专利名称：一种重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因及其表达载体和用途的制作方法
一种重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因及其表达载体和用途技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因重组及其表达，特别涉及一种重组泛素连接酶SH2-U-b0X融合基因及其表达载体和用途。
背景技术：
1、CHIP 的概述
CHIP (Carboxy terminus of Hsc70 Interacting Protein)是一类进化保守且分布广泛的胞浆蛋白，最初被认为是一种共伴侣蛋白(co-chaperone)。由于其C端含有一个 U-box结构域，本质上属于一类E3泛素连接酶。CHIP通过促进蛋白质的泛素化、降解，在蛋白质质量控制、稳定性调控过程中起着重要的作用。在乳腺癌组织中，CHIP的表达与肿瘤分级呈负相关；研究表明CHIP可以抑制肿瘤的增殖和转移。提示增强CHIP的作用有可能作为一种新的肿瘤治疗策略。
DCHIP含有一个TPR结构域以及一个U_box结构域
CHIP蛋白由N末端开始，分别由TPR结构域(tetratricop印tide repeat domain)、Linker和U_box结构域组成。IPR结构域介导蛋白-蛋白相互结合，能够与热休克蛋白HSC70/HSp70、Hsp90C末端相互识别并结合，调控热休克蛋白底物/客户蛋白的折叠过程；Linker的功能尚不明确，目前已发现它对于IPR依赖的相互结合是必需的；C端的 U-box结构域决定了 CHIP的E3泛素连接酶活性，负责募集泛素结合酶E2并将结合在E2上的泛素转移至TPR结构域所结合的伴侣分子及其底物蛋白上，促进这些分子在蛋白酶体中降解。
2) CHIP分子作为共分子伴侣和一类泛素连接酶，是细胞内蛋白质折叠-重折叠机器和泛素-蛋白酶体系统这两种通路之间的分子枢纽，参与细胞内蛋白质质量控制
细胞依赖蛋白质质量控制系统(protein quality control, QC)来持续监测新生肽链的折叠和错误折叠蛋白的修复或降解，以维持细胞的稳态。QC由分子伴侣(包括 Hsp70、Hsp40等)和泛素-蛋白酶体系统组成，前者帮助新生肽链的折叠与重折叠，后者负责降解错误折叠或损伤的蛋白。
CHIP作为一种共分子伴侣，能够借助其IPR结构域与分子伴侣Hsp70C末端相互结合，调节分子伴侣Hsp70家族成员与底物蛋白的结合和释放；另外，CHIP与Hsp70结合后能够阻止Hsp70的折叠，并依赖其U-box结构域和泛素连接酶活性促进底物蛋白的降解。通过上述方式，CHIP直接参与细胞内蛋白质的质量控制。
3)新近研究提示CHIP具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用
CHIP分布广泛，尤其在代谢活跃的组织中其表达水平很高，如骨骼肌、心脏和脑。 在细胞中，CHIP主要定位于胞质内，也有少部分存在于核中。最近的研究表明，在人乳腺癌组织中，CHIP的表达水平与肿瘤恶性程度和分级反相关。机制研究和细胞实验表明，CHIP 通过促进多种致癌蛋白例如HER2、ER-a、GR、SRC-3等的泛素化、降解，从而抑制肿瘤的增殖和转移。
2、重组泛素连接酶的应用
在泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来多个研究组应用重组技术构建重组泛素连接酶，成功降解正常情况下并非泛素化系统天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skpl-Cullinl-F-box(SCF)的底物结合亚单位 F-box构成的重组F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β -catenin。将分别来自BRCAl 和BARD的两个RING与增殖细胞核抗原PCNA进行重组后，该重组分子以蛋白酶体依赖的方式降低P57蛋白的水平，并且下调其功能。而我们的研究也表明，利用Cbl构建的重组泛素连接酶能够有效的下调乳腺癌细胞中高表达的HER2，从而达到抑制肿瘤生长的目的。这些研究证实利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。但目前还没有利用 CHIP泛素连接酶活性构建重组泛素连接酶进行基因治疗研究的相关报道。发明内容
本发明解决的问题在于提供一种重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因及其表达载体和用途，构建基于CHIP的泛素连接酶活性区域构建融合基因，所构建的融合基因具有靶向性泛素化和降解功能，可用于抗肿瘤药物的制备或进行基因治疗。
本发明是通过以下技术方案来实现
一种重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因，是将GA2的SH2结构域基因与CHIP 的U-box结构域基因连接。
