专利名称：靶向人cd147小分子rna干扰序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制宫颈癌细胞增殖，诱导细胞凋亡及增强细胞对化学药物敏感性的小片段RNA类药物及其用途。
背景技术：
RNA干扰具有强大的抑制基因表达的效应和高度的特异性，而引起生物医学界几乎所有研究领域的广泛兴趣。RNAi技术迅速从实验室推进到临床。首先，人基因组项目的完成使得有可能设计能沉默任何基因的小干涉RNA(SiRNA)。其次，我们认识到许多新的靶标对小分子药物或生物药物是难以接近的。因此，设想出一种在mRNA水平上影响这些靶标的方法就具有极大的吸引力。RNAi技术在很短的时间内迅速从体外细胞、动物试验发展到临床试验，第1个临床试验是由Acuity Pharmaceuticals公司于2004年底开发的靶向VEGF的siRNA用于治疗老年性黄斑变性(AMD)，并且发展迅速。siRNA作用于癌症的首例临床研究是Calando公司的用于治疗实体肿瘤的CALAA01，已于2008年5月获FDA批准进入I期临床。CALAA01是包被在环糊精-转铁蛋白-AD-PEG纳米颗粒中的靶向核糖核苷酸还原酶M2亚基的siRNA， 通过降低核糖核苷酸还原酶M2亚基的表达从而起到抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积的作用 [51]。啮齿类及灵长类动物的研究显示，CALAAO1具有抗肿瘤活性且安全性良好，I期临床试验中36例实体瘤患者接受为期21天的静脉注射循环治疗[52]。2009年3月，Alnylam 公司也开展了用于治疗肝癌的RNA干扰药物ALN-VSP02的I期临床试验[53]。该药物是包被在脂质体中靶向KSP(纺锤体驱动蛋白)和VEGF(血管内皮生长因子)的siRNA，通过阻滞细胞周期和抑制肿瘤血管生成以达到抑制肿瘤生长增殖。I期临床试验中58例肝癌患者接受每两周一次的静脉注射治疗。CDI47属免疫球蛋白超家族中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，是一种新的细胞表面黏附分子，介导细胞与细胞和细胞与间质的黏附作用。研究证明，纯化或重组的CD147可以在体外诱导成纤维细胞合成MMP-1、MMP-2、MMP_3。随后对CD147和肿瘤关系的研究发现， 在骨巨细胞瘤、泌尿系肿瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、神经胶质瘤、成釉细胞癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、骨髓癌、皮肤基底细胞癌、黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤细胞中均发现CD147表达增高，同时MMP活性增加，且与肿瘤的浸润和转移相关。免疫组织化学显示，相对于正常组织和癌旁组织，癌组织中⑶147mRNA的表达升高。⑶147在原发性肿瘤和恶性程度较低的肿瘤中高表达，提示其在肿瘤发展和早期转移中的作用。体内研究显示，多种肿瘤基质成纤维细胞的MMP表达与CD147的表达水平密切相关，提示在肿瘤与基质的相互作用中，CD147与MMP的表达发挥重要作用。免疫组化结果显示，CD147主要在侵袭性肿瘤的外周表达，从而推测CD147可能诱导了肿瘤的侵袭和转移。 对黑色素瘤细胞系和口腔鳞癌细胞系的体外研究证实，使用CD147抗体能够显著抑制肿瘤侵袭和转移。CD147还通过旁分泌的方式与内皮细胞产生的MMP相互作用，提示肿瘤细胞产生的⑶147通过调节内皮细胞产生的MMP诱导肿瘤血管生成。⑶147的作用不仅局限于肿瘤-成纤维细胞、肿瘤-内皮细胞的相互作用中，CD147也可以在肿瘤细胞或成纤维细胞中诱导MMP分泌。在肿瘤细胞中转染⑶147或用重组的⑶147分子处理肿瘤细胞，发现肿瘤细胞本身MMP尤其是MMP-2的表达增加。在成纤维细胞中转染重组⑶147腺病毒载体，也可以诱导MMP-I和MMP-3高表达。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌。在发展中国家则居首位，严重威胁妇女生命。