专利名称：两亲性氨基酸嵌段共聚物、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，涉及一种生物可降解性两亲性氨基酸嵌段共聚物作为药物载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。
背景技术：
现代药物传递系统的研究离不开新型材料的使用，特别是药用高分子材料，壳聚糖、透明质酸、明胶、淀粉、海藻酸钠、白蛋白、纤维素、聚乳酸、聚乙烯醇、丙烯酸类、聚酯、聚醚类等已在药剂学中展现出独特的优势。但生物相容性、生物降解性和安全性制约了药用高分子材料的使用，开发安全新型功能的高分子材料属于药剂学研究的热点领域。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成机体营养所需蛋白质的基本物质。选用一种或多种氨基酸合成聚合物能在体内酶的作用下降解为氨基酸，生物相容性好，安全无毒，聚氨基酸的研究已受到广泛的关注。目前聚氨基酸作为药物载体的研究主要集中在聚氨基酸-药物偶联物、聚氨基酸复合载体、氨基酸共聚物载体几个方面。聚氨基酸与药物通过化学键形成偶联物，在体内酸性环境及酶的作用下化学键断裂释放药物，达到缓释、靶向的作用，并且可以降低药物的毒性。聚氨基酸与其它高分子材料形成复合载体以克服单一材料的不足以及实现新的功能。 氨基酸共聚物亦可形成两亲性材料作为药物载体，以提高药物溶解性能，延长体内循环时间和实现靶向目的。1.聚氨基酸-药物偶联物聚氨基酸含有活性氨基和羧基端，可以通过共价键与药物结合，形成偶联物，该偶联物在体内特定酸性环境及酶的作用下化学键断裂释放药物，达到缓释、靶向的作用，同时由于聚氨基酸的保护作用，提高药物的稳定性，并且可以降低药物的毒性。聚氨基酸-药物偶联物研究起源于上世纪七十年代初，美国犹它大学kim领导的课题组就成功地合成了聚谷氨酸材料，用氨基丙醇为侧链基，以共价结合方式将留体避孕药炔诺酮键入材料，并进行了体外及大鼠体内释放试验，其释放时间达300d。实验结果表明，聚谷氨酸在降解后可降解为单体并不在生物体内滞留。CN1321696A, CN101209350A, CN101707869A, US6262107, US6515017, US6730699, US6884817公开的均是采用聚氨基酸与药物通过化学键偶合制备偶联物的方法。由于该类载体是通过药物与聚氨基酸共价键偶联，针对每一药物都需要设计合适的反应条件，并完成聚氨基酸-药物偶联物的制备、纯化，增加了实施的难度、药物损失大、提高了成本。2.聚氨基酸复合载体聚氨基酸与常用高分子材料通过化学键或物理作用结合形成复合载体，可以实现缓释、降低毒性、提高生物药物的转染率、靶向、延长体内循环时间的目的。CN101619132B公开的聚氨基酸三嵌段共聚物可以用来制备凝胶。此方法制备的药物制剂不适于静脉注射。US20030232968A1公开的制备树枝状的聚氨基酸，制备工艺复杂，且树枝状结构较线性结构亦产生免疫反应。US20030147958A1公开的将聚氨基酸与亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)偶联， 提高转染率，降低毒性。另有大量文献报道采用PEG与聚氨基酸偶联作为药物载体。 如Prompruk K 等(Prompruk K, Govender T, Zhang S, et al. Synthesis of a novel PEG-block-poly(aspartic acid-statphenylalanine)copolymer shows potential for formation of a micellar drug carrier[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2005,297(1-2) :242 253)以PEG为亲水段，天冬氨酸与苯丙氨酸(Phenylalanine) 随机序列合成的聚合物作为疏水段，形成嵌段共聚物，天冬氨酸可以通过离子作用包载药物，而苯丙氨酸的疏水性或者芳环相互作用有利于胶束成核，减缓胶束解离，延缓药 白勺 # 方文；Kim SH φ (Kim SH, Jeong JH, Joe CO, et al. Folate receptor mediated intracellular protein delivery using PLL-PEG-F0L conjugate[J]. Journal of Controlled Release，2005，103 (3) :625 634.)制备聚赖氨酸PEG两亲性嵌段共聚物，并以叶酸修饰PEG，形成带正电的PLL-PEG-F0L聚合物；Shu SJ等(Shu SJ, Zhang XG. , Teng DY, et al.Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly (L-aspartic acid)-polyethylene glycol for controlled protein release [J] · Carbohydr-ate Research, 2009, 344 (10) :1197 1204.)制备水溶性壳聚糖-聚天冬氨酸-PEG (WSC-Pasp-PEG)复合物。采用聚氨基酸与PEG制备复合载体可以达到靶向、提高载药量、缓释、体内长循环等作用，但PEG修饰的过程增加了制剂的成本和产生了杂质，PEG修饰后在动物模型反复用药后表现出肾小管空泡，另外，应用PEG后在动物和人体也会产生抗体。采用更加安全的亲水性聚氨基酸来替代PEG也可以达到长循环作。Romberg B 等(Romberg B, Metselaar JM, Baranyi L, et al.Poly(amino acid) s !Promising enzymeatically degradable stealth coatings for liposomes[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 331 (2) :186 189.)分别用 5% (摩尔比)聚天冬氨酸(PHEA，分子量3000Da)、聚谷氨酸(PHEG，分子量4000Da)修饰脂质体，并比较其半衰期， 未包裹脂质体半衰期9.几，用聚天冬氨酸、聚谷氨酸包裹的脂质体半衰期分别为14. 4h和 11. 9h。采用亲水性聚氨基酸修饰脂质体可以达到长循环作用，但是修饰的过程增加了工艺的复杂性，制剂的稳定性也很难达到要求。3.氨基酸共聚物载体采用一种或几种氨基酸合成氨基酸共聚物作为药物载体，由于代谢产物为氨基酸对人体无毒，比其它高分子材料具有更高的安全性，氨基酸来源丰富，价格便宜，组成人体氨基酸有20种，可以根据需要选择，满足不同药物载体的需要，聚氨基酸分子链上具有很多活性基团(如氨基、羧基)，药物或活性物质能方便与之结合。该类载体相比聚氨基酸-药物偶联物制备简单、不需要复杂纯化过程，与聚氨基酸复合载体相比简化了工艺、制剂稳定、药物载药量高、安全性更高。因此氨基酸共聚物作为药物载体也越来越受到关注。韩亚冬等(韩亚冬，夏加亮，何盼，等.聚L-谷氨酸担载胰岛素口服微球的制备与评价[J].高等学校化学学报，2009，30 (12) :2521 25M.)以聚L-谷氨酸为载体材料，采用无水乳液法制备口服胰岛素微球，微球直径在5 20 μ m，载药质量分数为5% 9%。但该方法载药量低，制备的粒径在5 20 μ m不适合静脉给药。
Akagi T 等(Akagi T，Kaneko T，Kida T，et al. Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles based on poly(g-glutamic acid) with 1-phenylalanine as a protein carrier[J]. Journal of Controlled Release， 2005,108(2-3) :2 236.)以γ-聚谷氨酸(Y-PGA)与L-苯丙氨酸乙酯接枝共聚，该载体将卵清蛋白包裹制备纳米粒。该方法药物的包封率在50%以下，包封率低，冷冻干燥后易发生聚集。Kima MS 等(Kima MS, Dayananda K，Choi ΕΚ, et al. Synthesis and characterization of poly(L-Glutamic acid)-block-poly-(L-phenylalanine) [J]. Polymer, 2009, 50 (10) :2252 2257)以L-谷氨酸Y -苄酯与L-苯丙氨酸合成嵌段供聚物，经脱去苄酯后形成两亲性共聚物制备泡囊，该载体在不同PH条件下形成不同粒径的泡囊。该载体没有作为药物载体的应用报道，另外该载体在不同PH条件下形成的泡囊粒径不同，虽然可以利用这个性质设计PH敏感性药物载体，但也说明了该载体存在pH不稳定性， 因为大多数药物只有在某一 PH范围内才稳定，这就要求制剂的制备、储存时要控制pH，但在该PH条件下不一定能发挥该载体的最大优势，另外，在制剂制备、储存过程中也会发生 PH的波动，pH敏感性药物载体会产生稳定性问题。可见，目前采用聚氨基酸作为药物载体存在工艺繁琐、结构复杂易产生免疫原性， 形成的纳米载体包载药物有限，制剂稳定性不佳等缺陷。组成人体蛋白的氨基酸有二十种，发明者发现，若采用亲水性的L-天冬氨酸与疏水性L-苯丙氨酸制备两亲性氨基酸嵌段共聚物，在水溶液中自组装形成纳米胶束，制备方法简单；该两亲性氨基酸嵌段共聚物具有PH稳定性；另外在疏水基团作用下，可以显著提高药物的载药量，稳定时间也显著延长。本发明采用L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸制备两亲性氨基酸嵌段共聚物，自组装纳米胶束未见任何文献和专利报道。
发明内容