所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因通过EcoR I.EcoR V酶切位点克隆入真核表达载体PFLAG-CMV4，得到重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-SH2-U-box。
所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因克隆入目标载体pLenti中，得到重组慢病毒载体 pLenti-SH2-U-box。
所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因应用于对Imatinib耐药的慢性粒细胞性白血病治疗。
所述的抗肿瘤药物的制备的应用是将重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因克隆入真核表达载体或慢病毒表达载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果
本发明将能够识别并结合Bcr/Abl融合蛋白第177位酪氨酸的GA2的SH2结构域基因与具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域基因，通过PCR融合构成重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因，该融合基因被表达后能够靶向性降解致癌相关蛋白Bcr/Abl，其中，SH2结构域负责对Bcr/Abl靶向性结合，U-box负责将泛素分子连接至底物以促进底物发生泛素化、降解。
所构建的SH2-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或慢病毒表达载体。
本发明基于SH2-U-box融合基因，构建了重组泛素连接酶真核表达载体 pFLAG-CMV4-SH2-U-box,该载体在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白Bcr/Abl，肿瘤细胞的细胞增殖显著降低。
而基于SH2-U-box融合基因的抑制肿瘤的效果，还可以在SH2-U-box融合基因的基础上构建重组慢病毒载体pLenti-SH2-U-b0X，进一步产生重组慢病毒，在产生包含融合基因的病毒颗粒之后，当达到一定滴度之后能够被注射到肿瘤当中，将SH2-U-box融合基因用慢病毒进行介导转染。
图1为构建的SH2-U-box融合基因的电泳检测结果图2为重组真核表达载体pFLAG-CMV4-SH2-U-box的双酶切鉴定结果图3为免疫印迹检测融合基因SH2-U-box对宿主肿瘤细胞Bcr/Abl蛋白下调的结果图4为MTT比色法检测转染不同载体的K562细胞的细胞增殖曲线图。
具体实施方式
本发明利用接头分子 Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2)的 SH2 结构域(Src homology domain2)能够识别并结合融合蛋白Bcr/Abl的特性和CHIP的泛素连接酶活性，构建能够靶向性降解致癌相关蛋白Bcr/Abl的重组泛素连接酶SH2-U-box。所构建的融合基因SH2-U-box是分别克隆GA2的SH2结构域基因与具有泛素连接酶活性的 CHIP的U-box结构域基因，采用重组PCR进行融合；其中，SH2结构域负责对Bcr/Abl的靶向性结合，U-box负责将泛素分子连接至底物以促进底物发生泛素化、降解。下面结合融合基因SH2-U-box、真核表达载体和重组慢病毒的构建，及促进致癌相关蛋白Bcr/Abl的降解对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因的构建
1. 1SH2和U-box结构域基因的克隆
根据Genbank中GA2的SH2基因序列、CHIP的U_box基因序列分别设计扩增引物对P用于扩增SH2基因序列作为对照，扩增引物对P1、P2，用于融合基因的重组扩增，具体设计为
引物对P:
上游弓丨物:ggcgaattca gacggcttca ttcccaagaa c 31 ；
下游弓丨物:ggcgatatcc tagagggcct ggacgtatgt eg 32 ；
引物对P1、P2
Up:ggcgaattca gacggcttca ttcccaagaa c31 ；
Ml:gttcagccgg agggcctgg acgtatgtcg30 ；
M2:caggccctcc ggctgaactt cggggacg28 ；
Down :ggcgatatcc tagtagtcct ccacccagcc attc34 ；
其中，扩增SH2的下游引物序列Ml中引入U-box基因片段的5补核苷酸，扩增U-box的上游引物序列M2引入SH2基因片段3’ -端几个核苷酸，以便两个截短体在后续重组PCR反应中相融合。同时，在扩增SH2的上游引物序列Up中引入酶切位点EcoR I，扩增U-box的下游引物序列Down中引入酶切位点EcoR V。
