专利名称：一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法
技术领域：
本发明涉及一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，属于生物制品领域。
背景技术：
伪狂犬病毒G^seudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，是一种单股双链DNA病毒，有囊膜，可引起多种家畜和野生动物出现以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要病症的急性传染病-伪狂犬病。猪是伪狂犬病毒原发感染宿主，感染后可引起仔猪大批发病、死亡，引起母猪繁殖功能障碍-流产或产木乃伊胎、死胎、弱胎。伪狂犬病在世界范围内分布广泛，对猪业健康发展的危害程度仅次于口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征。疫苗接种是有效防制伪狂犬疫病的重要手段，故伪狂犬疫苗接种也是我国各型猪场基本免疫程序的重要一环，我国巨大的生猪存栏量决定了伪狂犬疫苗市场容量之巨，现我国市面上已有数十家疫苗生产企业生产的伪狂犬疫苗，但是由于支原体对疫苗的污染，导致生产成本较高，且疫苗的安全性难以控制。支原体(Mycoplasma)又称霉形体，是介于细菌及病毒之间的一种原核生物，无细胞壁和固定形态，大小介于0. 2-0. 3 μ m之间，大部分可通过普通0. 22 μ m细菌滤器。支原体污染会干扰细胞正常新陈代谢，影响DNA和RNA的合成，从而引起病毒产量下降，影响产品品质；同时支原体注入动物机体内会造成动物免疫抑制甚至发病，我国颁布的《中华人民共和国兽药典》明文规定疫苗制品内不能含有支原体。伪狂犬疫苗生产的核心是伪狂犬种毒的制备，其在复苏、增殖及建立种子库的过程中面临受支原体污染的风险较大，而种毒是疫苗生产最初始的上游源头，一旦种毒发生支原体污染，将造成极其严重的后果。因此，除去疫苗种毒中的支原体是至关重要的，也是伪狂犬疫苗生产企业及科研人员极力解决的关键问题之一。除了通过合理清洁消毒、严格按规范操作降低支原体污染发生风险之外，目前已经报道的清除种毒支原体污染常见方法有很多种，如，过滤法、抗生素处理法、高温处理法、 接种动物法和接种动物法。但是，现有的方法均不能在保证伪狂犬病毒存活的情况下，彻底除掉支原体1.过滤法已有孔径小于0. 22 μ m的滤器可以滤去大多数病毒中的支原体，但是由于伪狂犬病毒粒子大小为0. 18 μ m左右，其与支原体大小很接近，目前通过过滤无法将二者有效分开；2.抗生素处理法支原体对某些抑制蛋白合成的抗生素敏感，如氯霉素、 庆大霉素、喹诺酮类及环丙沙星类，据报道这些药物能良好抑制或杀灭支原体，同时不影响病毒活性，但是这些抗生素对细胞有潜在毒性，同时其以抑制为主要的作用机理让人对其彻底杀灭支原体的效果担忧，该方法存在杀灭不彻底，停药后可能反复的风险，即使彻底杀灭整个用药周期至少需要14-21天的时间，另外，抗生素使用带来的耐药性问题是其另外一个难以预料的副作用；3.高温处理法加温至40-50°C维持一段时间，利用高温破坏支原体活性进而杀灭支原体，但是同处于一个体系中的病毒粒子的活性也会受到影响甚至失活，4.接种动物法此法是将受支原体污染的病毒液接种于实验动物如小鼠皮下或腹腔， 利用动物的免疫系统杀灭支原体，但是此法对动物卫生等级要求甚高，否则会有引入外源微生物的风险，至少需要SPF级，因而操作复杂、成本高、饲养管理难度大，很难保证杀灭彻底，周期较长。另一方面，伪狂犬疫苗种毒对猪是安全的，对小鼠或兔却具有致病性，即实验动物机体在彻底清除支原体前就会因伪狂犬发病死亡，难以达到去除支原体的目的；5.溶剂抽提法印彤等，“采用溶剂抽提法可完全去除病毒制品中的支原体”，1996年第19卷第 1期报道了利用乙醚和氯仿对污染支原体的5型腺病毒和RNA α病毒进行抽提可在保持病毒效价的前提下，完全除去其中支原体，但是伪狂犬病毒对乙醚和氯仿高度敏感，极易失活，发明人曾多次根据该文献报道的方法除去伪狂犬种毒中的支原体，结果发现该方法杀死支原体后，伪狂犬种毒本身也失活即病毒经此处理后死亡，无法重新增殖出病毒，不能再用于制备伪狂犬疫苗，不具有实际应用的价值。综上，人们一直以来寻找许多方法来去除伪狂犬病毒中的支原体，但是都未能达到理想的效果，要么难以彻底除去支原体，要么在彻底除去支原体的同时也会杀灭伪狂犬病毒。为了保证伪狂犬疫苗的品质，亟需寻找一种彻底除掉支原体，且能保证伪狂犬病毒活性的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的去除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法。本发明提供了一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，它包括如下步骤(1)取伪狂犬疫苗种毒；(2)抽提病毒基因组DNA ；(3)将抽提的DNA产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫
苗种毒。其中，所述步骤(1)中狂犬疫苗种毒的滴度PFU彡IX IO6个/ml。其中，所述步骤(3)中抽提的DNA产物先与载体混合，再转染细胞。其中，所述的载体为阳离子脂质体或者磷酸钙。其中，所述步骤⑶中抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为 5-6 μ g 5-20 μ 1。其中，所述步骤(3)抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为 5-6 μ g 10 μ 1。其中，所述步骤(3)的中细胞的密度为65% -85%。其中，所述密度为70%-75%。还提供了上述方法制备的伪狂犬疫苗种毒。最后还提供了前述的伪狂犬疫苗种毒在制备伪狂犬疫苗中的用途。本发明提供的方法可以彻底除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体，且能保持伪狂犬种毒活性，还不引入外源微生物污染，解决了人们一直渴望解决但始终未能取得成功的技术难题。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1培养法检测结果(非禽源支原体)。其中，A 猪鼻支原体作为阳性对照；B 人工模拟的被猪鼻支原体污染的病毒液；C 采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液； D 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图2培养法检测结果(禽源支原体)。其中，1 鸡滑液支原体作为阳性对照；2 人工模拟的被鸡滑液支原体污染的病毒液；3 采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液；4 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图3PCR法检测结果。其中，M =DNA分子量标准；1 非禽源支原体_猪鼻支原体阳性对照；2 人工模拟的被猪鼻支原体污染的病毒液；3 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；4 人工模拟的被鸡滑液支原体污染的病毒液；5 采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液(非禽源)；6 采用该法清除支原体重新获得的病毒液(禽源)；7 阴性对照(未污染支原体的病毒液)。图4本发明方法制备的伪狂犬种毒转染细胞的生长状态图。a 转染后第1天；b 转染后第3天；c 转染后第4天；d 转染后第5天；e 转染后第6天。图5培养法检测结果。其中，I 非禽源支原体-猪鼻支原体阳性对照；II 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；III 经本发明方法处理过的受支原体污染种毒；IV 阴性对照(未受支原体污染的病毒液)。图6PCR法检测结果。其中，M =DNA分子量标准；1 非禽源支原体_猪鼻支原体阳性对照；2 禽源支原体-鸡滑液支原体阳性对照；3 经本发明方法处理过的受支原体污染种毒；4 阴性对照(未受支原体污染的病毒液)。图7本发明方法处理的伪狂犬种毒转染细胞的生长状态图。其中，a为正常Vero 细胞；b为用本发明方法处理后的种毒转染Vero细胞后第6天。
具体实施例方式实验材料伪狂犬疫苗种毒毒液伪狂犬疫苗种毒SA215株，是《中国兽用生物制品使用指南》收载生产伪狂犬疫苗用种毒毒株，购自四)I丨农业大学。鸡滑液支原体、猪鼻支原体两株支原体阳性质控菌株，均为《中国兽药典》明文规定兽用生物制品质控使用的支原体阳性参照菌株，购自中国兽医药品监察所。阳离子脂质体试剂盒，购自美国^witrogen公司。支原体PCR检测试剂盒，购自无锡博慧思公司。营养液，MEM培养基。支原体培养基购自中国兽医药品监察所，配制方法见《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》。Vero细胞细胞为中国典型培养物保藏中心(CTCC)购入的非洲绿猴肾细胞-Vero 细胞，经该单位系统鉴定无支原体及其它外源微生物污染。
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实施例1用本发明方法除去伪狂犬疫苗种毒中的支原体1、实验方法(1)抽提基因组DNA 将经检测纯净的伪狂犬疫苗种毒毒液分别混入具有活性的支原体禽源(鸡滑液支原体)和非禽源(猪鼻支原体)阳性质控菌株，即人工模拟种毒遭受支原体污染，将此种毒液参照《分子克隆试验指南》一书中报道方法，抽提基因组DNA。具体步骤为将600 μ 1病毒液(病毒液中伪狂犬病毒的滴度PFU需大于或者等于 IX IO6个/ml，保证转染的效率)加到1. 5mlEP管中，加入蛋白酶κ(10μ g/ml)25l·! 1摇振混勻置37°C作用30min，其间摇勻数次，然后添加600 μ 1 Tris-饱和酚，手摇5min，13，OOOr/ min离心5min ；小心吸取上清再加酚600 μ 1手摇5min后，13，000r/min离心5min,取上清用600μ1酚氯仿(1 1)抽提，手摇5min，13，000r/min离心5min(此步可反复进行以得到较纯的DNA)，再用氯仿以同样的方法抽提一次；取上清加5μ 1 RNaSe(100y g/ml)，手摇5min混勻后37°C作用IOmin ；加1倍量冰冻异丙醇混勻，沉淀Ih后13，000r/min离心 5min，弃去异丙醇再加入2倍量75%冰冻乙醇混勻5min，13，000r/min离心15min后弃去上清，待乙醇彻底挥发后加入40 μ 1PBS,置于37°C温箱15min充分溶解，放入_20°C冰箱备用，此间避免反复冻融；(2)按照阳离子脂质体试剂盒说明书操作，将抽提的DNA产物与阳离子脂质体混合取2支Eppendorf离心管分别标记为1、2号。