专利名称：鬼针草中的活性成分鬼针聚炔苷在制备防治急性肝损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鬼针聚炔苷的用途，尤其是制备防治急性肝损伤药物中的应用。
背景技术：
鬼针草又名金盏银盘、鬼钗草、盲肠草、引线包、针包草、一把针、豆渣菜、脱力草， 分布于东北、华北、华东、西南及陕西、甘肃等地区，生长于路边、荒地、山坡及田间。该药始载于《本草拾遗》“鬼钗草，味苦平，无毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵绞汁服。生地畔，有桠，方茎，子作钗脚，着人如衣针，北方呼之为鬼针”。《中药大辞典》记载鬼针草“苦、平、无毒。功能清热解毒、散瘀消肿。主治疟疾、腹泻、痢疾、肝炎、急性肾炎、胃痛、 噎膈、肠痈、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤”。《泉洲本草》和《本草推除》对鬼针草的功效均记载。鬼针草所含化学成分主要为黄酮类、烯炔类、香豆素类、有机酸及其酯类、三萜、甾醇、挥发油等，其中黄酮类化合物和多炔是鬼针草中的主要成分，其次还含有氨基酸和微
量元素等。从鬼针草分离的黄酮类化合物主要包括查耳酮类、噢挵类、黄酮醇类、二氢黄酮类和黄酮类等，其中以查耳酮类和噢挵类为特征性成分。目前已分离出的黄酮分别为金丝桃苷(hyptroside)、奥卡宁(okanin)、异奥卡宁7_ 0-β-D-葡萄糖苷、海生菊苷 (maritimetin) ,6-0-(6 ‘乙酰基- β -D-吡喃葡萄糖基)_6，7，3，4-四羟基噢挵、槲皮素3-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3- 0-α- L鼠李糖苷。已分离、鉴定的鬼针草属植物中活性成分以查耳酮类化合物奥卡宁类最多，有25种；噢挵类化合物8种；黄酮醇类化合物 8种；二氢黄酮类5种；黄酮类4种。从鬼针草分离的多炔主要有I9种，包括4个微量的聚乙炔类化合物以及具有抗炎作用的鬼针聚炔苷2-β-D -吡喃葡萄糖基-1，13-二羟基-3 (反)，11 (反) -十三二烯-5，7，9-三炔。同时从鬼针草分离的还有有香豆素(如七叶苷等)、生物碱、蒽醌苷、糖、胡萝卜素、多元酚丁香苷、维生素、鞣质、挥发油、苦味质、胆碱。另有16种氨基酸天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、颉氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸等，其中8种为人体必需氨基酸；还含有9种人体必需无机元素，其中4种常量元素中以钙含量最高，5种微量元素中铁含量最高，其次是铜、锌、锂、钨。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供鬼针聚炔苷的用途，是制备防治急性肝损伤药物中的应用。本发明是通过以下技术方案来实现的。肝损伤是由各种肝脏疾病所产生的病变结果。临床上造成急性肝损伤的原因主要
3有病毒感染、服用药物不当、食物添加剂、乙醇摄入过量、误服有毒食物、放射线损伤等。近年来，随着临床用药种类的迅速增加及患者自行服药或随意加大药物剂量的概率增加，药物性肝损伤的发生率亦相应增加。全国多中心急性药物性肝损伤住院病历调查分析发现， 我国急性药物性肝损伤发病呈逐年增加趋势，急性药物性肝损伤发病率占黄疸住院患者的 2^-5%,占爆发性肝功能衰竭患者的15% 30%，占非病毒性慢性肝炎的20% 50%。目前对肝损伤的治疗方法很多，且均有一定的疗效，但也存在着明显的不足。肝移植疗法受患者年龄、人类白细胞抗原相同供者来源不足、感染等并发症多、移植物抗宿主病治疗难度大、病死率高等限制。西医对肝损伤的药物治疗疗效并不十分肯定，同时又具有较大的毒副作用。还有一些疗法虽然对肝损伤有效，但因其价格昂贵，使患者经济上难以承受，因而极不利于临床推广。为此，研究价格便宜、疗效好的中药，发挥中医药治疗肝损伤的优势，日渐成为研究热点。迄今报道，对实验性肝损伤有效的中药单味药和有效组分有茵陈、核桃仁、鹅不食草、白背叶根、决明子、枸杞、丹参、五味子、绞股蓝、三七、半枝莲、黄芩、三棱、莪术、黄芪提取物、金针菇提取物、火棘果实提取物、氧化苦参碱、沙苑子黄酮、白藜芦醇苷、苯丙素苷、葛根紊、胡卢巴多糖、红毛五加多糖、玉米须多糖、玉郎伞多糖、知母总黄酮、胡黄连总苷、芒果苷、鲨肝肽等。鬼针草在中医学上具有清热解毒、祛风除湿、活血消肿的功效，我们从鬼针草中提取了活性成分鬼针聚炔苷，研究其在治疗各种原因引起的急性肝损伤中的作用以及作用机制。首先，我们通过以下方法在鬼针草中提取鬼针聚炔苷，我们选取的实验原料来源于菊科鬼针草属植物金盏银盘Bidens biternata (Lour.) Merr. et Sheff干燥地上的部分。粗品提取
1)取金盏银盘30kg加70%乙醇10倍量回流提取2次；
2)合并提取液，回收乙醇至无醇味，0.1 μ m陶瓷膜过滤；
3)过滤后的滤液通过大孔吸附树脂HPD-100，然后先以1.5倍柱体积的水洗去杂质，再用3倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，收集乙醇洗脱液回收乙醇至无醇味；
4)干燥，获得粗品，大约45g; 精制
5)将粗品加约20倍量乙醇超声提取30min，提取液滤过回收乙醇；
6)进行真空干燥或喷雾干燥，获得提纯物，大约27g；
7)将27g提纯物用200ml甲醇使用热超声溶解；
8)用大孔树脂吸附，然后用分别10%、35%、45%以及70%的乙醇进行梯度洗脱，初步分为 4个部分，分别得到大约2. 5g、7. 0g、6. 0g、5. 5g的粗分物；
9)将4个部分分别柱层析，依次用石油醚、(石油醚乙酸乙酯)、(乙酸乙酯甲醇)、氯仿、(氯仿甲醇)梯度洗脱；