传统治疗方法以手术、化疗及放疗为主，许多抗癌剂不仅对癌细胞，对正常生产的细胞也具有毒性，致使许多患者的生存率仍不理想，宫颈癌仍然是全球女性死亡的一个主要疾病。因此，采用具有靶向性治疗的药物就显得优势凸出，正逐渐成为针对宫颈癌的基本手段，本发明所采用并设计完成的正是基于此进行的研究成果，不仅具有靶向性，而且相比与同期能用于治疗宫颈癌的基因药物如 一种靶向Survivin基因的siRNA分子及其应用(CN 101935651A)；抑制人RabJ基因表达的siRNA及其应用(CN1948483)；抑制血管内皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用 (CN101353655)等，能增加现有抗肿瘤药物的敏感性的优点，具有协同作用，非常具有潜力。
发明内容
本发明的目的是提供靶向人CD147小分子RNA干扰序列及其用途。靶向人⑶147小分子RNA干扰序列，其特征在于正义链C⑶CAGAACACAUCAACGATT反义链UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT。靶向人⑶147小分子RNA干扰序列的用途，在人源性肿瘤抑制增殖、诱导凋亡，抑制肿瘤浸润转移及增强肿瘤药物敏感性。本发明的体外实验结果表明，siRNA干扰序列BSGl对HeLa细胞的体外增殖表现出良好的抑制活性，其抑制率达到56%;RT-PCR实验结果显示siRNA干扰序列BSGl能够下调⑶147基因在mRNA水平的表达。并且能够不同程度下调相关基因MMP_9、VEGF及MDR-I 在mRNA水平的表达；免疫细胞化学染色结果显示siRNA干扰序列BSGl能够下调⑶147基因在蛋白质水平的表达；流式细胞术实验结果显示siRNA干扰序列能够影响细胞周期，其中siRNA干扰序列BSGl作用后处于S期细胞较阴性对照减少32. 60%，而处于Gl期细胞增大32. 60%,细胞被阻滞在Gl期；药物敏感性实验结果显示siRNA干扰序列BSGl与5-FU 联用，能够增强HeLa细胞对5_FU的敏感性。综上所述，在体外，siRNA干扰序列BSGl能够明显下调⑶147mRNA水平和蛋白质水平的表达，对HeLa细胞具有明显增殖抑制活性，显著影响细胞周期，诱导细胞凋亡，并能明显增强细胞对化学药物的敏感性。
图1是BSGl抑制肿瘤增殖活性实验结果，其中PC表示阴性对照JR表示抑制率。图2是RT-PCR实验结果，其中泳道1表示阴性对照组，泳道2表示BSGl组。图3是免疫细胞化学染色结果，其中A表示阴性对照组，B表示BSGl组。图4是流式细胞实验结果，其中A表示阴性对照组，B表示BSGl组。图5是药物敏感性实验结果，其中5-FU表示5-FU单独作用结果，5-FU/BSG1表示5-FU与BSGl联用结果。
具体实施例方式本发明是靶向人⑶147小分子RNA干扰序列及其用途，靶向人⑶147小分子RNA 干扰序列，其特征在于正义链C⑶CAGAACACAUCAACGATT
反义链UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT。根据以上所述的干扰序列，其特征在于靶向人源性CD147基因。根据以上所述的干扰序列，在抗肿瘤基因治疗中的应用。靶向人CD147小分子RNA干扰序列的用途，在人源性肿瘤抑制增殖、诱导凋亡，抑制肿瘤浸润转移及增强肿瘤药物敏感性。本发明是以下述方式实现的以⑶147基因为靶点，用RNAdraw和Sfold分析 ⑶147可能的二级结构及二级结构中单链核酸的概率，用在线ClustLW工具分析⑶147基因的序列保守区，然后针对CD147基因的序列保守区和二级结，构松散区，设计靶向该基因的 siRNA,并在国际人类基因组库中进行BLAST比对，除去可以跟靶序列外的其它人类基因有较强配对的siRNA，最终得到所需要的小干扰序列BSGl并进行化学合成。将合成的靶向人 ⑶147基因的siRNA小干扰序列BSGl转染人宫颈癌HeLa细胞株，观察其对HeLa细胞株增殖、凋亡及对药物敏感性的影响，并检测其对CDI47基因在mRNA和蛋白质水平表达的敲减状况。靶向⑶147的小干扰序列BSGl序列如下BSGlSense siRNA Strand C⑶CAGAACACAUCAACGATTBSGlAntisense siRNA Strand :UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT。下面用更为具体的实施例展开本发明。1、以人⑶147基因的第一个转录本为标准(NCBI登陆号NM_001728. 2)，用 RNAdraw和Sfold分析⑶147可能的二级结构及二级结构中单链核酸的概率，用EBI提供的在线ClustLW工具分析CD147基因的序列保守区，然后针对CD147基因的序列保守区和二级结构松散区，设置筛选条件，用Sfold软件设计靶向该基因的siRNA，初选的siRNA在国际人类基因组库中进行BLAST比对，除去可以跟靶序列外的其它人类基因有较强配对的 siRNA,以确保所选的siRNA与非靶基因没有强的同源性，最终得到所需要的siRNA。靶向 ⑶147的小干扰序列BSGl序列如下BSGlSense siRNA Strand :C⑶CAGAACACAUCAACGATTBSGlAntisense siRNA Strand :UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT2、将Hela细胞以适当数量种入96孔板，待贴壁后，EntranSterTM-R纳米聚合物转染试剂介导小干扰片段BSGl转染细胞，培养72小时，收集细胞进行MTT实验。结果显示， 干扰序列BSGl对HeLa细胞的体外增殖表现出良好的抑制活性，计算得其对HeLa细胞抑制率为56% (参见图1)。3、将Hela细胞以适当数量种入6孔板，待贴壁后，Entranster -R纳米聚合物转染试剂介导小干扰片段BSGl转染细胞，培养48小时，收集细胞，提取总RNA进行RT-PCR实验。结果显示，⑶147基因及血管生成因子VEGF、⑶147下游调控因子MMP-9及多药耐药基因MDR-I在mRNA水平表达均表现出不同程度的下调(参见图2)。4、将Hela细胞以适当数量种入6孔板，待贴壁后，Entranster -R纳米聚合物转染试剂介导小干扰片段BSGl转染细胞，培养72小时，收集细胞，进行免疫化学染色实验，染色结果显示⑶147蛋白量表达显著降低(参见图3)。5、将Hela细胞以适当数量种入6孔板，待贴壁后，Entranster -R纳米聚合物转染试剂介导小干扰片段BSGl转染细胞，培养48小时，收集细胞，流式细胞术检测细胞周期， 结果显示处于Gl期细胞较阴性对照增大32. 60%，而处于S期细胞减少32. 60%，细胞被阻滞在Gl期(参见图4)。6、将Hela细胞以适当数量种入96孔板，待贴壁后，Entranster -! 纳米聚合物转染试剂介导小干扰片段BSGl转染细胞，稳定转染，弃去培养液，加入适当剂量(50ul/ ml) 5-FU，并设置阴性对照(转染试剂与5-FU联用)培养48小时，收集细胞进行MTT实验。 结果显示显示50ul/ml 5-FU对HeLa细胞的抑制率为36%，而5-FU与siRNA序列BSGl联用其抑制率达到67%。表明siRNA序列BSGl在体外能够增强HeLa细胞对5-FU的敏感性 (参见图5)。
权利要求
1.靶向人CD147小分子RNA干扰序列，其特征在于 正义链C⑶CAGAACACAUCAACGATT反义链UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT。
2.根据权利要求1所述的干扰序列，其特征在于靶向人源性CD147基因。
3.根据权利要求1所述的干扰序列，在抗肿瘤基因治疗中的应用。
4.靶向人CD147小分子RNA干扰序列的用途，在人源性肿瘤抑制增殖、诱导凋亡，抑制肿瘤浸润转移及增强肿瘤药物敏感性。
全文摘要
靶向人CD147小分子RNA干扰序列及其用途，涉及抑制宫颈癌细胞增殖，诱导细胞凋亡及增强细胞对化学药物敏感性的小片段RNA类药物及其用途，其干扰序列为正义链CGUCAGAACACAUCAACGATT反义链UCGUUGAUGUGUUCUGACGTT；靶向人CD147小分子RNA干扰序列的用途，在人源性肿瘤抑制增殖、诱导凋亡，抑制肿瘤浸润转移及增强肿瘤药物敏感性。
文档编号A61K48/00GK102363780SQ20111030917
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者张新国, 曾艳龙 申请人:兰州理工大学