专利名称：白蛋白修饰的pamam自组装转基因组合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及白蛋白修饰的PAMAM自组装转基因组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
随着对重大疾病的发病分子机制的深入了解和分子生物学技术的发展，基因治疗已经成为治疗许多疾病的一种潜在而有力的手段。目前基因传递载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。虽然病毒载体转染效率高，但由于病毒载体自身存在较多难以克服的缺点，如毒性，免疫原性，不能装载大的基因片段，生物安全性等问题，因此限制了其进一步的临床应用。非病毒载体安全可控，但转染效率低，缺乏靶向性。因此，如何实现目的基因安全、高效、靶向的传递成为了基因治疗领域的热点[Arm N Y Acad Sci. 2001,953 :26-30]。近年来随着纳米生物技术的兴起和发展，以纳米颗粒为基础的非病毒纳米基因传递系统的出现有望突破这一瓶颈，实现安全、高效、靶向的DNA传递。纳米基因递释系统以纳米颗粒作为基因转移载体，将DNA和RNA等治疗性基因片段包裹在纳米颗粒之中或者吸附在颗粒表面，同时利用颗粒表面偶联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，或纳米材料自身的特殊物理化学性质，如磁性、光学性能、被动靶向性等，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性基因治疗 [Proc 28th Int Symp on Contr Rel of Bioact Mater，2001，7095]。其中新型的树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其独特的分子结构和表面性质， 成为了治疗性基因载体研究的热点。以末端为胺基的PAMAM树枝状大分子为例，它在生理 PH条件下具有很好的溶解性；由于能够通过其所带的阳离子和DNA所带的阴离子的静电相互作用，不但可以实现更多数量基因的运载，提高转染效率；而且体系稳定，非常适合作为 DNA的载体，能有效地在不同的细胞类型间转移遗传物质；可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中的整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；能够保护目的基因不受体内血浆或组织细胞中各种酶的破坏，因而可以实现体内的有效转染[Proc. Natl. Acad. Sci.USA,93 4897-4902]。众多研究表明，PAMAM纳米基因递释系统在体外转染中表现良好的应用前景，但 PAMAM作为纳米基因递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决1.转染效率相对较低；2.在体内环境下，PAMAM可以非特异性的结合大量的负电大分子和红细胞，影响转染效率并且发生溶血现象；3.实现PAMAM纳米基因递释系统的靶向性。为了解决上述问题，目前研究多直接在PAMAM分子上进行修饰，如在PAMAM表面修饰鸟氨酸等残基[Int J Wiarm，2010，392 :294-303]，增强PAMAM分子表面正电性以增强转染效率，但此方法在增强过多正电性的同时，也提高了细胞毒性；另一方面，对PAMAM表面修饰PEG[Nanotechnology，2009，20 105103]，以提高生物相容性，减少非特异性的结合血浆中的负电大分子和红细胞，另外，在PEG末端修饰特定蛋白如乳铁蛋白[Biomaterials， 2008，29 (2) =238-246]，以实现组织靶向性，但PEG的修饰增加了 PAMAM分子和DNA分子结合的空间位阻，降低了转染效率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于转基因的组合物。本发明所提供的用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、白蛋白和核酸复合制成。所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为6909-28拟6。所述白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。所述核酸为含有待转基因的重组质粒或待转基因。所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的正电荷与所述核酸的负电荷的比值为 1 1-10 1。所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述白蛋白的质量比为7 0. 002-7 20。所述聚酰胺-胺树枝状聚合物为PAMAM 末端带有氨基，以乙二胺为核，3. 0代(购自Sigma-Aldrich，产品目录号412422，规格5g，数均分子量为6909)；末端带有氨基，以乙二胺为核，4. 0代(购自Sigma-Aldrich，产品目录号=412449,规格IOg,数均分子量为 14215 ；末端带有氨基，以乙二胺为核，5.0代(购自Sigma-Aldrich，产品目录号=536709, 规格5g，数均分子量为观826)。所述组合物是按照下述的方法制备得到的。本发明另一个目的是提供一种制备所述用于转基因的组合物的方法。本发明所提供的制备所述用于转基因的组合物的方法，包括如下步骤将末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与核酸混合后，再加入 opti-MEM培养基，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物；再向所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物中加入白蛋白，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物、白蛋白和核酸的复合物，即得到所述用于转基因的组合物。所述用于转基因的组合物在转基因中的应用或在制备基因治疗药物中的应用也属于本发明的保护范围。本发明通过自组装的方法形成白蛋白修饰的PAMAM载体作为基因递送载体，设计制备内层目的基因片段，外层PAMAM和白蛋白的类似病毒结构的仿生结构，通过以下几个方面提高基因的递送效率并有效降低对机体的不良作用1、利用PAMAM分子对DNA良好的包裹性能，可有效保护其免受酶解破坏，并可通过遮蔽其与非靶细胞作用达到降低毒副作用的目的；2、通过白蛋白对PAMAM的修饰，可降低载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；3、利用白蛋白与细胞特异性受体介导的内吞作用，提高载体对细胞的靶向性，最大限度地降低非靶细胞的摄入，可在提高有效性的同时降低毒副作用；4、通过白蛋白对PAMAM的修饰，还能提高其生物相容性，从而降低其在体内经免疫调理介导被网状内皮系统清除的可能性，提高其体内循环时间。
图1为制备的不同质量比的HSA/PAMAM/DNA复合物的体外转染实验结果。图2为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物的透射电镜图(放大倍数60000X)。
