专利名称：一种利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法
技术领域：
本发明涉及一种介孔二氧化硅材料在特定溶液条件下对S iRNA的装载方法。
背景技术：
随着细胞与分子生物学技术的进步，RNA干扰技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域(Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4卷，457页，2003年)。 RNA干扰是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默的现象，其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)，这些 siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。1998年， Fire等(Nature，391卷，806页，1998年)在线虫中发现RNA干扰现象后，RNA干扰技术作为特异性抑制基因表达的方法，逐渐成为生命科学领域研究的热点。自从Elbashir等 (Nature，409卷，363页，2001年)发现人工合成的siRNA能诱导特异性靶基因降解，大量的研究集中到将RNA干扰用于基因功能研究和人类疾病治疗领域。目前现有的RNA干扰技术主要是将化学合成的siRNA引入细胞，继而识别特异的信使RNA实现干扰功能。但体外合成的siRNA进入体内后存在易被降解、作用时间不稳定的缺点，因此，RNA干扰技术在应用方面所存在的最大障碍是缺少能够稳定有效地将siRNA诱导进入细胞的载体，如何开发低毒高效的载体成为RNAi技术发展所面对重要课题(Mol. Pharm. 6卷，651页，2009年)。近年来，将介孔二氧化硅纳米颗粒用于药物载体的研究成为了关注的焦点。由于介孔二氧化硅纳米颗粒特殊的孔道结构具有较高的比表面积，较大的孔容积等特点，使其不仅能够装载大量的药物分子，还能够在生理环境下实现对药物分子的可控释放(Chem. Mater. 13卷，308页，2001年)。近期研究表明，纳米级的介孔二氧化硅颗粒不仅可以被哺乳动物细胞吞噬，还具有良好的生物相容性和低细胞毒性(Adv. Drug. Delivery Rev. 60卷， 1278页，2008年)。因此，介孔二氧化硅纳米颗粒成为了一种非常理想的药物载体，其在此领域中的突出表现也使人们尝试将其用于装载siRNA分子。然而，由于二氧化硅是一种多硅羟基材料，而siRNA表面富含磷酸根基团，它们在水溶液环境中均呈负电性而无法直接实现装载。探索合适的方法使介孔二氧化硅材料的孔道能够装载siRNA分子，成为了将介孔二氧化硅材料成功应用于siRNA装载的关键所在。现有的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法如2009年，ACSNano杂志公开报道了 T. Xia等人的研究工作(ACS Nano, 3卷，3273页，2009年)，他们在介孔二氧化硅颗粒表面修饰PEI，实现了对siRNA的装载；2009年Small杂志报道了 A. M. Chen等人的研究工作(Small，5卷，2673页，2009年)，他们通过相似的表面修饰正电性高分子的方法， 成功实现了药物和siRNA的装载。但是，上述工作均只采用了修饰后的介孔二氧化硅纳米颗粒外表面来装载siRNA，没能发挥介孔纳米颗粒孔道结构、高比表面积、大孔容积的优点； 而且由于颗粒外表面上大量的氨基被用来吸附siRNA分子，使得颗粒表面无法被进一步功能化如聚乙二醇等修饰，从而限制了颗粒在生物体内的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种可以利用介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道装载siRNA分子的方法，所述方法通过将siRNA诱导进入介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道，不仅实现siRNA的装载还能调节siRNA在颗粒中的装载量；另外此方法还具有在生理环境条件下siRNA分子不会从孔道中脱离，装载后的纳米颗粒表面可进一步修饰的特点，具有很好的应用前景。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载SiRNA的方法，包括以下步骤1、取0. 05 Img介孔二氧化硅纳米颗粒于2mL离心管中，加入0. 