专利名称：人血清白蛋白-siRNA纳米尺寸载体系统的制作方法
技术领域：
本说明书涉及SiRNA结合到人血清白蛋白的人血清白蛋白-SiRNA载体系统及其应用，更具体地讲，涉及一种通过将人血清白蛋白和si RNA结合而制备并具有改善的体内稳定性的人血清白蛋白-siRNA纳米尺寸载体系统及其应用。
背景技术：
基因治疗分为在因基因缺失或基因变异使特异性蛋白质在相应的细胞中没有表达时，通过使特异性基因导入(传递)到细胞中或在细胞中进行表达来恢复受损功能的方法；通过诸如siRNA的基因传递来选择性地抑制导致疾病的蛋白质的过度表达或不必要的蛋白质的过度表达来恢复正常功能的方法。这样的在基因水平对蛋白质的控制是针对疾病的成因，因此，其被认为是理想的疗法。使用siRNA的基因治疗的关键在于如何以最小副作用和给药效率将具有强负电荷的si RNA传递到期望组织。然而，siRNA具有低的细胞透性，并且因在生理环境下等对基因的降解酶敏感而不能维持必要的浓度，从而易于分解，这些导致siRNA作为药物使用受到限制。为了克服该问题，需要开发这样基因载体系统可以有效地循环而不被活体等中的免疫细胞移除或排出，以稳定传递/积累在特异疾病位点上并被适当地生物降解。作为体内多聚体，血清白蛋白是一种生物相容性好并且也非常稳定(在血液中具有19天的半衰期)的蛋白质。如所公知的，血清白蛋白具有高亲和力并具有有效的肿瘤积累能力，从而适合于用作基因载体系统。
发明内容
因此，为了克服上面提到的问题，详细描述的方面提供了能够提高siRNA体内稳定性和传递效率的新型siRNA载体系统以及包含该siRNA载体系统的药理学组合物。为了实现根据本说明的目的的方面，如这里所实施和宽泛描述的，提供了一种使用结合的人血清白蛋白-siRNA载体系统，该载体系统能够通过与siRNA形成复合物而以纳米尺寸颗粒的形式存在于水溶液中，并且可以在特定的生理环境下从siRNA裂解下，从而提高在活体内的传递效率。通过下面给出的详细描述，本申请适用性的其他范围将变得更明显。然而，应该理解的是，由于通过下面的详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和变形对本领域技术人员将是明显的，所以在表示本发明优选实施例的同时，仅通过举例说明的方式给出了详细的描述和具体的示例。
附图示出了示例性实施例并与说明书一起用于解释本发明的原理，包括附图以提供本发明的进一步理解，附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
在附图中图1是通过使用2-亚氨氢氯化硫醇(Traut ’ s reagent)将-SH (硫醇基)导入包含胺基的人血清白蛋白(HSA)来制备硫醇化人血清白蛋白(T-HSA)的示意图；图2是使在其两端包含-SH (硫醇基)的多SiRNA与硫醇化人血清白蛋白(T-HSA) 反应以通过二硫键形成复合物的示意图；图3是通过二硫键制备的多SiRNA和T-HSA的复合物的电泳图；图4示出了通过根据每个浓度使用用于红色荧光蛋白(RFP)基因的T-HSA/多 siRNA复合物处理RFP基因过度表达细胞而对RFP基因表达的抑制效果；图5示出了在将通过示例2的方法制备的T-HSA/多siRNA复合物施用到小鼠体内之后在表达RFP的肿瘤组织中的基因表达抑制效果；图6是当通过示例2的方法使用用于肿瘤生长因子VEGF的多siRNA而制备的 T-HSA/多siRNA复合物以施用到被植入人前列腺癌细胞系的小鼠中时，被VEGF多siRNA传递体抑制的小鼠肿瘤生长曲线。