本发明的目的针对上述问题提供一种以L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐和L-苯丙氨酸环内酸酐作为起始原料，通过聚合反应得到临界胶束浓度低、载药量高、稳定性好、不受PH影响的药物增溶载体。本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。为达到上述目的，本发明提供一种新型药物增溶载体，该载体采用聚天冬氨酸作为亲水链，聚苯丙氨酸作为疏水链，使其具有两亲性质，在水介质中可自组装为纳米胶束。所述的药物增溶载体的制备方法，包括下列步骤将L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-苯丙氨酸环内酸酐，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥，即得天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；或先将L-苯丙氨酸环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥，即得天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；称取天冬氨酸苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物，加入浓度为0. 5 2Μ的NaOH溶液，室温搅拌1 4h，溶液经透析袋透析后干燥，即得两亲性氨基酸嵌段共聚物。所述的药物增溶载体，其中L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸分子个数比为1 5 5 I0所述的药物增溶载体，其分子量为IKDa 50KDa。所述的药物增溶载体的应用，其特征在于可以用于血管内或肌肉注射或口服或腔道或外用的药学活性或药理活性分子的载体。其中药学活性或药理活性分子选自维甲酸类、紫杉醇类、喜树碱类、环孢素类、黄酮类、小檗碱类、二氢吡啶类、长春碱类、鬼白毒素类、 蒽醌类抗肿瘤药物、留体类或非留体抗炎药物、抗生素、心血管药物、抗病毒药物、抗真菌药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。该药物增溶载体的制备方法包括以下步骤两亲性氨基酸嵌段共聚物与水按重量比为1 50 1000的比例溶解，得到两亲性氨基酸嵌段共聚物的纳米胶束；将治疗量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性氨基酸嵌段共聚物纳米胶束混合后，经超声或高压勻质处理，溶剂用透析袋透析或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，干燥，制得粒径为10 IOOOnm的纳米胶束。具体方案如下一、两亲性氨基酸嵌段共聚物的合成方法如下1.聚天冬氨酸-β苄酯或聚苯丙氨酸的合成L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解，加入活性端基氨，室温搅拌12 72h，加入无水乙醇或无水乙醚，收集沉淀，干燥，即得聚天冬氨酸-β苄酯；或L-苯丙氨酸环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解，加入活性端基氨，室温搅拌12 72h，加入无水乙醇或无水乙醚，收集沉淀，干燥，即得聚苯丙氨酸。2.两亲性天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物的合成聚天冬氨酸-β苄酯用二甲基甲酰胺溶解加入L-苯丙氨酸环内酸酐室温搅拌 12 72h，加入无水乙醇或无水乙醚，收集沉淀干燥，即得两亲性天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物；或聚苯丙氨酸二甲基甲酰胺溶解加入L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐室温搅拌 12 72h，加入无水乙醇或无水乙醚，收集沉淀，干燥，即得两亲性天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物。3.两亲性氨基酸嵌段共聚物的合成称取两亲性天冬氨酸-β苄酯-苯丙氨酸嵌段共聚物，加入0. 5 2Μ NaOH溶液室温搅拌1 4h，加入透析袋透析，干燥，即得两亲性氨基酸嵌段共聚物。二、两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束制备方法按每ImL水中溶解1 20mg两亲性氨基酸嵌段共聚物的比例，将制得的两亲性氨基酸嵌段共聚物溶于水中，经超声处理(超声处理的频率及处理时间均是本领域普通技术人员所公知的，下同)，制备成粒径为10 IOOOnm的两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束。