专利名称：抗hIL6R高亲和力抗体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，涉及一种人白介素6受体(hIL6R)的高亲和力中和活性抗体的制备及其应用。
背景技术：
人白细胞介素-6 (human interleukin-6, hIL6)是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子，具有广泛的生物学功能，可由T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和心肌细胞等产生。hIL6通过细胞上的两种蛋白传导其生物活性，一种是人白细胞介素 _6 受体(human interleukin-6 receptor, hIL6R)，一种是分子为 130KD 的 gpl30 蛋白。hIL6和hIL6R结合形成二元复合物，此复合物再与细胞膜结合的gpl30相互作用，然后诱导信号传导。hIL6R 可分为细胞膜结合型和可溶性 hIL6R(human soluble interleukin-6receptor, hsIL6R)两种类型。细胞膜结合型hIL6R由468个氨基酸组成，切除N端19个氨基酸的信号肽后获得含有449个氨基酸的成熟分子，有6个N-糖基化位点，分子量为80KD，分为胞外区、穿膜区和包浆区，三个区分别包含339、28和82个氨基酸。hIL6R即与hIL6的结合，又与gpl30蛋白的偶联，单独的hIL6R和hIL6结合是低亲和力。hIL6R分布较广，分布于淋巴细胞和非淋巴细胞，如活化B细胞，骨髓瘤细胞，静止T细胞、肝细胞和单核细胞等。hIL6R在很多肿瘤细胞上也都有表达，如多发性骨髓瘤、前列腺癌、白血病等。对hIL6R在疾病组织中的表达情况的检测可以对相关疾病的情况进行评价或跟踪。hsIL6R是hIL6R的一种特殊形式，分子量为50KD，与细胞膜结合型的hIL6R的胞外区的只有C端的10个氨基酸不同。hsIL6R可以和hIL6结合，形成的hsIL6R/hIL6复合体和细胞膜上的gpl30结合从而 也可以诱导胞内信号传导。通过这种机制，hIL6可以激活不表达hIL6R的细胞，所以hsIL6R在hIL6的信号传导中扮演着重要的角色。研究发现报道称在一些慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病中出现hsIL6R的高水平表达；另外恶性肿瘤患者血清中hsIL6R水平明显高于健康对照组，随着病情的加重hsIL6R水平进一步升高，表明对血清中的hsIL6R的检测对恶性肿瘤病情的监察及治疗效果的判断可能有一定的参考价值。目前研究表明hIL6与多种疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤的发生、发展和预后有关，某些急性炎症、自身免疫性疾病及淋巴细胞恶性肿瘤等疾病均与体内hIL6水平异常增高相关。hIL6只能通过其受体来进行作用，对hIL6表达的调节可以在其受体水平上进行，所以hIL6R成为多种疾病的治疗靶点，为药物筛选和药物设计提供了新的思路和方法。可通过hIL6R抗体阻断hIL6R和hIL6的结合，从而可能达到治疗hIL6相关疾病的目的，比如类风湿性关节炎、Castleman氏症、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病及2岁及肿瘤等。类风湿性关节炎的发病率为总人口的0. 8%，且80%的患者在35-50岁发病，对患者和社会都带来很大的痛苦和负担。Castleman氏症的发病率尚无明确统计，但它可发生在存在淋巴结的任何部位，常见于年轻人，可在任何年龄发病。银屑病发病率占世界人口的0. 1% 3%，给患者的身心都带来了很大的创伤。hIL6R的抗体是有巨大的前景的治疗这些疾病的药物靶标。目前应用于临床的hIL6R的抗体只有tocilizumab。Tocilizumab被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗类风湿性关节炎，适用于使用其他已获批的治疗药物无效的成年中重度类风湿性关节炎患者。Tocilizumab被日本批准用于Castleman氏症的治疗。Tocilizumab在其他疾病，如银屑病和系统性红斑狼疮(SLE)等也表现出了一定的治疗效果，表现出更大的市场潜力和市场需求。但是目前市场上只有一家公司有hIL6R抗体药物，全球市场的空缺很大。而我国目前还没有上市的相关产品，所以迫切需要研发hIL6R的抗体药物，弥补国内的空白。该发明提供的hIL6R高亲和力鼠单克隆抗体的成功研制恰为相关药物的研发提供了优质的候选抗体，也将为进一步研制其他类型抗体(如人源化抗体)提供了条件和基础。
发明内容