具体实施例方式在下文中将详细地描述本说明书。为了在活体内有效地传递SiRNA，本说明书提供了通过将人血清白蛋白聚合物结合到siRNA而制备的siRNA载体系统，具体地讲，提供了通过生物可降解共价键将人血清白蛋白聚合物结合到siRNA而制备的siRNA载体系统。该siRNA载体系统是通过将人血清白蛋白结合到各种形式的siRNA而制备的。所述结合可以通过生物可降解共价键获得，并且该siRNA载体系统可以如以下进行表示。A-B(A 人血清白蛋白，B 各种形式的多siRNA)其中，A表示具有导入其中的生物可降解反应物的人血清白蛋白。具体地讲，人血清白蛋白A可以在水溶液中与各种形式的siRNA形成复合物以创造纳米尺寸的自组装， 从而选择性地积累在特异性疾病位点(例如，血管生成靶向EPR、肿瘤、风湿病、炎病性疾病
等)-t ο作为体内多聚体物质之一的血清白蛋白具有优异的生物相容性。此外，作为在血液中具有19天半衰期的非常稳定的蛋白的血清白蛋白具有与肿瘤(癌)组织的高亲和力， 从而表现出有效的肿瘤积累能力。因此，血清白蛋白可以化学结合到具有低分子量的各种化学药物、蛋白质、抗体等，从而用于提高各种药物的体内稳定性并用于将这样的药物传递到目标肿瘤组织。例如，已报道了研究将阿霉素(Drug Delivery 6(1999) 1-7)或甲氨蝶呤(MTX Anticancer Drugs 8 (1997) 835-844)化学结合到白蛋白来提高血液中药物的肿瘤靶向性和稳定性。关于将血清白蛋白用作药物传递体，已报道了研究(Cancer Research 46(1986)6387-6392)当基于白蛋白对癌组织的高靶向性而将具有结合荧光团或标记同位素的白蛋白注入到癌移植的小动物，然后进行成像时，大量的白蛋白选择性地积累在肿瘤组织上。因此，可知这样的选择性积累通过发生在肿瘤组织附近的疏松血管中的增强渗透滞留(EPR)效应而发生。这样，已经介绍了作为抗癌传递体的白蛋白的优点，但白蛋白本身不能提供强到足以能够用作具有强负电荷的siRNA载体系统的结合力。因此，需要具有提高的结合力并保持白蛋白特异性特征的变异。
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所以本发明的发明人研究了用于稳定地将人血清白蛋白与SiRNA结合，来制备凭借人血清白蛋白与siRNA的有效结合而能够在活体内稳定地传递siRNA的人血清白蛋白-siRNA载体系统的方法。因此，发明人已发现了当通过生物可降解共价键将siRNA结合到人血清白蛋白时，siRNA和人血清白蛋白可以彼此稳定地结合并可以有效地在体内分解，从而适合作为siRNA载体系统。作为参考，发明人提供了对于具有提高的体内稳定性和 siRNA的基因表达效果的专利申请(PCT/KR2010/001296)和文献(Journal of controlled release, 2010. 141(3) :339-346):通过将硫醇基引入到siRNA的5，端以通过二硫键结合 siRNA，这样增大了 siRNA的尺寸。此外，已证实了 siRNA载体系统的可能性(专利申请 No. 2010-0089081)通过同时将电荷和共价键引入到来源于活体的多聚体中来制备具有改善的反应性的纳米粒。根据本说明书的人血清白蛋白-siRNA载体系统的人血清白蛋白A和siRNA B通过生物可降解共价键彼此结合。生物可降解共价键的示例可以包括二硫键、酯键、酐键、腙键、 酶特异性肽键等，但不限于此。由于在特定的生理环境下可分解，所以这样的生物可降解共价键会是有用的。在siRNA和人血清白蛋白之间的通过各种酶和不同的酸度而在生理环境下是生物可降解的生物可降解键可以允许siRNA(通过体内酶的特异性而溶解)抑制目标蛋白质的表达。例如，当将作为用于生物可降解键的反应物的硫醇基引入到siRNA的端部和多聚体的端部时，siRNA和多聚体具有被称作二硫键的生物可降解键。