10)再依次用100-200目、200-300目，300-400目硅胶分离；
11)通过葡聚糖凝胶分离；
12)最后经过制备液相制备得到鬼针聚炔苷，即2-β -D -吡喃葡萄糖基-1，13- 二羟基-3 (反)，11 (反)-十三二烯_5，7，9-三炔。
我们将制备获得的鬼针聚炔苷进行动物实验。动物实验的对象选取为经CCl4诱导急性肝损伤的实验小鼠。实验使用了包括
a实验小鼠选用昆明种小鼠60只，6-8周，体重20士2g，$，普通级，由安徽医科大学实验动物中心提供；
b试剂选用丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)试剂盒 (南京建成生物工程研究所提供，批号20110521)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)试剂盒(厂商，同上，批号20110524)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(厂商，同上，批号20110521)；浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号ZLI-9032)、兔抗人NF-KB(p65)多抗(厂商，同上，产品编号SC_109)，免疫组织化试剂盒(S-P)试剂盒(厂商，同上，产品编号SP-9000)；
c仪器选用GL20A全自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂)；MDF-382E三洋超低温冰箱(日本三洋)；FSH-2型可调高速勻浆器(江苏省金坛市容体仪器制造有限公司)；MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔公司)；BI2000生物医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)； BX50型倒置显微镜(日本Olympus)，Nikon 80i荧光生物显微镜(新飞达光学仪器公司)。实验方法为将60只小鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、鬼针聚炔苷BPC 给药组(12. 5、25、50 mg · kg—1) 3组和阳性对照药即水飞蓟素(200 mg · kg—1)组，其中BPC 和水飞蓟素均以0. 3%羧甲基纤维素钠生理盐水溶解。除正常组和模型组灌胃给予0. 3%羧甲基纤维素钠生理盐水外，其余各组分别按0.1 ml - (10 g)—1体积分别灌胃给予不同剂量BPC和水飞蓟素，每天1次，连续6d。末次给药后2h，除正常组外，其余各组均腹腔注射 0. 2% CCl4橄榄油溶液IOmL · kg—1。禁食16h后自小鼠后眼眶静脉丛采血置1. 5mL离心管中，3000r · miiT1离心lOmin，制备血清，做相关指标检测。拉颈处死动物，立即摘取肝脏称重，计算相对肝重量。相同部位取肝组织0. 5g，以预冷的0. 9%生理盐水制成10%肝组织勻浆，2500r· HiirT1离心lOmin，上清液置4°C保存备用。另取相同部位肝脏小叶，切取组织块5X5X2mm，置于10%福尔马林中固定24h后进行病理学检查。我们制定的指标检测如下
肝脏指数分别剖取肝脏，称重，按肝脏指数=[肝脏重量(g)/体重(g)]X100计算肝脏指数；
血清生化指标血清中ALT、AST的测定参照改良赖氏法-，按试剂盒说明书的具体步骤进行，于酶标仪上测定血清中的ALT、AST ；
肝组织生化指标肝组织中的S0D、GSH_Px、MDA、N0的活性和含量按试剂盒说明书的具体步骤进行测定，其中MDA的含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；
组织病理学和免疫组化学观察肝组织于10%福尔马林固定液中固定Mh，用水冲洗后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，进行石蜡包埋处理后切成4Mm厚的薄片，HE染色观察病理切片；采用免疫组化S-P法显色系统，按照试剂盒说明依次切片脱蜡和水化、抗原修复、 滴加一抗、37°C孵育、DAB显色，最后二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察蛋白表达情况；
统计学分析采用SPSS13. 0统计学软件进行数据分析，多样本的均数比较采用单因素方差分析，组间比较用One-Way ANOVA检验。
我们得到的实验结果如下
(1)表1所示，鬼针聚炔苷BPC (12.5,25,50 mg .kg—1) ig给药能够不同程度的降低肝指数，抑制ALT、AST活性，与模型组比较有显著性差异。表1鬼针聚炔苷对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝指数、血清ALT和AST的影响( ，n=10)
权利要求
1.鬼针草中的活性成分鬼针聚炔苷在制备防治急性肝损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了鬼针草中的活性成分鬼针聚炔苷的新用途，具体是在制备防治急性肝损伤药物中的应用。本发明通过动物实验明确了鬼针聚炔苷能够对CCl4诱导急性肝损伤的实验小鼠起到保护作用，鬼针聚炔苷能显著降低血清中ALT、AST的水平、肝组织MDA含量，显著增强肝组织SOD、GSH-Px活性，明显降低肝组织中NO含量，并可抑制肝细胞NF-κB的表达，因此鬼针聚炔苷在制备预防治疗急性肝损伤的药物中具有较理想的前景。
文档编号A61P1/16GK102335183SQ20111029496
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者刘建军, 吴繁荣, 葛金荣, 许慧, 陈飞虎 申请人:安徽医科大学