专利名称：一种脱细胞羊膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种脱细胞羊膜的制备方法，尤其是一种医疗器械敷料脱细胞羊膜的制备方法。
背景技术：
羊膜为胎盘胎膜的一部分，表面光滑透明，无血管、淋巴和神经系统，羊膜可细分为上皮细胞层、基底膜、透明层和胶原纤维层。羊膜基底膜较厚、韧性强，不但具有支架作用，而且含有层黏连素、纤维黏连素、IV型胶原及大量硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其它一些蛋白多糖大分子和神经营养因子。羊膜组织相容性好、易于取材，能抗粘连、抗感染并保护创面，已经广泛应用于眼科、烧伤、腹腔和盆腔手术中。目前国内临床应用的羊膜类材料主要有新鲜羊膜、-80°C深冷保存羊膜、冻干羊膜。新鲜羊膜保留了羊膜上皮细胞，由于抗原成分复杂，因此免疫原性高于脱细胞羊膜，新鲜羊膜中的各种活性成份是否会对接触局部组织有影响还有待于进一步研究，而且新鲜羊膜保存期短、运输不便无法满足临床需求。目前脱细胞羊膜的制备方法主要有酶消化法、细胞刮除法、超生处理法、低渗裂解法、化学去垢剂法等。细胞刮除法和超生法等机械脱细胞方法存在的问题是容易破坏羊膜结构的完整性或有细胞残留。酶消化法脱细胞条件强烈，必须严格控制控制脱细胞条件和时间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种简便有效的脱细胞羊膜制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种脱细胞羊膜的制备方法， 将废弃的胎盘以4°C预冷的磷酸盐缓冲液清洗干净，以钝性分离将羊膜从胎盘上剥离下来， 剪成规则形状，保持上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上，将羊膜片浸泡处理于低渗TBS浸泡液，4 V -8 V ；20-22小时后，将羊膜片转移至TBS-SDS溶液中，15°C -22°C旋转；24小时后，羊膜片经PH 7.6TBS溶液洗涤3次，转移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解处理3-10 小时，pH 7. 6TBS溶液洗涤3次，脱细胞-核酸降解处理后的羊膜片经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后常温保存。所述低渗TBS浸泡液含IOmM Tris, pH8. 0,0. 1% w/v EDTA和蛋白酶抑制剂 Aprotinin 10KIU/mL。所述TBS-SDS 溶液含 IOmM Tris,pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制剂 aprotinin 10KIU/mL。所述核酸降解溶液含50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化镁，50mg/mL BSA, ρΗ7· 5。本发明的有益效果是本发明的脱细胞羊膜制备方法，脱细胞条件温和，去除细胞彻底无核酸残留，保留了羊膜的结构的完整与蛋白成分，使其成为不会引起人体免疫应答的天然组织材料。处理后的羊膜洁白、透明、有张力、坚韧可缝合，经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后，脱细胞羊膜的保存期延长，可大规模批量生产以满足临床应用。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明加以详细说明一种脱细胞羊膜的制备方法，将废弃的胎盘以4°C预冷的磷酸盐缓冲液清洗干净，以钝性分离将羊膜从胎盘上剥离下来，剪成规则形状，保持上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上，将羊膜片浸泡处理于低渗TBS浸泡液，4°C -8°C ；20-22小时后，将羊膜片转移至 TBS-SDS溶液中，15°C _22°C旋转小时后，羊膜片经pH 7. 6TBS溶液洗涤3次，转移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解处理3-10小时，pH 7. 6TBS溶液洗涤3次，脱细胞-核酸降解处理后的羊膜片经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后常温保存。所述低渗TBS浸泡液含IOmM Tris, pH8. 0,0. 1 % w/v EDTA和蛋白酶抑制剂 Aprotinin 10KIU/mL。所述TBS-SDS 溶液含 IOmM Tris,pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制剂 aprotinin 10KIU/mL。所述核酸降解溶液含50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化镁，50mg/mL BSA, ρΗ7· 5。下面对本发明进行详细说明产妇产前经血清学筛查，以排除乙肝、丙肝、梅毒、HIV病原体感染。无菌采集健康刨宫产产妇，发育良好的胎盘组织，以4°C预冷的磷酸盐缓冲液(含1000U/ml盘尼西林， 20mg/ml链霉素，2. 5mg/ml两性霉素)将胎盘组织清洗干净，以无菌手术器械钝性分离将羊膜从胎盘上剥离下来，剥下来的羊膜剪成5x5CM大小，保持上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制备成“羊膜片”，注意排空气泡、使羊膜保持平整和完整。将羊膜片浸泡处理于低渗TBS 浸泡液(含 IOmM Tris ；pH8. 0,0. 1% w/v EDTA 和蛋白酶抑制剂 AprotininlOKIU/mL)，4°C ； 16 小时，将羊膜片转移至 TBS-SDS 溶液中(含 IOmM Tris ；pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/ ν EDTA，蛋白酶抑制剂aprotinin lOKIU/mL)，25°C旋转；24小时，羊膜片经pH 7.6TBS溶液洗涤 3 次，转移至核酸降解溶液(含 50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl, IOmM 氯化镁，50mg/mLBSA，pH7. 5)中37°C核酸降解处理3小时，pH 7. 6TBS溶液洗涤3次。脱细胞-核酸降解处理后的羊膜片经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后可常温长期保存。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，将废弃的胎盘以4°c预冷的磷酸盐缓冲液清洗干净，以钝性分离将羊膜从胎盘上剥离下来，剪成规则形状，保持上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上，将羊膜片浸泡处理于低渗TBS浸泡液，4°C-8°C ；20-22小时后，将羊膜片转移至TBS-SDS溶液中，15°C _22°C旋转小时后，羊膜片经pH 7. 6TBS溶液洗涤3次， 转移至核酸降解溶液中，25-37°C核酸降解处理3-10小时，pH 7. 6TBS溶液洗涤3次，脱细胞-核酸降解处理后的羊膜片经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后常温保存。
2.根据权利要求1所述的脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，所述低渗TBS浸泡液含 IOmM Tris, pH8. 0,0. 1% w/v EDTA 和蛋白酶抑制剂 AprotininlOKIU/mL。
3.根据权利要求1所述的脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，所述TBS-SDS溶液含 IOmM Tris, pH7. 6,0. 03% w/v SDS,0. 1% w/v EDTA，蛋白酶抑制剂 aprotinin 10KIU/mL。
4.根据权利要求1所述的脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，所述核酸降解溶液含 50U/mL DNAase, lU/mL RNAase,50mM Tris-HCl，IOmM 氯化镁，50mg/mL BSA，ρΗ7· 5。
全文摘要
本发明公开了一种脱细胞羊膜的制备方法，将胎盘以4℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗干净，以钝性分离将羊膜从胎盘上剥离下来，保持上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上，将羊膜片浸泡处理于低渗TBS浸泡液，4℃；16小时，将羊膜片转移至TBS-SDS溶液中，25℃旋转；24小时，pH 7.6TBS溶液洗涤3次，将羊膜片转移至核酸降解溶液中，37℃核酸降解处理3小时，pH 7.6TBS溶液洗涤3次。脱细胞-核酸降解处理后的羊膜片经过冷冻干燥、包装和辐照灭菌后可常温长期保存。
文档编号A61L15/40GK102327640SQ20111030017
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者张建平, 王嵩, 石釧, 胡艳华, 韩俊领 申请人:协和干细胞基因工程有限公司