专利名称：靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用。
背景技术：
血液肿瘤是发病率较高的恶性肿瘤之一，每年全国约有10万初发病人，严重危害人们、尤其是青少年的健康。T细胞肿瘤是血液肿瘤的一种主要类型，主要由于T细胞恶性克隆增殖而形成，包括多种类型的T细胞白血病和淋巴瘤，多数恶性程度高，治疗效果差， 预后不良。临床治疗上一直存在难治疗、耐药和易复发等难题，因此寻找更有效和特异的治疗方案一直是研究者的一个重要目标。随着对肿瘤细胞分子特点的逐渐明确，不断发现肿瘤T细胞特异的分子，设计和研制有效的靶向治疗药物，成为提高T细胞肿瘤治疗效果的一个重要手段。PPP2R5C基因是在1996年被发现并克隆出来的。是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的一个亚单位，在调节细胞增殖、分化和转化等过程中具有重要作用，目前研究认为其属于一种抑癌基因。近期研究提示其表达模式的改变与细胞恶性转化相关，我们的前期研究也发现 PPP2R5C在T细胞肿瘤中有异常高表达情况。近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。靶向针对 PPP2R5C基因的siRNA序列对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的 siRNA，名称为 PPP2R5C-siRNA991。本发明的另一目的在于提供上述PPP2R5C_siRNA991的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T 细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991，核糖核苷酸序列如下所示正义链5，-CA⑶G GUGAU GGCAC UUCUC AAAUA-3，反义链5，-UAUUU GAGAA GUGCC AUCAC CACUG-3，。所述的靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C_siRNA991用于制备抑制PPP2R5C基因表达的制剂。所述靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA应用于制备治疗T细胞肿瘤的药物。所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果1、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表达，mRNA的下调程度达到2 4倍，蛋白表达明显得到抑制，如图2和图3所示。2、本发明所提供的PPP2R5C-siRNA991能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖，如图4所
7J\ ο3、本发明所提供的PPP2R5C_siRNA991对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。
图1是实施例1中通过流式细胞仪检测Molt-4细胞转染效率图，其中A为转染Alexa Red Oligo的柱形图；B为对照组的柱形图。图2是实施例2的实验组和对照组的实时定量PCR结果图。图3是实施例2的实验组和对照组的PPP2R5C蛋白水平变化Wfestern Blot图(RNA 干扰后48h)。图4是通过Armexin V/PI双染后流式细胞仪得到的实验组和对照组的细胞凋亡图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1SiRNA的合成和转染T淋巴细胞白血病细胞株(Molt_4)(购自中科院上海细胞所)细胞条件的稳定，具体步骤如下(1)设计和得到siRNA在 GenBank (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)里查找 PPP2R5C 基因序列(ACCESSION NM_178587)，然后根据 hvitrogen 公司(www.invitrogen.com)提供的Stealth RNAi设计法则，在线设计针对PPP2R5C的siRNA。本发明所涉及的靶向抑制PPP2R5C基因表达的siRNA是从PPP2R5C基因序列991bp开始的25nt siRNA (称为siRNA-991)，同时设计与目的基因序列无同源性的无关序列siRNA (non-silencing scrambled control, SC,25nt)为对照组，siRNA均由美国hvitrogen公司化学合成。siRNA-991 的序列如下正义链序列5，-CAGUG⑶GAUGGCACUUCUCAAAUA-3，；反义链序列5，-UAUUUGAGAA⑶GCCAUCACCACUG-3，。无关序列siRNA的序列如下正义链序列5，-UAGUCUACCUAGCUUAACCCAGUAA-3，；反义链序列5，-UUACUGG⑶UAAGCUAGGUAGACUA-3，。(2)准备处于对数生长期的Molt-4细胞将Molt-4细胞接种于含体积分数10%新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链PPP2R5Cf5 ·- GTAATAAAGCGGGCAGCAGG -3 ’