二硫键被细胞质内的谷胱甘肽(GSH)还原。当将具有二硫键的siRNA-人血清白蛋白载体系统引入到活体中时，所述键被存在于活体内的谷胱甘肽消化，使得siRNA可以从载体系统分离。具体地讲， 对于谷胱甘肽的浓度在癌细胞中增大的报道，可以注意到，即使在肿瘤组织中，人血清白蛋白-siRNA纳米尺寸载体系统的诸如二硫键的生物可降解键也可以有效地生物降解，从而有效地将siRNA传递到目标组织。对于生物可降解共价键，生物可降解反应物被引入到人血清白蛋白A，此外，反应物被引入到siRNA B的一端或两端，以使siRNA B与人血清白蛋白A形成生物可降解共价键。引入的反应物的类型可以取决于共价键的目标类型。在以上描述中，B表示均具有反应物的各种形式的siRNA。siRNA可以是单体 siRNA、通过生物可降解键与若干siRNA结合的多siRNA或者聚合siRNA。优选地，siRNA可以是15至30个核苷酸的单体siRNA或者可以是由作为聚合体的100至600个核苷酸组成的聚合siRNA。siRNA的分子量优选地可以在10，000至1，000，000范围内。为了治疗的目的，siRNA序列可以优选地使用血管内皮生长因子(VEGF)的碱基序列、Bcl2、EGFR、NF_kB 等，但不限于此。为了通过荧光来检查siRNA的传递效率，下面的示例使用了红色荧光蛋白 (RFP)的siRNA碱基序列。人血清白蛋白A和siRNA B优选地可以以大约10 1的重量比混合ο根据本说明书的通过将人血清白蛋白A和siRNA B结合来制备siRNA载体系统的方法可以包括(a)将用于生物可降解共价键的反应物引入到人血清白蛋白中；(b)将反应物引入或活化到各种形式的SiRNA的一端或两端；(c)将在步骤(a)制备的人血清白蛋白和在步骤(b)制备的siRNA通过生物可降解共价键稳定地结合来制备纳米粒。
可以根据结合机理可选择地将该方法设定成同时执行这些步骤。在本说明书的一个实施例中，将硫醇基引入到人血清白蛋白中来制备硫醇化的人血清白蛋白(见图1)。此外，然后将硫醇化的人血清白蛋白结合到均具有硫醇基引入端的聚合的多siRNA。因此，人血清白蛋白和多siRNA可以通过由引入的硫醇基得到的二硫键而形成复合物。这样，硫醇基或除硫醇基之外的反应物可以引入到人血清白蛋白和siRNA中，从而通过人血清白蛋白和siRNA之间的共价键形成复合物。如上所述，具有引入的反应物的各种形式的siRNA和引入反应物的人血清白蛋白可以在水溶液中有效地形成复合物来形成纳米尺寸的自组装，纳米尺寸的自组装也可以积累在特异性疾病(血管生成靶向EPR、肿瘤、风湿病、炎病性疾病等)位点上。关于此，仅 siRNA因其充足的负电荷而难以渗透到细胞中，但结合到siRNA的人血清白蛋白是非常稳定的蛋白质，人血清白蛋白在血液中具有19天的半衰期并且被试图用作用于改善各种药物体内稳定性的药物传递系统。因此，siRNA和人血清白蛋白可以凭借人血清白蛋白的化学修饰而形成纳米尺寸自组装。可以根据修饰度来控制siRNA等的药物结合水平。当使用根据本说明书的载体系统传递siRNA时，siRNA可允许有效的体内药物循环，并可以用作针对肿瘤组织具有高循环能力的药物传递系统。通过所述方法制备的人血清白蛋白-siRNA载体系统的尺寸可以为IOnm至 2000nm,并且可以在活体内形成纳米粒，从而通过EI3R效应有效地积累在肿瘤组织上并适用于癌症的治疗。此外，对于诸如类风湿关节炎等的炎症性疾病，分泌的/催生的炎症物质可以扩展血管，并且血压和渗透性可以增加，从而抗炎剂可以传递到存在于血管壁的发炎细胞。因此，根据本说明书的siRNA载体系统也可以适合于治疗炎症性疾病。同时，siRNA载体系统可以用作药理学组合物的重要成分。