本发明提供一种hIL6R高亲和力鼠单克隆抗体，该抗体能与重组表达的hIL6R结合，也能与细胞水平的hIL6R结合。该抗体与重组hIL6R结合的亲和常数为1. 72X10_nM。该抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ;重链氨基酸序列为SEQ ID NO 2 ;轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :3，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ;轻链上互补决定区⑶R1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 7 ;重链上互补决定区 CDRl, CDR2, CDR3 的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。本发明用来制备hIL6R鼠单克隆抗体的免疫原是利用哺乳动物细胞在体外重组表达的hIL6R胞外区片段，采用的技术是小鼠杂交瘤技术。
本发明利用酶联免疫检测方法，证明所述hIL6R单克隆抗体可以在蛋白水平有效的阻断重组hIL6R和重组hIL6的结合，说明该抗体在蛋白水平上具有中和活性。另外，本发明利用细胞活性检测试验，证明所述hIL6R鼠单克隆抗体可以有效阻断hIL6与hIL6R结合介导的抑制细胞增殖的效应，说明该抗体在细胞水平上具有中和活性。具有中和活性的抗hIL6R单克隆抗体将成为进一步开发临床治疗性药物的候选抗体。中和活性检测实验以半数有效浓度(concentration for 50% of maximum effect,EC50)作为抗体中和能力的判断依据。本发明还提供一种基于所述hIL6R鼠单克隆抗体建立的hIL6R酶联免疫检测方法(ELISA)。该ELISA使用的是双抗夹心酶联免疫检测方法，捕获抗体为本发明的hIL6R鼠单克隆抗体,检测抗体为hIL6R多克隆抗体，标准样品为体外重组表达的hIL6R。检测的灵敏度为0. 031ng/ml，所建立的ELISA方法可用于hIL6R的特异性检测。
图1 hIL6R鼠单克隆抗体亲和力测定图2 hIL6R鼠单克隆抗体在蛋白水平上的中和活性的检测图3 hIL6R鼠单克隆抗体在细胞水平上的中和活性的检测图4基于抗hIL6R鼠单克隆抗体建立的酶联免疫检测方法的标准曲线
具体实施例方式实施例1、hIL6R鼠单克隆抗体的制备l、hIL6R鼠单克隆抗体的制备I)动物免疫为了获得可以识别hIL6R蛋白的鼠单克隆抗体，该发明以北京义翘神州生物技术有限公司生产的重组hIL6R胞外区片段为免疫原，免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫50 ii g，首次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原与等量不完全弗氏佐剂制成乳化剂，加强免疫两次，三次免疫后测定血清效价，取血清效价高的小鼠用免疫原腹腔加强免疫一次，3天后取脾进行融合。2)细胞融合和克隆化取小鼠脾细胞，按5-10 I比例与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行混合，聚乙二醇法进行细胞融合，制备杂交瘤细胞。以重组hIL6R蛋白作为包被抗原，用ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔，通过有限稀释进行克隆化，直至得到稳定分泌hIL6R特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3)单克隆抗体的生产与纯化选取杂交瘤细胞株，利用培养瓶或生物反应器进行细胞培养，收集细胞培养上清，利用蛋白A进行亲和纯化，对抗体进行鉴定后分装，于-20°C低温保存备用。实施例2、抗体的筛选和鉴定获得多株hIL6R鼠单克隆抗体后，首先对抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及中和活性的检测抗体亲和力的鉴定对获得的鼠单克隆抗体进行抗体亲和力的初步鉴定，使用Octet生物分子相互作用分析仪对所筛抗体的亲和力进行验证，使用Fortebio公司的Octet生物分子相互作用分 析仪进行hIL6R单克隆抗体的亲和力测定。其中使用到的材料为生物素标记的重组hIL6R蛋白，使用浓度为30ii g/ml。通过条件摸索后将抗体稀释4个不同浓度，3. 33nM，1. 67nM，0. 8333nM和0. 4167nM。通过比较各个抗体亲和力，从中选择亲和力较好的抗体。抗体中和活性检测抗体的中和活性检测是抗体对蛋白或细胞的生物活性的干涉能力的评价。通过体外试验，检测hIL6R单克隆抗体对重组表达的hIL6R蛋白和细胞表面的hIL6R的中和能力，从而来检测各株抗体的的中和活性。通过ELISA方法来检测hIL6R单克隆抗体对重组表达hIL6R蛋白的中和能力(I)把重组表达的hIL6蛋白包被在酶标板上g/ml, IOOu I/孔,4°C孵育过夜,然后加A 300 u I封闭液进行封闭，常温孵育Ih后洗板三遍；(2)加入生物素标记的重组hIL6R蛋白，浓度为0. 2 y g/ml, 50 u I/孔，以样品稀释液为空白对照；然后在孔中再加入用样品稀释液稀释的hIL6R鼠单克隆抗体，浓度分别为400 ii g/ml，IOOii g/ml，50 ii g/ml，25 ii g/ml, 12. 5 u g/ml, 6. 25 u g/ml, 3. 125 u g/ml,1. 563 u g/ml, 0. 781 u g/ml, 0. 391 u g/ml,0. 195 u g/ml,0. 098u g/ml,0. 049u g/ml,0. 024 u g/ml,0. 012 u g/ml,0. 003u g/ml,0 u g/ml,同时以相同浓度的同亚型人IgG(hlgGl)为对照,50 ii I/孔,常温孵育Ih后洗板三遍；