三、以两亲性氨基酸嵌段共聚物为载体，制备含难溶性药物的组合物两亲性氨基酸嵌段共聚物溶于水后，将难溶性药物用适当溶剂(药学上使用的能溶解该药物的溶解)溶解，与两亲性氨基酸嵌段共聚物溶液经超声处理，制得粒径10 IOOOnm的聚合物胶束。四、采用两亲性氨基酸嵌段共聚物作为药物载体制备药物组合物，对难溶性药物有增溶作用。可使用该两亲性氨基酸嵌段共聚物作为载体的难溶性药物包括全反式维甲酸、 紫杉醇、阿霉素、环孢素、喜树碱、羟基喜树碱、尼莫地平、替尼泊甙、依托泊甙、灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、萘普生，但并不局限于所列药物。本发明的有益效果一、较低的临界胶束浓度(Critical micelle concentrations,CMC):实施例 2 9中两亲性氨基酸嵌段共聚物的CMC皆在10 200mg/L范围内，预示它有极好的稀释稳定性。二、不受pH的影响采用两亲性氨基酸嵌段共聚物制备的空白胶束在pH3. 6、 Ph4. 0、pH4. 6、pH5. 0、pH5. 6、pH6. 0、pH6. 5、pH7. 0、pH7. 4、pH8. 0 溶液中粒径没有显著改变，
载药胶束粒径、载药量、稳定时间没有显著变化。三、对有机药物、水不溶性或难溶性药物和两亲性药物具有较好的负载，例如，对全反式维甲酸的负载高达31. (w/w)，对紫杉醇的负载高达观.4% (w/w)，对阿霉素的负载高达27. 5% (w/w)，对环孢素A的负载高达30. 4% (w/w)，对阿奇霉素的负载高达17. 4% (w/w)O四、良好的稳定性实施例中所制备的全反式维甲酸、紫杉醇、阿霉素、环孢菌素 A、阿奇霉素两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束，稀释至1 :3mg/ml，置于4°C和25°C，全反式维甲酸两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束稳定性分别>5d，其余25°C稳定性均> 3d。可见两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束不仅有极高的载药量，还具有非常优越的稳定性。五、本发明辅料亦可用于血管内或肌肉注射、口服、腔道或外用途径给药。本载体材料在体内降解为氨基酸，对人体安全。 综上所述，本发明采用组成人体蛋白的L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸，合成两亲性氨基酸嵌段共聚物，在水介质中自发形成纳米胶束，在体内具有良好的生物相容性、生物可降解性和稳定性，对药物有较好的负载。本发明研究的两亲性氨基酸嵌段共聚物在水介质中自发形成纳米胶束，不但可用于药物的包载，控制药物释放，而且由于其亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束结构，可以延长体内循环，减少网状内皮细胞的吞噬，增加肿瘤靶向，达到减少毒副作用，增加疗效的目的。本发明提供的两亲性氨基酸嵌段共聚物临界胶束浓度低、载药量高、药物包封率高、纳米胶束稳定。本辅料毒性小，可作为难溶性有机药物的载体，以纳米级分散体系用于血管内或肌肉注射、口服、腔道或外用途径给药。本发明制备方法简单，工艺成熟，适用于大规模连续生产。
图1 两亲性氨基酸嵌段共聚物通式图2 聚天冬氨酸- β苄酯红外图谱(实施例9)图3 聚天冬氨酸-β苄酯1H NMR图谱(实施例6)
图4 两亲性氨基酸嵌段共聚物红外图谱(实施例9)图5 两亲性氨基酸嵌段共聚物1HNMR图谱(实施例6)图6 两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束的粒径图谱。(实施例10)图7 载有全反式维甲酸的两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束的粒径图谱(实施例11)图8 两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束的电镜图谱(实施例10)图9 载有全反式维甲酸的两亲性氨基酸嵌段共聚物胶束的电镜图谱(实施例11)