因此，本说明书提供了一种由有效剂量的人血清白蛋白-siRNA载体系统组成的药理学组合物。除人血清白蛋白-SiRNA载体系统之外，该药理学组合物还可以包括一种或多种药理学允许的载体以用于施用。药理学允许的载体可以与所述重要成分相容。可以使用生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇以及它们中的至少一种的混合物来作为药理学允许的载体，或者如果需要，可以添加诸如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等的其他典型的赋形剂。此外，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂和润滑剂等来制备成诸如水溶液、悬浮液、乳剂等的注射液的形式。可以将药理学组合物制备成诸如粉末、片剂、胶囊、药水、注射剂、软膏、糖浆等的各种形式，并可以通过使用例如密封的安瓿和瓶等的单位剂量或多剂量的容器来提供药物学组合物。药理学组合物可以允许口服或肠外施用。可以通过包括口服施用、静脉注射施用、 肌注施用、动脉内施用、髓内施用、硬膜内施用、心脏内施用、经皮施用、皮下施用、腹腔内施用、肠道施用、舌下施用和局部施用的方法中的一种来执行药理学组合物的施用。可以通过公知的技术将药理学组合物制备成合适的形式以用于这样的临床施用。例如，对于口服施用，可以将药理学组合物与非活性稀释剂或可食性载体混合，密封在硬的或软的胶囊中或者压成片剂来施用。对于口服施用，可以将活性组合物与稀释剂混合，从而以可消化片剂、 含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸(wafer)等的形式来使用。此外，可以根据在本说明书的领域内的已知技术或通常使用的技术来制备用于例如注射、肠外施用等的各种形式。组合物的剂量可以根据所有与病人相关的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方式、排泄率、疾病的严重度等在宽的范围内变化，并可以由本公开所属领域的典型使用而决定。在下文中，将参照几个示例来详细地描述本说明书。下面的示例仅是示出性的，并且不应该被解释为限定本公开。示例1 硫醇基引入到人血清白蛋白(T-HSA制备)大量的人血清白蛋白存在于活体内，无毒性并有效地积累在肿瘤组织上。然而，人血清白蛋白其自身不能结合到具有强负电荷的siRNA。因此，通过使用2-亚氨氢氯化硫醇作为交联剂(这里，SPDP交联剂可以用来代替2-亚氨氢氯化硫醇)将硫醇基引入到白蛋白的胺基中。在水溶液中可以容易地执行使用2-亚氨氢氯化硫醇将硫醇基引入到白蛋白中，并且包含硫醇基的白蛋白可以有效地具有与siRNA结合的二硫键，其中，所述siRNA在其一端或两端具有硫醇基。二硫键可使得二硫键结合的部分被细胞质中的谷胱甘肽特异水解而使siRNA释放。将IOmg的人血清白蛋白(HSA，分子量为66. 5kDa)溶解在IOml的pH为8. 0的磷酸盐缓冲液中，并分别与0. 2mg,0. %ig、aiig*%ig的2-亚氨氢氯化硫醇(分子量为137. 63Da, 与白蛋白的分子数的比为10倍、20倍、100倍和200倍)在4V反应1小时。然后，使用具有12，OOODa的分离点(cut-off)的透析膜透析溶液M小时，以除去未反应的2-亚氨氢氯化硫醇，接下来进行冷冻干燥，从而制备硫醇化的人血清白蛋白(T-HSA)(见图1)。示例2 具有硫醇基的聚合的寡核苷酸与人血清白蛋白多聚体的结合将聚合的多siRNA结合到T-HSAHSA，聚合的多siRNA的稳定性和负电荷量通过将硫醇基引入其端部而增加。人血清白蛋白(T-HSA)和siRNA通过二硫键形成复合物。