02 4mL的弱极性溶剂，通过超声振荡(60 200W)处理使颗粒在弱极性溶剂中均勻分散，所采用的介孔二氧化硅纳米颗粒的颗粒粒径为30 1000纳米，优选粒径为30 100纳米；颗粒的介孔孔径为2 10纳米，优选孔径为2 6纳米；所述的介孔二氧化硅纳米颗粒可以是单一的介孔二氧化硅成分，也可以是内核为无机非金属氧化物成分或金属成分外壳为介孔二氧化硅成分，具有核壳结构的颗粒材料，其中所述的无机非金属氧化物成分包括四氧化三铁、氧化锰和氧化锌中的一种或多种，所述的金属成分包括金、银、铜和镍中的一种或多种；所述的弱极性溶剂为纯的有机溶剂，包括甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种；2、向步骤1最终所得的混合溶液中加入0. 005 0. 75mL的高盐溶液，再通过外加超声震荡(60 200W)使加入高盐溶液后的混合溶液均勻分散，高盐溶液的成分含量为最终浓度为1 6摩尔每升的盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的一种或多种；最终体积分数为10 50%的甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂中的一种或多种；最终体积分数为 50 90%的去离子水、双蒸水或灭菌水；高盐溶液的pH范围为4 6 ；3、将siRNA溶解到去离子水、双蒸水或灭菌水中配置成为0. 25 2. 5mg/mL的溶液，向步骤2最终所得的溶液中加入配置好的siRNA溶液0. 01 0. 5mL ；将最终所得溶液放入0 40°C条件下恒温条件吸附1 24h，通过协调弱极性溶剂、高盐溶液、siRNA水溶液三者之间的体积分数配比，即弱极性溶剂高盐溶液siRNA水溶液为2 8 0.5 1.5 1，我们可以很容易的调控介孔二氧化硅材料对siRNA的吸附量；4、将步骤3中最终所得的溶液进行高速离心(8000 12000rpm)处理，取出上清溶液并测量siRNA浓度，通过吸附前后上清溶液中siRNA浓度的差异确定最终的siRNA装载量；离心分离后的颗粒用0. 05 ImL纯乙醇润洗一次除去多余的高盐溶液残留物质，然后加入0. 05 0. 5mL的纯乙醇并通过的超声(60 200W)处理使颗粒分散均勻；5、向步骤4中最终所得的溶液中加入0. 05 ImL含正电性高分子的纯乙醇溶液 (所述纯乙醇溶液中正电性高分子的含量为0. 5 10mg/mL)，超声震荡(60 200W)条件下放置10 60分钟，而后通过高速离心(8000 12000rpm)将颗粒从溶液中分离，所述正电性高分子包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖和超支化聚乙烯氨胺等高分子及其功能化的衍生物中的一种或多种；6、向步骤5中最终所得的颗粒中加入去离子水0.2 lmL，在超声振荡(60 200W)条件下放置10 30分钟，除去颗粒表面游离的正电性高分子；7、最后通过高速离心(8000 12000rpm)将颗粒从溶液中分离，并将颗粒加入到灭菌水中，配置成2 4mg/mL的溶液保存。
本发明的优点是1.此方法避免了复杂的化学修饰，仅仅通过改变溶液的亲疏水性质，成功地实现了介孔二氧化硅材料对siRNA分子的装载，简单有效，易于操作。2.加入所述高盐溶液后，其所含的盐离子有助于减弱介孔二氧化硅颗粒和siRNA 表面的静电排斥力，有利于siRNA在介孔中的吸附。3.介孔二氧化硅对siRNA的装载量可以通过改变吸附溶液环境中各组分之间的配比进行调控。4.使用正电性高分子装载siRNA的颗粒进行包覆后，在生理溶液环境条件下， siRNA将稳定存在于孔道内而不被释放。5.最终所得的颗粒表面存在大量的伯胺基团，可以进行进一步的功能化修饰，满足不同的生物医用需求。
图1为利用磁性介孔二氧化硅纳米颗粒，构建用于siRNA干扰的基因载体，黑色短棒为siRNA，蓝色球状物为介孔二氧化硅纳米颗粒(M-MSNs)，橙色线条表示聚乙烯亚胺分子；图2为磁性介孔二氧化硅纳米颗粒在不同乙醇体积配比条件下对siRNA的装载量；图3为调节聚乙烯亚胺的用量，当聚乙烯亚胺与颗粒的质量比为3. 以上时，将能够阻止siRNA从颗粒中释放。