具体实施例方式下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不局限本专利的权利范围。实施例1 :L_天冬氨酸-β苄酯环内酸酐及L-苯丙氨酸环内酸酐的制备参考文献(Prompruk K, Govender T, Zhang S, et al. Synthesis of a novel PEG-block-poly (aspartic acid-statphenylalanine)copolymer shows potential for formation of a micellar drug carrier[J]. International Journal ofPharmaceutics, 2005,297(1-2) :242-253.)进行。其中L-天冬氨酸-β苄酯及L-苯丙氨酸购自上海翰鸿化工股份有限公司，三光气购自上海晶纯试剂有限公司。(I)L-苯丙氨酸环内酸酐制备10gL_苯丙氨酸加入无水四氢呋喃100ml，磁搅拌， 升温至50°C，然后加入三光气15g，悬浊液变澄清后充氮气30min，以除去反应生成的氯化氢气体及剩余的光气，将反应液浓缩，倒入过量的无水正己烷中，充分结晶后过滤，用无水正己烷洗涤、干燥得粗品。将粗品用无水乙醚/正己烷重结晶得到鲜片状有光泽的白色针状晶体即为L-苯丙氨酸环内酸酐。产率85%。合成路线如下
权利要求
1.通式为式(I)的两亲性氨基酸嵌段共聚物，其中，m = 1 200的正整数；η = 1 150的正整数；X 为活性端基氨，Y为碱金属。
2.权利要求1所述的两亲性氨基酸嵌段共聚物，其特征在于m= 5 50的正整数，η =5 50的正整数，m与η之比为1 5 5 1 ；其分子量为
3.权利要求1所述的两亲性氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，所述X为正丙胺、正丁胺、 正戊胺或正己胺。
4.权利要求1所述的两亲性氨基酸嵌段共聚物的制备方法，该方法包括将L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室温条件下搅拌12 72h， 加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入 L-苯丙氨酸环内酸酐，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物， 收集沉淀，干燥，加入浓度为0. 5 2M的NaOH溶液，室温搅拌1 4h，溶液经透析袋透析后干燥，即得式(I)嵌段共聚物；或先将L-苯丙氨酸环内酸酐用二甲基甲酰胺溶解后加入活性端基氨，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀， 干燥后用二甲基甲酰胺溶解，再加入L-天冬氨酸-β苄酯环内酸酐，室温条件下搅拌12 72h，加入无水乙醚或无水乙醇沉淀反应产物，收集沉淀，干燥，加入浓度为0. 5 2M的NaOH 溶液，室温搅拌1 4h，溶液经透析袋透析，干燥，即得式(II)嵌段共聚物。
5.权利要求1所述的两亲性氨基酸嵌段共聚物在药物增溶中应用。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于所述的药物选自维甲酸类、紫杉醇类、喜树碱类、环孢素类、黄酮类、小檗碱类、二氢吡啶类、长春碱类、鬼白毒素类、蒽醌类抗肿瘤药物、 甾体类或非留体抗炎药物、抗生素、心血管药物、抗病毒药物、抗真菌药物、免疫调节剂中的任一物质或其衍生物。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于所述的药物选自全反式维甲酸、紫杉醇、阿奇霉素、阿霉素或环孢素A。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于该两亲性氨基酸嵌段共聚物药物增溶载体的制备方法包括以下步骤与水按重量比为1 50 1000的比例溶解，得到两亲性氨基酸嵌段共聚物的纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的有机药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述两亲性氨基酸嵌段共聚物纳米胶束混合后，经超声或高压勻质处理，溶剂用透析袋透析或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，干燥，制得粒径为10 IOOOnm 的纳米胶束。
全文摘要
本发明涉及两亲性氨基酸嵌段共聚物、制备方法及其应用。通式为式(I)的两亲性氨基酸嵌段共聚物及其盐，其中，m＝1～200的正整数；n＝1～150的正整数；X为活性端基氨，Y为碱金属。将一种氨基酸的环内酸酐与活性端基氨反应后再与另一种氨基酸的环内酸酐反应后用碱金属氢氧化物脱去苄基，可制得该嵌段聚合物。该聚合物制备的胶束临界胶束浓度低、不受pH影响、稳定性好、载药量高，可作为有机药物、水不溶性或难溶性和两亲性药物的载体，用于血管内或肌肉注射、口服、腔道或外用途径给药。本发明制备方法简单，工艺成熟，适用大规模连续生产。
文档编号A61K47/34GK102504245SQ20111034024
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者周建平, 姚静, 汤继辉, 石静波, 臧洪梅, 陈飞虎 申请人:中国药科大学, 安徽医科大学