将 50 μ g 的多 siRNA (50mM 磷酸钠缓冲液，5mMEDTA,pH 8. 0)和 500 μ g 的 T-HSA 溶解在 50 μ 1 的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中并混合，以在37°C彼此反应M小时，从而制备稳定的复合物 (见图2)。在8%的聚丙烯酰胺凝胶中将通过以几个重量比和浓度比混合多siRNA和T-HSA 并在37°C彼此反应对小时而制备的复合物在150V电泳35分钟(见图幻。然后，用肚-Br 将电泳的复合物染色，从而通过凝胶成像系统观察未反应形成复合物而剩下的多siRNA。因此，观察到当将2-亚氨氢氯化硫醇以100倍的摩尔比添加到T-HSA以及将 T-HSA以10倍的重量比添加到siRNA并进行反应时，T-HSA和多siRNA的最有效复合物形成。此外，观察到不发生多siRNA与没有反应物引入的纯的人血清白蛋白的任何结合。因此，将理解的是，siRNA和T-HSA之间凭借除了电荷之外的硫醇基形成复合物而使二硫键形成。示例3 通过细胞实验验证通过使用引入硫醇基的人血清白蛋白(T-HSA)多聚体和聚合寡核苷酸(多siRNA)的复合物的siRNA传递体的基因表达抑制在作为黑色素瘤细胞系的RFP_B16/F10(1. 2*105/皿)中处理根据示例2制备的多siRNA和T-HSA的复合纳米粒，使得siRNA的浓度可以为20nM、50nM和ΙΟΟηΜ，其中，黑色素肿瘤细胞系过度表达RFP。在M小时之后，在荧光显微图像中观察处理过的纳米粒的红色荧光蛋白(RFP)表达抑制效应。在该实验中，使用siRNA靶向的RFP作为荧光蛋白。为了在细胞水平验证基因表达抑制效果，划分为未处理的组(对照组)、仅多siRNA被处理过而无载体系统的组(自由多si-RNA)、被处理过的多siRNA/LF的组和被处理过的多siRNA/ T-HSA的组来执行该实验(见图4)。所述多siRNA/LF的LF表示Lipofectamine 2000, Invitrogen公司的一种产品。通过该实验观察到通过T-HAS的多siRNA传递体表现出RFP 基因表达的有效抑制。示例4 通过动物实验使用T-HSA多聚体和多siRNA来验证基因表达抑制效果将1X106RFP-B16/F10黑色素瘤细胞系从裸鼠背部的腰以下的部分注入到裸鼠内，从而制备动物癌症模型。分三次(第O天、第1天、第3天)将通过示例2的方法制备的T-HSA/多siRNA复合物注入到动物癌症模型的尾静脉中，从此时起通过光学成像系统检测到RFP荧光，从而观察通过血管传递的多siRNA对来自癌组织的RFP表达抑制效果。观察到，当注入T-HSA/多siRNA复合物时，显著地减少了来自癌组织的RFP表达(见图5)。 此外，通过在第6天撕开来自小鼠的癌组织并通过荧光显微镜比较来自癌组织的RFP的表达量的方式，观察到来自注入了 T-HSA/多siRNA复合物的小鼠的组织的RFP的有效减少。示例5 通过动物实验来检查经由T-HSA多聚体和多siRNA的复合物的传递的肿瘤体积的减小将IX 106PC_3人前列腺癌细胞系从裸鼠背部的腰以下的部分注入到裸鼠内，从而制备动物癌症模型。制备直接影响肿瘤扩散的血管内皮生长因子(VEGF)的多siRNA，并且通过示例2的方法制备T-HSA/多siRNA复合物。从肿瘤的体积变成大约50mm3 IOOmm3时开始，每隔两天将T-HSA/多siRNA复合物注入到动物癌症模型的尾静脉中，从而三周后测量肿瘤体积通过经由血管传递的VEGF多siRNA的减小。观察到，通过注入T-HSA/多siRNA 复合物，癌组织内的肿瘤扩散通过VEGF抑制而受到明显的抑制。