专利名称：Cyclin D/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽以及作为抗肿瘤药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤多肽，尤其是涉及一种Cyclin D/⑶K4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，本发明还涉及该嵌合多肽作为抗肿瘤药物的用途。
背景技术：
肿瘤的发生，实质上是一种细胞周期调控上的失衡，致使细胞呈现出失控样生长， 这个过程产生的生长因子、激素、各种蛋白以及遗传物质DNA的代谢，都是通过细胞周期来实现和调控的。细胞周期调控有关的基因在肿瘤细胞对药物的敏感性方面起着决定性的作用。细胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(CDK)和周期蛋白依赖性激酶抑制物 (CKI)通过正负调控控制着整个细胞周期的正常运转。cyclin和⑶K过表达和活性异常增强，CKI表达缺失和检测点异常都可能导致细胞周期紊乱而发生癌变。cyclin D是G1/S期转换的重要正性调控因子，⑶K4，即细胞周期素D依赖性激酶 4，是细胞周期Gl期重要的调控分子。⑶K4蛋白能够特异性地与cyclin D结合形成复合物。cyclin D/⑶K4复合物可以使Rb蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化。已经证实 cyclinDl是一种原癌基因，其基因结构和功能异常与多种肿瘤(如乳腺癌、食管癌、宫颈癌、 肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等)的发生发展密切相关。cyclin D2在胃癌、结直肠癌、骨肉癌、慢性B细胞淋巴细胞白血病等肿瘤中发现有异常表达。cyclin D3几乎在所有增生细胞中都有表达，并且在3种D型cyclin蛋白是表达最广泛的一种。在胃癌、膀胱尿路上皮细胞癌、 非霍奇金淋巴瘤等肿瘤中发现有高表达。近来，蛋白一蛋白相互作用的特异性使得针对cyclin/⑶K蛋白复合物结合区域的多肽片段成为新的高度选择性药物的来源。有关cyclin/CDK晶体结构的研究也很多，可以通过对晶体结构的研究来判定结合部位，研究者们开创了一种新的设计CDK抑制剂的方法，即设计出抑制复合物相互结合的抗肿瘤活性肽。但是许多肿瘤靶向的配基如多肽、抗体虽能靶向肿瘤组织或细胞，减少毒副作用，但却缺乏穿透细胞膜的能力。目前介导生物大/ 小分子穿透细胞的方法主要是利用细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)作为载体。经典的穿模肽HIV-Tat来源的PTD4的穿膜效率比HIV-Tat要高出许多，且多肽序列容易合成。PTD4与目的肽中间以Gly连接得到嵌合多肽，Gly连接两条多肽即可保持两条肽段的柔性，又不改变两条肽段原有的二级结构。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CyclinD/⑶K4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽， 本发明还提供该多肽作为抗肿瘤药物的用途。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的Cyclin D/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/ ⑶K4复合物的多肽与载体穿模肽PTD4连接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。所述cyclin Dl来源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-Le U-Val-Asn-Lys0所述cyclin D3来源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Va I-Leu-Val-Leu-Gly-Lys。所述CDK4来源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-A rg-Arg-Leu-Glu—Ala—Phe。本发明的嵌合多肽作为抗肿瘤药物的用途。本发明的优点在于首次利用cyclin Dl/⑶K4、cyclin D3/⑶K4晶体结构设计三条具有抗肿瘤活性的多肽一PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-⑶Κ4 α C活性肽，将PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-⑶Κ4 α C活性肽通过柔性连接子Gly 与穿模肽PTD4连接起来，固相合成目的肽，使得目标肽能够进入细胞与目标蛋白复合物结合，有效抑制了肿瘤细胞的生长。为基于Cyclin D/CDK4复合物结合特性的多肽抑制剂作为一种新型抗肿瘤药物提供新的思路。
图1是PTD4肽质谱鉴定图。
图2是Dl肽质谱鉴定图。
图3是PTD4- Dl肽质谱鉴定图。
图4是D3肽质谱鉴定图。
图5是PTD4- D3肽质谱鉴定图。
图6是⑶K4肽质谱鉴定图。
图7是PTD4- CDK4肽质谱鉴定图。
图8是本发明肽对EC-9706食管癌细胞的杀伤率。
图9是本发明肽对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤率。