在1号管中加入5_6 μ g抽提的基因组 DNA及250 μ 1营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混勻；2号管中加入10 μ 1阳离子脂质体和250 μ 1营养液(不含血清和抗生素)并轻轻混勻，5min内，将2号管内的悬液缓缓加入1号管内，使二者缓慢均勻混合，置室温作用20-30min，可见脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒；(3)转染按常规方法将预先培养在细胞瓶内的Vero细胞消化、吹散，细胞悬液加入到六孔盘中，每孔数量控制在24h-30h后细胞密度为70%-75%,将上述脂质体与DNA形成细小沉淀样颗粒加入密度为70% -75%的细胞之上作用Mi左右，后弃去混合液换入新鲜生长液置于37°C培养箱继续培养，待5-6天出现明显病变后即可冻融收获毒液；细胞密度经目测，六孔盘每孔内细胞生长面积占六孔盘每孔总面积的百分比，其是本领域表示细胞生长程度的常用标准。(4)处理结果检验a、将此毒液按照《中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)》中所述培养法检测病毒液中是否存在支原体。步骤如下将要检验的制品加入事先配制好的检测液体培养基(即支原体培养基)中，设阴阳性对照，置于37°C培养，如有支原体污染的制品，支原体在培养基中繁殖，造成pH值变化，从而使指示剂变色，由此根据颜色的变化来判定制品是否污染支原体，无支原体的培养基呈橙红色，而污染支原体的培养基呈黄色。b、用无锡博慧斯公司产品支原体PCR检测试剂盒检测病毒液中是否存在支原体；C、按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、免疫原性及安全性进行检测并与未受污染前的种毒进行对比。2、实验结果(1)培养法检测结果由图1和图2可知，猪鼻支原体、、鸡滑液支原体作为阳性对照和人工模拟的被猪鼻支原体、鸡滑液支原体污染的病毒液中含有支原体，而采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液与阴性对照中则无支原体，说明本发明提供的方法可清除杀灭支原体，且支原体DNA绝无可能复活出新的子代支原体，而复活出的新病毒按照《中国兽药典》规定的培养法未检出存活支原体；PCR法检测结果由图3可知，用商品化支原体PCR检测试剂盒检测采用本发明方法清除支原体重新获得的病毒液，未检出支原体特异性核酸片段(约250bp)，同时禽源支原体及非禽源支原体阳性对照和阴性对照均成立，说明清除支原体是彻底的。(2)按照《猪伪狂犬病疫苗SA215株制造及检验规程》对复活出病毒的增殖能力、 免疫原性及安全性进行检测，并与未受污染前的种毒进行对比，结果见表1 表1病毒的增殖能力、免疫原性及安全性检测结果
权利要求
1. 一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)取伪狂犬疫苗种毒； ⑵抽提病毒基因组DNA ；(3)将抽提的DNA产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫苗种
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中狂犬疫苗种毒的滴度 PFU 彡 IX IO6 个/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中抽提的DNA产物先与载体混合，再转染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的载体为阳离子脂质体或者磷酸钙。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为5-6 μ g 5-20 μ 1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述抽提的DNA产物与阳离子脂质体的质量体积比为5-6 μ g 10 μ 1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤⑶中细胞的密度为 65% -85%。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述密度为70%-75%。
9.权利要求1-8任意一项所述的方法制备的伪狂犬疫苗种毒。
10.权利要求9所述的伪狂犬疫苗种毒在制备伪狂犬疫苗中的用途。
全文摘要
一种清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体的方法，它包括如下步骤(1)取伪狂犬疫苗种毒；(2)抽提病毒基因组DNA；(3)将抽提的DNA产物转染细胞，培养，冻融收获毒液，即得无支原体的伪狂犬疫苗种毒。本发明提供的方法解决了人们一直渴望解决但始终未能取得成功的技术难题，彻底清除伪狂犬疫苗种毒中的支原体，同时保持伪狂犬疫苗种毒的活性，容易制得效果好、安全性高的伪狂犬疫苗。
文档编号A61P31/22GK102352365SQ201110308008
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者张博 申请人:四川华神兽用生物制品有限公司