专利名称：公猪去异味重组噬菌体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用免疫学方法去除公猪内源性异味物质、改善肉质的公猪去异味重组噬菌体疫苗，属于分子生物技术领域。
背景技术：
GnRH由丘脑下部的&iRH神经元合成，以颗粒或囊泡的形式贮存于细胞内，已从脊椎动物和原索动物的神经组织中分离出13种不同的&iRH，所有哺乳动物包括人类的&iRH 结构是一样的，其氨基酸序列为PTO0Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2， 即焦谷氨酸-组氨酸-色氨酸-丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘酰肽。&iRH疫苗主动免疫动物后，可诱导动物机体产生特异性的抗&iRH的抗体，该抗体与动物自身分泌的内源性的&iRH结合并使其失去生物活性，从而导致下丘脑-垂体-性腺轴功能的破坏，抑制LH和FSH的释放，进而导致性腺内分泌变化。对雄性动物，导致类固醇激素分泌减少，睾丸及性腺萎缩，精子生成受阻；对雌性动物，则导致乏情期延长或不发情，卵泡发育、排卵及黄体形成受阻，卵巢、子宫萎缩。最终使动物大部分甚至完全丧失生殖能力。在大多数家畜中，没经过去势的雄性动物要比经过去势的生长更快、效率更高，并且酮体品质更为优良。Wood等人发现未经去势处理的公猪比去势公猪生长更快，饲料报酬更高。Kuhlers等人报道，未经去势的公猪与同等体重经过去势的相比，眼肌面积明显增大。 Robertson等用&iRH免疫公牛，发现免疫牛睾丸萎缩，性欲降低“去势”效果持续了 6个
月，并且其脂肪减少了 32 %，第10肋骨处眼肌面积增加了 50 %，而同时料重比降低了 12%。理论上生产未去势的公猪能带来明显的经济效益，但在实际生产过程中仍有许多不利因素需要克服。未去势公猪在性成熟后具有明显的攻击性，对圈养设施要求增高，需要分性别单独饲养，对饲养员的危险也明显增高。性成熟公猪爬跨频繁，猪群撕咬打斗增多， 不但提高了受伤的几率还降低饲料报酬，给生产过程带来极大的不便。生产未去势公猪的另一个问题是这种猪肉在烹饪过程中发出令人不愉悦的味道，俗称“猪臊味”。有研究表明， 出售未经去势的公猪肉有5%-35%的酮体具有另消费者不适的异味。公猪的异味在发情期首次出现，在公猪达到70kg体重或4个月年龄时逐渐升高，脂肪中异味物质含量较高的大多是体重大于95kg或生长期大于5个月的未去势公猪，但在去势后会逐步消失，其性行为也在去势后逐步消失转而变得温顺。我国生猪养殖过程多采用手术去势的方法来处理猪肉中的异味，这种方法简便彻底但也带来很多负面作用。猪的睾丸是高度管状且充满神经的， 只能对未发育的幼年猪进行手术去势，对于性成熟的大猪则不适用。同时手术去势不仅降低猪的生产率和猪肉品质，还具有诸多风险伤口出血、感染，严重的疝气，使动物发育不良或死亡。近年来已经有多种方法被用来试图克服手术去势所带来的弊端，例如，体内植入激素法、化学去势法。激素处理需要反复多的注射，化学法去势能绝育但影响猪的生长性能。因此，需要一种既能抑制猪肉中的异味物质又不影响猪的生长性能的方法。本发明涉及的免疫去势法能够很好的兼顾这二者的需要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种公猪去异味重组噬菌体疫
田ο本发明的公猪去异味重组噬菌体疫苗，以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的&iRH蛋白，所说的&iRH蛋白由三份拷贝的GnRH基因插入T7噬菌体PlOB基因下游表达获得。所述的三份拷贝的&1RH基因选自以下序列的核苷酸
1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；
2)具有SEQID NO :1所示序列经增加或减少拷贝数的核苷酸序列；
3)具有SEQID NO :1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。本发明的公猪去异味重组噬菌体疫苗的构建方法，包括下列步骤
A、构建重组噬菌体
(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5， 端有酶切位点EcoR I，3，端含有酶切位点Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；
(2)用限制性内切酶EcoRI、Hind III将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7 噬菌体多克隆位点的EcoR I和Hind III之间，构建重组噬菌体；
(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示3拷贝的&iRH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；
B、重组噬菌体的制备
甘油冻存的E. coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37°C过夜培养； 从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37°C、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37°C、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用 PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100转/分震荡灭活过夜；
C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗
1)疫苗油相的制备4mL司本80，2mL司本85，94mL10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混勻，121°C高压20分钟；疫苗水相的制备94mL滴度为2X 1013pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均勻；
2)按照水相油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗；