然后，以K562细胞的cDNA为模板，分别以引物对P、Pl (Up, Ml)为扩增引物对，PCR 扩增 SH2 结构域基因，PCR 扩增程序为94°C 5min,94°C 30s, 57°C 45s, 72°C 30s, 35 cycle ；
以K562细胞的cDNA为模板，以引物对P2 (M2，Down)为扩增引物对，PCR扩增U_box 结构域基因，PCR 扩增程序为 94°C 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35 cycle。
收集PCR扩增产物，纯化后获得SH2结构域基因与U_box结构域基因。
1.2SH2-U_box融合基因的构建
利用重组PCR，将扩增的SH2结构域基因与扩增的U_box结构域基因进行基因融合
将引物对Pl扩增的SH2结构域基因与引物对P2扩增的U_box结构域基因等量混合物(1 1混合)为模板，以SH2上游引物Up、U-box下游引物Down作为引物对，进行重组 PCR，使 SH2 和 U-box 相融合，PCR 扩增程序为94°C 5min，94°C 30s, 58°C 45s, 72°C lmin, 35 cycle。收集重组PCR扩增的产物，纯化后获得SH2-U-box融合基因。
对SH2，U-box结构域基因以及其SH2-U-box融合基因进行凝胶电泳检测的结果如图1-1、图1-2所示，其中泳道M为Marker，SH2结构域基因的片段大小为360bp，U_box结构域基因的片段大小为528bp，SH2-U-box融合基因的片段大小为888bp，与预期设计相符I=I ο
2、SH2-U-box融合基因的重组真核表达载体、重组慢病毒载体的构建
2. 1重组真核表达载体pFLAG-CMV4-SH2-U-box的构建
分别用限制性内切酶EcoR I, EcoR V对SH2-U_boX融合基因和真核表达载体 PFLAG-CMV4进行双酶切，回收酶切片段之后，用T4连接酶将酶切后的SH2-U-box融合基因与pFLAG-CMV4载体相连接。
连接反应完成以后，连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养过夜后，挑取单个克隆，摇菌培养，提取质粒并进行EcoR I,EcoR V双酶切鉴定，最后进行测序验证；将所构建成功的重组分子命名为pFLAG-CMV4-SH2-U-box，此即为重组泛素连接酶SH2-U_box真核表达载体。
双酶切鉴定的电泳结果如图2-1、图2-2所示，其中泳道M为Marker，泳道 pFlag-CMV4为载体，泳道pFlag-CMV4-SH2是将SH2结构域基因插入载体作为酶切检测对照，泳道pFlag-CMV4-SH2-U-boX为融合基因的真核表达载体的酶切检测结果，可以看出两个载体均被酶切成大小两个片段，而其中的小片段SH2-U-box融合基因大于作为对照的 SH2结构域基因。
对比测序结果，SH2-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2. 2重组慢病毒载体pLenti-SH2-U_box的构建
重组慢病毒的构建使用hvitrogen公司的ViraPower 慢病毒载体系统，在构建的SH2-U-box融合基因的基础上，通过PCR、基因重组等技术，构建含SH2-U-box片段的重组慢病毒表达载体pLenti-SH2-U-boX。重组慢病毒表达载体在脂质体介导下与包装质粒 (pfeig/P0l、pReV)、包膜质粒(pVSVG)共转染细胞，培养48 7 后收集培养上清，包装产生慢病毒并进行滴度测定。获得足够的滴度后(7. OX IO1VpVmL),可进行荷瘤鼠瘤体局部注射，在动物水平检测该重组泛素连接酶的抑制肿瘤作用效果。
3、真核表达载体转染Bcr/Abl阳性的慢性粒细胞白血病细胞细胞系K562，能够促进Bcr/Abl的降解并且抑制细胞增殖。
将Bcr/Abl表达阳性的对数生长期的慢性粒细胞白血病细胞K562以每孔2X IO5 细胞的密度接种于25cm2培养瓶内，培养液为含15%小牛血清的1640，在5%二氧化碳培养箱(37°C)中培养。次日按照Amaxa Cell LineNucleofector Kit V说明书进行电穿孔转染，将真核表达载体pFLAG-CMV4-SH2-U-box转染K562细胞。
3. 1免疫印迹检测融合蛋白SH2-U-box对Bcr/Abl蛋白的下调
转染后48小时离心收集细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解细胞30min，收集细胞提取物，利用免疫印迹检测转染融合基因SH2-U-box的细胞中Bcr/Abl融合蛋白的含量的变化，以转染了 PFLAG-CMV4空质粒、转染pFLAG-CMV4_SH2载体的细胞作为转染融合基因的对照。
