研究难点。PTSD的发生一方面给患者本身造成生理残疾， 患精神病或躯体疾病(如心血管疾病、睡眠障碍、抑郁所致的自杀等)的危险性显著增加， 使患者的生存质量显著下降；另一方面因患者工作功能减退，给社会造成沉重的经济负担。目前关于PTSD的临床药物治疗多次采用苯二氮卓类(benzodiaz印ines，BZ)抗焦虑药、抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)、单胺氧化酶抑制药、非典型抗精神病药、心境稳定剂和抗惊厥药、交感神经阻滞剂等，但是长期应用抗焦虑药易导致依赖，停药出现戒断反应，还损害认知功能；其它一些药物总是由于药物作用机制不同，不良反应多。中药在创伤后应激障碍治疗中的作用一直为医学工作者所关注。目前国内已经开展的研究包括逍遥散加减、益智仁等都有不错的疗效。枸杞是中国传统的药食兼用的名贵中药材，其味甘、性平，具有补肝肾、益精血和明目的功能，近年来，一直受到临床和营养研究领域的高度重视。枸杞的药理和保健作用与其中含有的生物活性物质枸杞多糖有很大关系。现代科学研究表明，枸杞多糖具有调节机体免疫、清除氧自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用，具有广阔的开发应用前景。虽然在预防和治疗慢性应激以及创伤后应激障碍有良好的研究效果，但主要还是以复方制剂出现，未见有关药、食兼用的成分单独应用枸杞及其枸杞提取物一枸杞多糖成分预防和治疗应激的报道。
发明内容
本发明的目的是提供枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，该药物具有预防和治疗应激、改善认知的功能。本发明用枸杞的提取物一枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides)为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。本发明所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是将提取的纯度> 50%的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。进一步，将提取的枸杞多糖，装入胶囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片剂，每片含枸杞多糖500 mg。所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是 将提取的纯度>50%的枸杞多糖与玉米淀粉混合均勻，装入胶囊或制成片剂。进一步，每粒胶囊含枸杞多糖500啤、含玉米淀粉IOOmg;或者每片含枸杞多糖500 mg、玉米淀粉lOOmg。本发明的有益效果药物由枸杞多糖组成的单方制剂，具有抗应激作用，能够于预防和治疗慢性应激和或创伤后应激障碍，改善认知的功能，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。
图1是对照、应激、预防性LBP灌胃和治疗性LBP灌胃组大鼠拒俘反应与对照组比较图，(* P < 0. 05，** P < 0. 01 ；与应激组比较# P < 0. 05，# # P < 0. 01)。图2是对照、应激、预防性LBP灌胃和治疗性LBP灌胃组大鼠应激后lw，2w, 4w僵立反应比较与对照组比较图，(* P < 0.05，* * P < 0.01 ；与应激组比较# P < 0. 05, # #
P < 0.01)。
图 3-1.是应激后Iw水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-2.是应激后2w水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-3.是应激后^水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-4.是预防性LBP3d灌胃应激后Iw水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-5.是预防性LBP3d灌胃应激后2w水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-6.是预防性LBP3d灌胃应激后#水迷宫空间探索轨迹图。
图 3-7.是应激后灌胃LBPlw水迷宫空间探索轨迹图。
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图3-8.是应激后LBP2w水迷宫空间探索轨迹图。图3-9.是应激后LBP#水迷宫空间探索轨迹图。图4-1.是幽闭电刺激大鼠海马神经元各区形态学特点图( ，HE、Nissl和 Silver 染色)。图4-2.是LBP预防灌胃对幽闭电刺激大鼠海马神经元各区形态学影响图(4w， HE、Nissl 和 Silver 染色)。图4-3. LBP治疗灌胃对幽闭电刺激大鼠海马神经元各区形态学影响图( ，HE、 Nissl 和 Silver 染色)。图4-4.是对照组、应激组、应激前LBP、应激后LBP组大鼠海马CAl的神经元密度图(均数士标准差，神经元/50 mm2)。图4-5.是对照组、应激组、应激前LBP、应激后LBP组大鼠海马CA3的神经元密度图(均数士标准差，神经元/50 mm2)。图4-6.对照组、应激组、应激前LBP，应激后LBP组大鼠海马DG的神经元密度图 (均数士标准差，神经元/50 mm2)。图5-1.是对照、应激、应激前LBP，应激后LBP组大鼠海马DG区BrdU阳性细胞数图(均数士标准差)。图5-2.