所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗的构建方法中，重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-lb。本发明具有如下技术效果(1)本发明利用噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂的特性，用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服&iRH肽激素自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体，抑制公猪睾丸的发育，控制猪肉中异味物质的生成。(2)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的重组噬菌体去异味疫苗便于大规模生产、成本低廉。(3))免疫学方法更为人道，从而替代传统的去势方法，满足现代规模化饲养管理的需要。
图1为重组T7噬菌体的基因鉴定。泳道1为DL2000 DNA Marker ；泳道2为T7噬菌体载体对照；泳道3为重组T7噬菌体。图2为重组噬菌体去异味疫苗免疫后的公猪&iRH抗体水平图。图3为重组噬菌体去异味疫苗免疫后的公猪睾酮水平图。图4为重组噬菌体去异味疫苗免疫后的公猪双睾大小图。图5-1为重组噬菌体去异味疫苗免疫后的公猪睾丸切片图。图5-2为未去势的公猪睾丸切片图。
具体实施例方式实施例中，
编码如SEQ ID NO 3所示基因，是GnRH主要抗原表位，为常规技术。限制性内切酶EcoR I、Hind III购自大连宝生物生物工程公司。T7噬菌体载体、T7包装蛋白、E. coli BL21购自Novagen公司。T7噬菌体的提取为常规技术。T7噬菌体滴度的测定为常规技术。实施例1 构建重组噬菌体
由商业公司合成一段DNA序列，该DNA序列已克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5，端有酶切位点EcoR I，3，端含有酶切位点Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示
用限制性内切酶EcoR I、Hind III将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoR I和Hind III之间，构建重组噬菌体。重组pUC-19载体双酶切体系
权利要求
1.公猪去异味重组噬菌体疫苗，其特征在于，以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7 噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的&iRH蛋白，所说的&iRH蛋白由三份拷贝的&iRH基因插入T7噬菌体PlOB基因下游表达获得。
2.根据权利要求1所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗，其特征在于，所述的三份拷贝的&iRH基因选自以下序列的核苷酸1)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列；2)具有SEQID NO :1所示序列经增加或减少拷贝数的核苷酸序列；3)具有SEQID NO :1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有 GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗，其特征在于，所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。
4.权利要求1-3中任意一种公猪去异味重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，包括下列步骤A、构建重组噬菌体(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5， 端有酶切位点EcoR I，3，端含有酶切位点Hind III，其DNA序列如SEQ ID NO 3所示；(2)用限制性内切酶EcoRI、Hind III将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7 噬菌体多克隆位点的EcoR I和Hind III之间，构建重组噬菌体；(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示3拷贝的&iRH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；B、重组噬菌体的制备甘油冻存的E. coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37°C过夜培养； 从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37°C、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至0D_=0. 8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37°C、100转/分震荡培养2_3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用 PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为 2 X 1013pfu/mL,并按照4%。的比例加入甲醛溶液，37°C、100转/分震荡灭活过夜；C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗。
5.根据权利要求1所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗，其特征在于，所述的重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-lb。
全文摘要
本发明提供了一种公猪去异味重组噬菌体疫苗，所说的疫苗以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的GnRH蛋白，所说的GnRH蛋白由三份拷贝的GnRH基因插入T7噬菌体P10B基因下游表达获得。本发明具有如下技术效果(1)用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服GnRH肽激素自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体，抑制公猪睾丸的发育。(2)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的重组噬菌体去异味疫苗便于大规模生产、成本低廉。(3)免疫学方法更为人道，从而替代传统的去势方法，满足现代规模化饲养管理的需要。
文档编号A61K39/12GK102335422SQ20111030596
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者侯继波, 徐海, 王义伟 申请人:江苏省农业科学院