PPP2R5Cb5'- CAAAGTCAAAGAGGACGCAACA -3'
β2Μ5'- CAGCAAGGACTGGTCTTTCTAT -3 ‘
β2Μ5'- GCGGCATCTTCAAACCTC -3 ‘
霉素的RPMI1640培养基中，在含体积百分数5% CO2的培养箱37°C连续培养，2 3天传代一次，得到处于对数生长期的Molt-4细胞。(3)PPP2R5C-siRNA991 转染 Molt-4 细胞A、收集2. 5 X IO6个Molt-4细胞，200g离心lOmin，完全去除上清；B、用 100 μ 1 预热至室温的 Nucleofector Solution 和 Supplement 混合液 (Amaxa，德国)悬浮细胞；C、加入 IOOnM Alexa Red Oligo (Invitrogen，美国)，混勻后加入核转杯(Amaxa, 德国)，启动Molt-4特异性程序C-005 ；同时设置对照组，对照组为与转染Alexa Red Oligo 的步骤相同，但是没有加入Alexa Red Oligo ；D、程序完成后立刻用核转染试剂盒(Amaxa，德国)里配套的移液器将转染后的细胞液接种于培养瓶中，终体积为5ml ；E、放入培养箱10小时后利用荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光值，分析转染效率。通过荧光显微镜和流式细胞仪检测的结果如图1所示，可见通过上述转染方法的转染效率稳定在56. 2 士 14. 14%。实施例2将siRNA-991转染Molt_4细胞后，检测PPP2R5C基因在mRNA和蛋白水平的表达， 明确其干扰效应。(1)实验分组实验组为转染siRNA-991，对照组分别为无关序列对照组(SC)、转染条件对照组(MOCK)和空白对照组(NC)，实验方法同实施例1步骤(3)，各组的siRNA量均为3 μ g。转染条件对照组系不加入siRNA，其余处理条件同实验组，空白对照组是未经任何实验处理的细胞。(2)荧光实时定量PCR检测分别收集各组转染后24h、4 !和72h的细胞，按照 TRIZol试剂盒(invitrogen，USA)说明书操作步骤提取RNA，并使用AMMLV (promega，USA) 和0LIG0 dT合成cDNA (根据AMMLV的说明书操作)。应用于荧光实时定量PCR的引物序列见表1，以β 2M基因作为内参照。总反应体积为20 μ 1，包括Real Master Mix 9yL，上、下游引物的终浓度分别为0. 5 μ mol/L以及1 μ lcDNA。在95°C、3min变性后，共进行40循环扩增，每一循环包括95°C、10s和62°C、30s。采用相对定量法(2"ctX100%, ACt = Ct目的 Η -Ct # Η)计算PPP2R5C mRNA的相对表达量。结果显示，转染后24h、4 i和72h，与各对照组相比，siRNA-991组PPP2R5C的mRNA表达水平均明显下调，下调倍数约为2 4倍不等(如表2和图2所示)。表1应用于实时定量PCR的引物序列
^mMi~
5 5 二
弓弓弓弓游游游游上下上下
5
表2 实时定量PCR检测转染后PPP2R5C基因mRNA水平变化
权利要求
1.一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991，其特征在于其核糖核酸序列如下正义链5，-CA⑶G GUGAU GGCAC UUCUC AAAUA-3，； 反义链5’ -UAUUU GAGAA GUGCC AUCAC CACUG-3，。
2.权利要求1所述靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991 的应用，其特征在于所述的PPP2R5C-siRNA991用于制备抑制PPP2R5C基因表达的制剂或用于制备治疗T细胞肿瘤的药物。
3.根据权利要求2所述靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的 PPP2R5C-siRNA991的应用，其特征在于所述T细胞肿瘤为T细胞白血病。
全文摘要
本发明公开了一种靶向抑制PPP2R5C基因表达和肿瘤T细胞增殖的PPP2R5C-siRNA991及其应用。PPP2R5C-siRNA991的正义链为5’-CAGUGGUGAUGGCACUUCUCAAAUA -3’；反义链为5’-UAUUUGAGAAGUGCCAUCACCACUG-3’。PPP2R5C-siRNA991能高效抑制PPP2R5C基因的表达，mRNA的下调程度达到2～4倍，蛋白表达明显得到抑制；同时其能有效抑制肿瘤性T细胞的增殖。本发明所提供的siRNA对于开发新的抗T细胞肿瘤基因药物和提高T细胞肿瘤的治疗效果有重要的意义，具有很大的应用前景和经济价值。
文档编号A61P35/02GK102382828SQ20111033783
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者刘思初, 李扬秋, 李萡, 杨力建, 沈琦, 郑海涛, 陈宇, 陈少华 申请人:暨南大学