具体实施例方式在以下实施例中我们选取了一种带有四氧化三铁内核的介孔二氧化硅纳米颗粒 (magnetic mesoporous silica nanoparticles,M_MSNs)进行siRNA装载试验,其中M-MSNs 的粒径为50纳米左右，介孔孔道的孔径为3. 4nm，整个实验流程如图1所示。实例1 1.先将0.2mg M-MSNs加入到2mL离心管中，再向其中加入0. 03mL纯乙醇，IOOw 条件下超声振荡30s后使颗粒在溶液中均勻分散。2.向步骤1最终所得的溶液中加入0. OlmL高盐溶液(此高盐溶液成分为 0. 04mmol的盐酸胍、0. 0025mL的异丙醇，0. 0075mL的灭菌水，pH为5)并混合均勻。3.向步骤2最终所得的溶液中加入浓度为0. 6mg/mL的siRNA水溶液(溶剂为去离子水)0.01mL，并再次混合均勻，在此实施例中，乙醇高盐溶液siRNA水溶液三者之间的体积比3 1 1，将混合物静置于25°C烘箱中4h，通过IOOOOrpm离心将吸附siRNA 的M-MSNs从溶液中分离，此时M-MSNs对siRNA的单位装载量为8. 8mg/g(图2所示)。4.将步骤3中最终所得的颗粒用0. 06mL纯乙醇洗涤一次，再加入0. 06mL纯乙醇， 并利用IOOw超声振荡使颗粒均勻分散。5.向步骤4最终所得溶液中加入含聚乙烯亚胺的纯乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亚胺在纯乙醇溶液中的浓度为1. 5mg/mL)，IOOw超声振荡条件下使混合物反应20分钟。6.通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，并加入到0. 12mL去离子水中，在IOOw超声振荡条件下反应10分钟除去颗粒表面游离的聚乙烯亚胺。7.最后通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，再用0. ImL灭菌水溶解颗粒， 配置成2mg/mL的溶液保存，此时0. 2mg颗粒上的聚乙烯亚胺(PEI)的包覆量约为0. Olmg (即聚乙烯亚胺与颗粒的质量比为5% )，在生理环境条件下，siRNA将无法从颗粒中释放出来(如图3所示)。实例2 1.保持实施例1中步骤1 3的其他条件不变，改变乙醇高盐溶液siRNA水溶液(溶剂为双蒸水)三者之间的体积比为2 1 1或4 1 1。2.将上述最终所得的颗粒从吸附溶液中分离后，得到M-MSNs对siRNA的单位装载量分别是配比为2 1 1时装载量为5.3mg/g，配比为4 1 1时装载量为14. 5mg/ g (图2所示)。3.将分离后所得的颗粒用0. 06mL纯乙醇洗涤一次，再加入0. 06mL纯乙醇，并利用 IOOw超声振荡使颗粒均勻分散。4.向步骤3最终所得溶液中加入含聚乙烯亚胺的纯乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亚胺在纯乙醇溶液中的浓度为1. 5mg/mL)，IOOw超声振荡条件下使混合物反应20分钟。5.通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，并加入到0. 12mL去离子水中，在 IOOw超声振荡条件下反应10分钟，通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，再将其加入到 0. ImL灭菌水中，配置成2mg/mL的溶液保存，此时0. 2mg颗粒上的PEI的包覆量为0. Olmg (即聚乙烯亚胺与颗粒的质量比为5% )，在生理环境条件下，siRNA将无法从颗粒中释放出来(如图3所示)。实例3 1.先将0. 2mg M-MSNs加入到2mL离心管中，再向其中加入0. 04mL纯乙醇，IOOw 条件下超声振荡30s后使颗粒在溶液中均勻分散。2.向步骤1最终所得的溶液中加入0. OlmL高盐溶液(此高盐溶液成分为 0. 04mmol的盐酸胍、0. 0025mL的异丙醇，0. 0075mL的灭菌水，pH为5)并混合均勻。3.向步骤2最终所得的溶液中加入浓度为0. 5mg/mL或者2. 5mg/mL的siRNA水溶液(溶剂为灭菌水)0. OlmL并使溶液混合均勻，在此实施例中，乙醇高盐溶液siRNA水溶液三者之间的体积比为4 1 1，将混合物静置于25°C烘箱中4h，通过IOOOOrpm离心将吸附siRNA的M-MSNs从溶液中分离，此时M-MSNs对siRNA的单位装载量为加入浓度为 0. 5mg/mL的siRNA水溶液时单位装载量为3. 2mg/g，加入浓度为2. 5mg/mL的siRNA水溶液时单位装载量为27. 5m/g。4.将步骤3最终所得的颗粒用0. 06mL纯乙醇洗涤一次，再加入0. 06mL纯乙醇，并利用IOOw超声振荡使颗粒均勻分散。5.向步骤4最终所得溶液中加入含聚乙烯亚胺的纯乙醇溶液0. 06mL(所述聚乙烯亚胺在纯乙醇溶液中的浓度为1. 5mg/mL)，IOOw超声振荡条件下使混合物反应20分钟。6.通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，并加入到0. 12mL去离子水中，在 IOOw超声振荡条件下反应10分钟。7.最后再次通过IOOOOrpm离心将颗粒从溶液中分离，再将其加入到0. ImL灭菌水中，配置成2mg/mL的溶液保存，此时0. 2mg颗粒上的PEI的包覆量约为0. Olmg (即聚乙烯亚胺与颗粒的质量比为5% )，在生理环境条件下，siRNA将无法从颗粒中释放出来(如图3 所示)。