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图3为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果。图4为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物的DNase I消化实验结果。图5为制备的HSA/PAMAM/DNA细胞毒性实验结果。图6为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物的溶血实验结果。图7为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物的体外转染实验结果。图8为制备的HSA/PAMAM/DNA复合物在小鼠体内的转染结果。图9为白蛋白(Albumin) (HSA和BSA)修饰对Albumin/PAMAM/DNA复合物体外转染结果的影响。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)末端带有氨基，以乙二胺为核，3. 0代，(购自 Sigma-Aldrich，产品目录号412422，规格5g，数均分子量为6909)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G3，再用PBS缓冲液(pH7. 4)溶解，制备成10mg/mL储存液于 4°C备用。聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)末端带有氨基，以乙二胺为核，4. O代，(购自 Sigma-Aldrich，产品目录号412449，规格10g，数均分子量为14215)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G4，再用PBS缓冲液(pH7. 4)溶解，制备成10mg/mL储存液于4°C备用。聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)末端带有氨基，以乙二胺为核，5. O代，(购自 Sigma-Aldrich，产品目录号536709，规格5g，数均分子量为观826)；采用旋转蒸发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G5，再用PBS缓冲液(pH7. 4)溶解，制备成10mg/mL储存液于 4°C备用。人血清白蛋白(HSA)购自山东泰邦生物制品有限公司，国药准字S10970005(20%: 50ml)。牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco，产品目录号为0332。实施例1、制备HSA/PAMAM/DNA复合物及其表征一、不同PAMAM代数和不同电荷比的筛选1)先将上述制成的PAMAM G3、PAMAM G4和PAMAM G5 (数均分子量分别为6909、 14215和观826) 10mg/mL储存液溶解于消毒蒸馏水中，振荡混勻，配制成lmg/mL的工作溶液，4°C储存备用。转染前取1. O μ g pGL-3. O质粒DNA (pGL-3. O质粒购自Promega公司，产品目录号为:E1771)置于EP管中，分别加入0. 7 μ L、1. 4 μ L、3. 5 μ L、7 μ L浓度为lmg/mL的 PAMAM G3、PAMAM G4 和 PAMAM G5 工作溶液，再加入 opti-MEM 培养基(购自 invitrogen，产品目录号为11058-021) 500uL,混勻后置室温孵育IOmin形成PAMAM/DNA复合物。PAMAM/ DNA复合物中，PAMAM与DNA的正负电荷比分别为1 1、2 1、5 1和10 1。2)按上述制备的不同代数、不同正负电荷比PAMAM/DNA复合物，按!Iomega荧光素酶检测系统(!Iomega，产品目录号为E1500)说明书检测其体外转染效果，结果如表1所示，结果显示，不同代数的PAMAM对体外转染效果影响较大，随着代数的增加，PAMAM/DNA复
5合物的荧光素酶活性增加，PAMAM G5与DNA形成复合物的体外转染效果最好。电荷比的增加也会提高复合物的转染效果，PAMAM与DNA的正负电荷比为10 1时，PAMAM/DNA复合物的荧光素酶活性最高。 表1不同代数和不同正负电荷比PAMAM/DNA复合物的荧光素酶活性检测结果
权利要求
1.一种用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、白蛋白和核酸复合制成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为6909-28拟6。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一所述的组合物，其特征在于所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的正电荷与所述核酸的负电荷的比值为1 1-10 1。
5.根据权利要求1-4中任一所述的组合物，其特征在于所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述白蛋白的质量比为7 0. 002-7 20。
6.根据权利要求1-5中任一所述的组合物，其特征在于所述组合物是按照权利要求7 所述的方法制备得到的。
7.一种制备权利要求1-6中任一所述用于转基因的组合物的方法，包括如下步骤 将末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与核酸混合后，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物；再向所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与核酸的复合物中加入白蛋白，孵育形成聚酰胺-胺树枝状聚合物、白蛋白和核酸的复合物，即得到所述用于转基因的组合物。
8.权利要求1-6中任一所述用于转基因的组合物在转基因中的应用或在制备基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了白蛋白修饰的PAMAM自组装转基因组合物及其制备方法与应用。本发明提供了一种用于转基因的组合物。本发明所提供的用于转基因的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、白蛋白和核酸复合制成。本发明具有如下有益效果1)通过Albumin对PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶血现象的发生；2)利用Albumin与细胞特异性受体介导的内吞作用，提高载体对细胞的靶向性，最大限度地降低非靶细胞的摄入，可在提高有效性的同时降低毒副作用；3)通过Albumin对PAMAM的修饰，还能提高其生物相容性，从而降低其在体内经免疫调理介导被网状内皮系统清除的可能性，提高其体内循环时间。
文档编号A61K48/00GK102488902SQ20111037832
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者刘楠, 张小宁, 殷哲, 郝艳丽 申请人:清华大学