在进行免疫印迹检测时，抗FLAG抗体(IC)购自sigma公司，抗Bcr/Abl抗体购自 Cell Signaling TECHNOLOGY公司，荧光标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自Odyssey公司。
免疫印迹检测结果如图3所示，转染pFLAG-CMV4-SH2载体、 pFLAG-CMV4-SH2-U-boX载体之后，以抗FLAG标签抗体检测结果显示转染的目的片段SH2或 SH2-U-box均相应地得到表达。
Bcr/Abl免疫印迹检测结果显示与转染了 pFLAG_CMV4空质粒及pFLAG-CMV4_SH2 的对照细胞相比较，转染了 pFLAG-CMV4-SH2-U-box的K562细胞中Bcr/Abl条带颜色均明显变浅，即其Bcr/Abl含量相应的减少，而作为内对照的Anti-tubulin其免疫印迹检测显示一致，无明显变化；这说明在相同转染条件下，融合基因SH2-U-box的表达对K562细胞中 Bcr/Abl蛋白产生了靶向性降解，使其Bcr/Abl蛋白发生下调。
3. 2MTT比色实验检测融合基因SH2-U-box表达对宿主肿瘤细胞增殖的影响
分别转染pFLAG-CMV4 空载体(CMV)、pFLAG_CMV4_SH2、和 pFLAG-CMV4-SH2-U_box 的K562细胞株M小时后，以2000个细胞/孔的密度接种于96孔板，于接种后1 5天每天进行MTT比色法检测，比较三种转染细胞的细胞增殖，绘制细胞增殖曲线。结果如图4所示，其中横坐标为转染后的天数，纵坐标为反应活细胞数的吸光度值，可以看出，从第3天起，转染SH2-U-box融合基因的肿瘤细胞的增殖明显滞后于转染pFLAG-CMV4空载体的肿瘤细胞，这表明融合基因的表达抑制了肿瘤细胞的增殖。
经上述验证表明重组泛素连接酶SH2-U-box的真核表达质粒 pFLAG-CMV4-SH2-U-box,转染Bcr/Abl阳性肿瘤细胞系K562后，通过促进Bcr/Abl下调，能够有效抑制Bcr/Abl阳性细胞的增殖，具有抑制Bcr/Abl阳性慢性粒细胞性白血病生长的效果和用途。
权利要求
1.一种重组泛素连接酶SH2-U-b0X融合基因，其特征在于，是将GA2的SH2结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接。
2.如权利要求1所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如权利要求1或2所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因通过EcoR I.EcoR V酶切位点克隆入真核表达载体 PFLAG-CMV4，得到重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-SH2-U_box。
4.如权利要求1或2所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因，其特征在于，所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因克隆入慢病毒载体系统中，得到重组了 SH2-U-box融合基因的重组慢病毒载体；将该重组慢病毒载体与包装质粒、包膜质粒共转染宿主细胞后， 产生重组了 SH2-U-box融合基因的重组慢病毒。
5.权利要求1或2所述的重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因应用于抗BCR/Abl阳性表达的慢性粒细胞性白血病的药物的制备。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物的制备的应用，其特征在于，将重组泛素连接酶 SH2-U-box融合基因克隆入真核表达载体，或克隆入慢病毒表达载体，构建重组慢病毒。
全文摘要
本发明公开了一种重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因及其表达载体和用途，重组泛素连接酶SH2-U-box融合基因是将Grb2的SH2结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接，具体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所构建的SH2-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或腺病毒表达载体。该融合基因在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白BCR/Abl，肿瘤细胞的细胞增殖能力显著被降低，表现出对肿瘤细胞的增殖抑制和侵袭抑制，从而达到抗肿瘤的效果。
文档编号A61K48/00GK102517312SQ201110387869
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者刘新平, 张璟, 李瑗春, 李霞, 王秦豪, 茹懿, 药立波, 钟代星 申请人:中国人民解放军第四军医大学