权利要求
1.一种利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载SiRNA的方法，其特征在于向含有介孔二氧化硅纳米颗粒的弱极性溶剂中分别加入高盐溶液与siRNA的水溶液，实现介孔二氧化硅纳米颗粒对siRNA的吸附；再通过正电性高分子包覆颗粒，阻止siRNA在生理溶液环境中的释放，由此实现介孔二氧化硅纳米颗粒对siRNA的装载。
2.根据权利要求1所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于 所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为30 1000纳米，颗粒的介孔孔径为2 10纳米。
3.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅纳米颗粒为单一的介孔二氧化硅成分或内核为无机非金属氧化物成分或金属成分而外壳为介孔二氧化硅成分具有核壳结构的颗粒材料，其中所述的无机非金属氧化物成分包括四氧化三铁、氧化锰和氧化锌中的一种或多种，所述的金属成分包括金、银、铜和镍中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于所述的弱极性溶剂为纯的有机溶剂，包括甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于所述高盐溶液包括以下组分盐酸胍、异硫氰酸胍和高氯酸钠中的一种或其混合物，其最终浓度为1 6摩尔每升；甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或其混合物，其最终溶液体积分数为10 50% ；去离子水、双蒸水和灭菌水中的一种，其最终溶液体积分数为 50% 90%。
6.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于siRNA需要先在去离子水、双蒸水或灭菌水中溶解成为溶液，其溶液浓度为0. 25 2. 5mg/mL。
7.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于所述介孔二氧化硅材料对siRNA的吸附，其条件为温度范围为0 40°C ；持续时间为Ih 24h ；混合溶液的各组分，包括弱极性溶液、高盐溶液、siRNA溶液的体积分数可在如下范围内2 8 0.5 1.5 1变化。
8.根据权利要求1或2所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于所述的用正电性高分子材料包覆，阻止siRNA在生理溶液环境中的释放，其中正电性高分子材料包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖和超支化聚乙烯氨胺中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于 所述的正电性高分子的分子量范围为SOODa 50kDa。
10.根据权利要求8所述的利用介孔二氧化硅纳米颗粒装载siRNA的方法，其特征在于正电性高分子包覆后的颗粒需要重新分散到去离子水中，并在超声下处理，用于除去颗粒表面游离的正电性高分子，减轻颗粒的团聚。
全文摘要
本发明公开了一种利用介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道装载siRNA分子的方法，所述方法通过将siRNA诱导进入介孔二氧化硅纳米颗粒的孔道，不仅实现siRNA的装载还能调节siRNA在颗粒中的装载量；此方法还具有在生理环境条件下siRNA分子不会从孔道中脱离，装载后的纳米颗粒表面可进一步修饰的特点，具有很好的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102327622SQ20111026619
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者古宏晨, 李旭 申请人:上海交通大学