激光共聚焦显微镜观察3d预防性低剂量灌胃大鼠应激后Iw海马DG区 BrdU阳性表达图(右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。图5-3.是激光共聚焦显微镜观察3d预防性低剂量灌胃大鼠应激后#海马DG区 BrdU阳性表达图(右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。图5-4.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后Iw海马DG区BrdU阳性表达图(右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。图5-5.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后2w海马DG区BrdU阳性表达图(右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)
图.5-6.是激光共聚焦显微镜观察高剂量灌胃大鼠应激后#海马DG区BrdU阳性表达图(右边上部为BrdU核染色，左边为DAPI核染色)。
具体实施例方式实施例一枸杞多糖的制备
称取枸杞果肉干粉末100g，石油醚(60 — 90°C)回流脱脂二次，每次1 h。再用80% 乙醇回流提取2次，每次池，以除去单糖和低聚糖。将药渣加500ml水90 °C水浴提取二次，合并二次提取液。旋转薄膜蒸发仪上减压浓缩至150 ml，加少量活性炭脱色，过滤。滤液加5倍量95%乙醇，放置过夜，抽滤后的沉淀以100 ml水溶解重复醇沉一次。沉淀以 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，60 ！干躁，即得枸杞多糖，纯度彡50%。过筛， 装胶囊，即得枸杞多糖胶囊；每粒胶囊含枸杞多糖500 mg ；或者制成片剂，每片含枸杞多糖 500啤，配加玉米淀粉lOOmg。除了采用上述方法提取外，也可以采用传统水提取法、快速酶提取法、超声波、微波辅助水以及超临界C02萃取等多种提取法，不同方法枸杞提取物均具有预防和治疗慢性应激障碍和或创伤后应激障碍得药效。
枸杞多糖也可参照CN 101029088A公开的“一种枸杞多糖的制备方法”制备，也可以直接购买市售产品，如纯度> 50%的枸杞多糖，批号20100409，陕西瑞康生物工程有限公司提供，临用时加生理盐水制成2 mg/ml,20 mg/ml浓度的药液供药理实验用。以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果。实验材料
动物SD大鼠，雄性，体重210±^g，重庆市第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供，普通级动物，许可证SCXK (yu) 2007017。试药试剂
枸杞多糖，纯度> 50%，批号20100409，陕西瑞康生物工程有限公司生产； 氯化钠注射液，批号K090915，四川科伦药业股份有限公司生产； 戊巴比妥钠，丹麦进口分装；
多聚甲醛分析纯，批号20100501，成都市科龙化工试剂厂生产； 无水乙醇，批号20100509，重庆茂业化学试剂有限公司生产； 磷酸二氢钠，批号20091105，重庆川东化工集团有限公司生产； 磷酸氢二钠，批号90519，重庆博弈化学试剂有限公司生产； 蔗糖分析纯，批号20081113，成都市科龙化工试剂厂生产； 二甲苯，批号20090911，重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂生产； 大鼠BrdU单克隆抗体，批号B2531，美国Sigma提供； BrdU，批号 118K4835，美国 Sigma 提供；
羊抗小鼠FITC，批号ZF-0312，进口分装中国中衫金桥公司提供。实验仪器
旷场测试系统(美国Smart公司)，冰冻切片机(CM1900美国Leica)，激光共聚焦扫描系统(TCSSP2，德国Leica)，蜡块切片机(SM2000R，德国Leica)，台式低温离心机(美国 Sigma2-16k), YLS-17B穿梭箱(山东益研发展有限公司)，高架十字迷宫(美国Smart公司)， 幽闭电击箱(自制)，水迷宫系统(中国中国医科院药物研究所)
实验例1 枸杞多糖对幽闭电击致PTSD大鼠一般状态、体重和拒付反应观察。SD大鼠72只，雄性，体重210士^g，实验分组为对照组，18只；幽闭电击应激组， 18只；LBP低剂量预防组，18只；LBP高剂量治疗组，18只；
对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激；
LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；
LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg，每组18只，观察时间点为应激后lw，2w，#。拒俘反应以动物从未接触过的手套抓大鼠，观察其反应。记分标准0 很容易抓取动物；1 尖叫或者回避；2 尖叫并回避；3 逃脱；4 逃脱并尖叫；5 试图撕咬手套；6 主动跃起攻击。总分用于评价动物恐惧与冲突素质特征的改变。分别在应激前、应激后lw， 2w，#秤量大鼠体重，计算体重变化率。体重变化百分率=(应激后lw，2w，#体重一应激前体重)/应激前体重X 100%。进行双因素方差分析。实验结果参见图1 一般观察与对照组大鼠相比，经幽闭+电刺激后大鼠出现行为异常，主要表现为行动迟缓，对外界刺激极少作出反应和易激怒；容易躁狂型(13只)。而预先灌胃低剂量组大鼠和高剂量灌胃组大鼠比较温顺和安静，配合研究人员的任何操作。体重改变与对照组大鼠相比，幽闭电刺激大鼠的体重明显降低，随着时间降低， 应激后前2w体重降低最显著(P < 0.01)。低、高剂量灌胃组表现为体重持续增加，且高剂量灌胃组的体重增加幅度在应激后4周较低剂量组明显(P < 0. 05)