(3)加入链霉素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，100 u I/孔，常温孵育Ih后洗板三遍；⑷加入显色液，100 u I/孔，常温显色15分钟后终止，450nm下测定吸光值。ELISA使用的缓冲液包被缓冲液为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为含2% FBS的Tris缓冲液；样品稀释液为含有0. 1%牛血清白蛋白(FBS)的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有2%吐温的Tris缓冲液或含有2%吐温的磷酸盐缓冲液；显色液由A液和B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为四甲基联苯；终止液为2mol/L的硫酸。通过细胞增殖抑制实验来检测hIL6R单克隆抗体对细胞水平上hIL6R的中和能力(I) IOOg离心5min收集Ml小鼠白血病细胞，用含10% FBS的1640培养基清洗细胞一遍后，以每孔2 X IO4个细胞接种于96孔细胞培养板上，50 Ul/孔，置于C02培养箱中孵育待用；(2)以含10% FBS的1640作为稀释液稀释样品，将重组hIL6和重组hIL6R混合，然后取IOul混合物加入到孔中，使重组hIL6和重组hIL6R的终浓度分别为100ng/ml和50ng/ml。37度培养箱中孵育Ih ； (3)加入以含10% FBS的1640稀释得到的hIL6R单克隆抗体，浓度依次是 100u g/ml,20u g/ml,4u g/ml,0. 8u g/ml,0. 16u g/ml,0. 032u g/ml,0. 0064u g/ml，0. 0013ii g/ml，0ii g/ml，50iil/孔，然后置于 37°C 孵育 72h ;(4)加入 MTT，15 iil/孔，孵育4h ;(5)加入三联液(10%的十二烷基硫酸钠、5%异丁醇和0. 1% HCl，充分溶解均匀后得到三联液)，100 iil/孔，孵育过夜，570nm和630nm分别读取吸光值，两者的差值为测定的结果，反应细胞的状况。根据多株抗体的亲和力及中和活性的初步鉴定结果，筛选获得一株本发明所述的具有高亲和力的中和活性抗体，其杂交瘤细胞株的克隆号为8C1D8B5 本发明所述抗体的亲和力测定结果见图1，结果显示所述hIL6R鼠单克隆抗体与重组hIL6R蛋白结合的亲和常数为1. 72X10_nM，说明该抗体与重组hIL6R蛋白具有很好的亲和力。本发明所述抗体在蛋白水平上的中和活性测定结果见图2，随着hIL6R鼠单克隆抗体浓度的增加，对hIL6R和IL6的结合的抑制强度也逐渐增加，而同亚型的对照抗体对hIL6R和IL6的结合没有表现出这种抑制效应，说明hIL6R鼠单克隆抗体可以有效的阻断hIL6和hIL6R的结合，证明所述抗体在蛋白水平上具有中和作用，EC50为0. 5-0. 6 u g/ml 0本发明所述抗体在细胞水平上的中和活性测定结果见图3，hIL6和hIL6R的结合对Ml细胞的增殖是起到抑制作用，而随着体系中hIL6R单克隆抗体的浓度的增加，这种抑制效应逐渐被阻断，细胞得以增殖，而同亚型的对照抗体没有表现出这种阻断抑制的效应。说明hIL6R单克隆抗体有效的阻断了 hIL6和hIL6R结合介导的细胞信号转导，证明所述抗体在细胞水平上具有中和活性，EC50为0. 15 ii g/ml。实施例3、单克隆抗体基因的获得收集状态良好的杂交瘤细胞,加入TRIzol提取总RNA，通过电泳检测质量，通过UV测定浓度。然后使用商业试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20°C冻存备用。根据参考文献(YingW et al. , BMC Bioinformatics. 2006 ；7 (Suppl 4) :S9),采用专业领域人员已知的技术方案设计引物，以cDNA为模板分别PCR获得抗体的轻链和重链片段。将轻链和重链片段插入到 pcDNA3T 载体上，构建 pcDNA3-ant1-hIL6R-L 和 pcDNA3-anti_hIL6R-H 载体。转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行测序鉴定，分析测序结果，获得正确的轻链和重链氨基酸序列。测定结果及序列分析显示该抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :1;重链氨基酸序列为SEQ ID NO :2 ;轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :3，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :4 ;轻链上互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO 5,SEQID NO 6, SEQ ID NO 7 ;重链上互补决定区CDRl，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10o 详见序列表。