如上所述，通过生物可降解共价键制备的具有新形式的纳米尺寸人血清白蛋白载体系统可以在水溶液中形成纳米粒并可以在活体内稳定地将siRNA传递到靶位点，从而提高通过siRNA的治疗功效。因此，人血清白蛋白-siRNA载体系统可以有效地应用于各种癌症和疾病模型。前面的实施例和优点仅是示例性的并且不被解释为限制本公开。本教导可以容易地应用于其他类型的设备。本描述意在是示例性的，并且不意图限制权利要求的范围。许多选择、变型和改变对本领域技术人员将是明显的。可以以各种方式将这里描述的示例性实施例的特性、结构、方法和其他特征结合来得到另外的和/或可选择的示例性实施例。由于在不脱离本特性的特征的情况下，可以以多种形式实施本特性，所以也应该理解的是，除非另外明确地指出，否则上述实施例不受前面描述的任何细节的限制，而是相反，应该在权利要求限定的范围内进行宽泛的解释，因此落入权利要求的界限和边界内的所有改变和变形或者这样的界限和边界的等同物因此意图包含于权利要求。
权利要求
1.一种人血清白蛋白-SiRNA载体系统，具有在人血清白蛋白A和SiRNAB之间的生物可降解共价键，所述载体系统具有下面的结构，A-B其中，A表示具有引入的生物可降解反应物的人血清白蛋白多聚体，B表示具有引入到其一端或两端的反应物的siRNA。
2.如权利要求1所述的载体系统，其中，人血清白蛋白A和siRNAB分别具有用于在人血清白蛋白A和siRNA B之间的生物可降解共价键的引入反应物。
3.如权利要求1所述的载体系统，其中，在人血清白蛋白A和siRNAB之间的生物可降解共价键选自于二硫键、酯键、酐键、腙键、酶特异性肽键。
4.如权利要求1所述的载体系统，其中，所述siRNAB是单体siRNA、通过生物可降解键与几个siRNA结合的多siRNA或者聚合siRNA。
5.如权利要求1所述的载体系统，其中，所述siRNAB是15个至30个核苷酸的单体 siRNA或者是由作为聚合体的100个至600个核苷酸组成的聚合siRNA。
6.如权利要求1所述的载体系统，其中，人血清白蛋白A和siRNAB以10 1的重量比混合。
7.如权利要求1所述的载体系统，其中，所述载体系统的尺寸为IOnm至2000nm。
8.如权利要求1至7所述的载体系统，其中，所述人血清白蛋白-siRNA载体系统用于癌症治疗。
9.一种由有效剂量的人血清白蛋白-siRNA载体系统组成的抗癌组合物。
10.一种制备siRNA载体系统的方法，所述方法包括以下步骤(a)将用于生物可降解共价键的反应物引入到具有正电荷的人血清白蛋白多聚体中；(b)将反应物引入或活化到siRNA、多siRNA或聚合siRNA的一端或两端；(c)将在步骤(a)制备的人血清白蛋白和在步骤(b)制备的siRNA通过生物可降解共价键稳定地结合来制备纳米粒。
全文摘要
一种人血清白蛋白-siRNA纳米尺寸载体系统。本发明公开了具有结合到人血清白蛋白的siRNA的人血清白蛋白-siRNA载体系统及其应用，具体地讲，本发明公开了一种在人血清白蛋白多聚体和siRNA之间具有的可降解共价键并且在活体内稳定的人血清白蛋白-siRNA载体系统及其应用。在人血清白蛋白和siRNA之间具有可降解共价键的人血清白蛋白-siRNA载体系统在活体内表现出向靶位点的高siRNA传递效率。因此，人血清白蛋白-siRNA载体系统即使以相对低的浓度施用也可以允许用于治疗的siRNA在活体内有效地传递到诸如癌组织的靶位点，这可以使较宽地用于治疗各种疾病。
文档编号A61K48/00GK102441175SQ20111030935
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月10日 优先权日2010年10月5日
发明者尹仁灿, 崔贵元, 权翊赞, 李素珍, 许明淑, 金光明 申请人:韩国科学技术研究院