图10是本发明肽对H22鼠源肝癌细胞的杀伤率。
图11是H22小鼠肿瘤体积的变化图。
图12是H22小鼠肿瘤瘤重的变化图。
图13是本发明多肽药物对H22昆明小鼠移植瘤的抑瘤率。
具体实施例方式本发明所述的Cyclin D/⑶Κ4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/⑶Κ4复合物的多肽与载体穿模肽PTD4连接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。所述cyclin Dl来源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-LeU-Val-Asn-Lys0所述cyclin D3来源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_A Ia-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Va I-Leu-Val-Leu-Gly-Lys0所述CDK4来源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-A rg-Arg-Leu-Glu—Ala-Phe。本发明所涉及的实验方法和结果如下
1、本发明所述的PTD4-D1 α 5活性肽、PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽采用 Fomc固相有机合成法进行合成。首先通过树脂与目的多肽的第一位带保护基的氨基酸在一定条件下进行缩合，随后脱掉保护基，加入第二个氨基酸进行缩合。重复以上步骤，直到加入最后一个氨基酸，脱掉其保护基后，利用切割试剂把多肽从树脂上切下得到粗肽。经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，其纯度大于95%，得到精肽。ESI-MS质谱分析并证实其分子量符合理论值。本发明cyclin D/CDK4相关多肽序列及分子量见表1，本发明相关多肽的质谱鉴定结果见图1-图7。
权利要求
1.一种Cyclin D/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述嵌合多肽是基于Cyclin D/⑶K4复合物的多肽与载体穿模肽PTD4连接而成的PTD4-D1 α 5活性肽、 PTD4-D3 α 5活性肽和PTD4-CDK4 α C活性肽。
2.根据权利要求1所述的CyclinD/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述cyclin Dl来源的PTD4-D1 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Leu-Leu-Gln-Met-Glu-Leu-Leu-Leu-V al—Asn—Lys。
3.根据权利要求1所述的CyclinD/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述cyclin D3来源的PTD4-D3 α 5活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala_Ala-Ala-Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Ala-Val-Ser-Pro-Arg-Gln-Leu-Arg-Asp-Trp-Glu-Val-L eu-Val-Leu-Gly-Lys。
4.根据权利要求1所述的CyclinD/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，其特征在于所述CDK4来源的PTD4-CDK4 α C活性肽的氨基酸序列为Tyr-Ala-Arg-Ala-Ala_Ala -Arg-Gln-Ala-Arg-Ala-Gly-Leu-Pro-Ile-Ser-Thr-Val-Arg-Glu-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu—Ala-Phe。
5.根据权利要求1所述的嵌合多肽作为抗肿瘤药物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种Cyclin D/CDK4来源的具有抗肿瘤活性的嵌合多肽，是基于Cyclin D/CDK4复合物的多肽与载体穿模肽PTD4连接而成的PTD4-D1α5活性肽、PTD4-D3α5活性肽和PTD4-CDK4αC活性肽。cyclin D1来源肽PTD4-D1α5序列为YARAAARQARAGSIRPEELLQMELLLVNK；cyclin D3来源肽PTD4-D3α5序列为YARAAARQARAGAVSPRQLRDWEVLVLGK；CDK4来源肽PTD4-CDK4αC序列为YARAAARQARAGLPISTVREVALLRRLEAF。本发明是根据cyclin D1/CDK4、cyclin D3/CDK4的一级结构和晶体结构设计得到，通过MTT细胞增殖实验和体内荷瘤实验验证这些多肽的抗肿瘤活性。基于cyclin D/CDK复合物的多肽抑制剂将为新型抗肿瘤药物的研发提供新的思路。
文档编号A61K38/10GK102321181SQ201110277779
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者王海丽, 祁元明, 陈艳平, 高艳锋 申请人:郑州大学