实施例4、基于抗体建立酶联免疫检测方法酶联免疫检测方法的具体操作步骤(I)使用碳酸盐缓冲液(pH9. 6,0. 05M)将捕获抗体，抗hIL6R鼠单克隆抗体进行包被,4度孵育过夜；洗漆液洗板；用含有2%牛血清白蛋白的Tris缓冲液进行封闭；(2)将标准样品(重组hIL6R蛋白)、待测样用磷酸盐缓冲液(含O.1 %牛血清白蛋白)稀释后加入到酶标板中，常温条件孵育2h ;用洗涤液洗板；(3)将磷酸盐缓冲液稀释后的生物素标记的检测抗体，抗hIL6R多克隆抗体加入到板中，常温条件下孵育Ih ;用洗涤液洗板；(4)加入亲和素标记的HRP，常温条件下孵育Ih ;用洗涤液洗板；(5)加入显色液,常温显色20min,终止显色,450nm下测定吸光值。酶联免疫检测方法的条件摸索通过正交试验方法，综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择抗体的包被浓度为2 μ g/ml，生物素标记的检测抗体2 μ g/mlo酶联免疫检测方法的灵敏度加入的样品为重组hIL6R蛋白，样品用含O. 1% BSA的磷酸盐缓冲液稀释成 lng/ml,0. 5ng/ml,0. 25ng/ml, O. 125ng/ml,0. 063ng/ml,0. 031ng/ml，0. 016ng/ml，0ng/ml，加样量为100 μ I/孔。以hIL6R浓度为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线，y =1. 70 3x+0. 016，R2 = O. 989，见图4，。以吸光值的平均值减去3倍标准误差大于空白对照吸光值平均值加上3倍标准误差的最低hIL6R浓度为酶联免疫检测方法的灵敏度。实验结果显示所建立的hIL6R酶联免疫方法的检测灵敏度达到O. 031ng/ml，所建立的hIL6R酶联免疫检测方法有很高的灵敏度。
权利要求
1.一种高亲和力的人白细胞介素-6受体(human interleukin-6 receptor, hIL6R)抗体，其特征在于轻链上互补决定区⑶R1，⑶R2，⑶R3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO :5，SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7 ;重链上互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别为SEQID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10。
2.权利要求1所述的抗体，其轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO :3，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :4。
3.权利要求1所述的抗体，其轻链氨基酸序列为SEQID NO:1 ;重链氨基酸序列为SEQID NO :2。
4.权利要求1所述的抗体为单克隆抗体。
5.权利要求4所述的抗体，其特征为轻链恒定区为K链，重链恒定区为IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgM, IgAl, IgA2，IgD 或 IgE 型。
6.权利要求4所述的抗体，其特征为轻链恒定区为K链，重链恒定区为IgGl。
7.权利要求4所述的抗体为鼠单克隆抗体。
8.权利要求7所述的鼠单克隆抗体，其制备方法为杂交瘤方法。
9.权利要求1所述的抗体，其特征在于能有效阻断由hIL6R和hIL6结合而介导的信号途径，具有细胞水平上的中和活性。
10.权利要求1所述的抗体，其特征在于能有效阻断重组hIL6R蛋白和重组hIL6蛋白在体外的结合，具有蛋白水平上的中和活性。
11.权利要求1所述的抗体在建立高灵敏度的hIL6R的双抗夹心酶联免疫检测方法中的应用。
12.权利要求1所述的抗体在制备诊断和/或IL6/IL6R介导的相关疾病的制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种高亲和力的人白细胞介素-6受体(hIL6R)鼠单克隆抗体，抗体能特异性识别重组hIL6R蛋白，有效阻断重组hIL6R和重组IL6的结合。基于该抗体建立了高灵敏度的双抗夹心酶联免疫检测方法，可用于IL6R的特异性检测。抗体可特异性识别细胞膜上的hIL6R，能有效阻断细胞上hIL6R与IL6的结合介导的细胞增殖抑制效应。所述抗体为进一步开发临床治疗性药物提供了候选抗体。
文档编号A61P17/06GK103059137SQ20111032242
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者谢良志, 张 杰, 赵静, 孙春昀, 贺正颖, 胡萍, 王加兰, 李莉 申请人:神州细胞工程有限公司