拒俘反应改变与对照组大鼠相比，幽闭电击组的拒付反应强烈，保持对陌生手套的竭力挣脱(评分为3分)或者为尖叫、逃脱(评分4分)，且在应激最初2w时间内拒俘反应保持稳定，第4周，组间评分平均略有下降，仍维持高反应性。预先灌胃组则在应激后4周反应稳定，为1. 5士0. 55，高剂量灌胃组则在应激后Iw反应为尖叫或回避，到^时则为容易抓取或者轻微挣脱反应组间值为0. 33 士0. 52。枸杞多糖能够显著平静应激大鼠情绪，减少创伤后应激障碍/慢性应激的体重减少。实验例2 枸杞多糖对创伤后应激障碍闯入性记忆的影响。采用大鼠僵立行为检测。SD大鼠，雄性，体重；实验分组为对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8 00灌胃，每次每只10 mg/kg,连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2w，#。闯入性记忆主要以僵立行为来体现，僵立行为测定将经应激大鼠放入反射箱，测3分钟僵立行为。僵立行为的定义，是一种常见于啮齿类动物的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，可以有一定程度的摇摆。观察可见大鼠除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的行为方式。连续检测3min，僵立的时间占总时间的百分比即为僵立时间百分比。进行双因素方差分析。实验结果参见图2 在置身于幽闭电击箱时，对照组和PTSD组大鼠在僵立时间表现出明显差异。双因素方差分析表明PTSD组大鼠僵立行为持续的时间百分比最大(P < 0. 01)，预先低剂量灌胃组与PTSD组比较有僵立时间百分比明显下降，应激后Iw僵立时间百分比大于高剂量灌胃组，应激后2w没有差异，应激后#大于高剂量灌胃组。实验例3 枸杞多糖对创伤应激障碍/慢性应激大鼠的自由活动的影响。采用大鼠旷场行为检测。SD大鼠，雄性，体重210±^g，实验分组为对照组、幽闭电击应激、LBP低剂量预防组、LBP高剂量治疗组。对照组大鼠每天给大鼠等量生理盐水灌胃，不给予应激。LBP低剂量预防组，在电击前3天，每日1次，固定时间为上午8:00灌胃，每次每只10 mg/kg，连续3天；LBP高剂量治疗组按每日每次20 mg/kg。每组M只，观察时间点为应激后lw，2wjw。用一 100 cm XlOO cm X 48 cm木制箱，底板有25个20cm X20 cm的方格，光照度为60 lux，设置屏障，操作室内隔音。观察者在行为实验室内用摄像系统记录动物在旷场木箱内5 min的行为表现，包括水平活动、直立次数、修饰次数、呆滞和排便量。其中水平行走、探究、呆滞和修饰行为通过摄像分析系统获得数据，每只动物的排便量是以旷场试验结束后排便的颗粒数来表示。实验结果与对照组大鼠相比，幽闭电击大鼠的旷场行为随着时间改变明显，横向穿格、直立次数明显减少(P < 0.01)，修饰次数在应激后lw，2w明显减少，#无差异。与应激组相比，低剂量预防组，应激后lw，横向穿格没有差异，但是直立行为减少，梳洗行为增加(P < 0.05)。应激后2w横向运动和直立行为明显增加(P < 0 .01)，梳洗行为无差异，应激后4周时各项行为皆较应激组增加明显(P < 0.01)，旷场行为随应激时间延长行为表现下降但降低幅度低于应激组。高剂量灌胃组旷场行为增加明显，且在第4周与对照组仍有差异(P < 0.0 。高剂量组各项行为皆高于低剂量灌胃预防组。枸杞多糖预防性剂量服用可显著减少应激对大鼠旷场行为的影响，治疗性服用效果较预防效果明显。(见表1) 表1.枸杞多糖对PTSD大鼠旷场实验的影响
权利要求
1.枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是将提取的纯度> 50%的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是将提取的枸杞多糖，装入胶囊，每粒含枸杞多糖500 mg,或制成片剂，每片含枸杞多糖500 mg。
3.枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是将提取的纯度>50%的枸杞多糖与玉米淀粉混合均勻，装入胶囊或制成片剂。
4.根据权利要求3所述的枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是每粒胶囊含枸杞多糖500啤、含玉米淀粉IOOmg ；或者每片含枸杞多糖500 mg、玉米淀粉lOOmg。
全文摘要
本发明公开枸杞多糖在防治慢性应激和创伤后应激障碍的药物中的应用，其特征是将提取的纯度≥50％的枸杞多糖装入胶囊或制成片剂。每粒含枸杞多糖500㎎，或制成片剂，每片含枸杞多糖500㎎。将提取的纯度≥50％的枸杞多糖与玉米淀粉混合均以，装入胶囊或制成片剂。每粒胶囊含枸杞多糖500㎎、含玉米淀粉100mg；或者每片含枸杞多糖500㎎、玉米淀粉100mg。本发明的有益效果药物由枸杞多糖组成的单方制剂，具有抗应激作用，能够于预防和治疗慢性应激和或创伤后应激障碍，改善认知的功能，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。
文档编号A61P25/28GK102283858SQ201110259399
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者伍亚民, 刘良明, 杨策, 高洁 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院