专利名称：用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法
技术领域：
本发明涉及一种用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法，特别是指一种用鹌鹑肉瘤纤维细胞QT6生产鸡马立克氏病疫苗及其方法。
背景技术：
马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由疱疫病毒科的马立克氏病病毒(Marek’sdisease virus,MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤性疾病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。MD在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。
疫苗接种仍是目前控制马立克氏病的有效途径之一。目前使用的商品化鸡马立克氏病疫苗大都是用原代 鸡胚成纤维细胞作为制苗材料。制备原代细胞的方法不但费时而且成本高。生产疫苗的大约30%的成本是用于制备鸡胚成纤维细胞。疫苗生产十分依赖SPF种蛋的供应。SPF禽群在特殊条件下饲养并且定期证明其不含禽类病原体。SPF种蛋的供应的任何中断都将中断MDV疫苗的生产。并且每次制备的原代细胞劳动强度大，批间差异也大，从而引起质量不稳定，操作过程易污染，疫苗产量及质量受到极大限制。
家禽养殖工业一直以来急需可用于生产马立克氏病疫苗的连续传代细胞系。尽管发展了许多禽类或哺乳动物细胞系(如EP0748867和EP0884382)，但依然没有连续细胞系可以在马立克氏病疫苗中作为有效的鸡胚成纤维细胞(CEF)的替代物。发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用可连续传代的传代细胞系生产马立克氏病疫苗，以实现通过使用可传代培养的成纤维细胞系——鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6 (保藏号为ATCC CRL-1708)，替代原代鸡胚成纤维细胞，用于连续化工业生产鸡马立克氏病疫苗，从而获得一种疫苗质量和产量高、批次差异小、免疫效力稳定的马立克氏病疫苗。
技术方案
一种连续传代细胞系生产的马立克氏病疫苗，其中，每支马立克氏病疫苗成品(2ml体积)中包含以下组分:
Ham' s F12K 培养液:1.4 1.7ml ；
胎牛血清:0.2 0.4ml ；
DMSO:0.1 0.2ml;
其中，马立克氏病病毒含量> 6 X IO6PFU,所述的马立克氏病病毒为使用传代细胞系生产获得。
优选地，本发明所述传代细胞系为鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6，该细胞系为可传代培养的成纤维细胞系，购自ATCC CRL-1708。
优选地,本发明所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒CVI988/Rispens株,为商品化的病毒株，并在《鸡马立克氏病CVI988_Rispens毒株生物学特性的研究》(中国兽医杂志，2002年第38卷第5期)中公开。
本发明对马立克氏病病毒的类型没有特别地限定，优选地，本发明所述马立克氏病病毒为血清I型、血清II型或血清III型中的任意一个或多个的组合。
优选地，本发明所述马立克氏病疫苗为液氮疫苗或冻干疫苗。
上述马立克氏病病毒及马立克氏病疫苗是通过下述方法获得的，即用连续传代细胞系生产马立克氏病疫苗的方法，包括以下步骤:
I)传代细胞的传代与培养:将传代细胞使用细胞分散液进行消化传代，用细胞生长液培养，以形成良好的细胞单层；
2)细胞毒种的繁殖:将马立克氏病病毒在步骤I)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞继代，以获得工作种毒；
3)工作种毒的繁殖:将步骤I)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞，弃去细胞生长液，接种含细胞维持液的工作种毒，在37 38°C下培养；
4)当培养至CPE彡80%以上时，收获马立克氏病病毒，并配苗分装以获得马立克氏病疫苗。
其中，配苗之前收获马立克氏病病毒的方法为:
培养至80%以上的细胞出现致病变效应时，即可收获，弃去细胞维持液，加入EDTA-胰酶细胞分散液，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入细胞维持液，停止消化，收获马立克氏病病毒，无菌检验后，分至离心瓶中；于2 8°C、1500r/min离心10 20min,离心后弃去上清，收集沉淀细胞(其含有马立克氏病病毒)。
其中，配苗时使用的培养液及比例如下:
体积75 85%的Ham' s F12K培养液(不加血清)，PH值调为7.2 ;体积10 20%的胎牛血清和体积5 10%的DMS0，加入收集的沉淀细胞中，摇匀，取样做收获前的无菌检验，进行活细胞计数后，定量分装到无菌安瓿瓶中封口。
优选地，本发明上述方法中步骤4)还包括将获得的马立克氏病疫苗进行降温，至-90°C _120°C时将疫苗放入液氮中保存，以获得马立克氏病液氮疫苗的过程。
优选地，本发明上述方法中传代细胞`为鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6。
优选地，本发明上述方法中所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒CVI988/Rispens 株。
优选地，本发明上述方法中马立克氏病病毒为血清I型、血清II型或血清III型中的任意一个或多个的组合。
技术效果
本发明使用传代细胞生产鸡马立克氏病疫苗的方法，至少具有以下优点:
I)无需在每次生产疫苗时都制备原代鸡胚成纤维细胞，不但大大降低了生产成本，也简化了操作程序，生产工艺简单稳定、易操作，使病毒产量大幅度的提高。
2)本发明生产的鸡马立克氏病毒疫苗质量优良，批间差异小，免疫效力高，免疫效果稳定O
图1为本发明使用传代细胞生产鸡马立克氏病疫苗的流程图。
具体实施方式
以下结合说明书附图及具体实施例来对发明作进一步的描述:
实施例1传代细胞生产鸡马立克氏病疫苗的方法
(I)制苗用QT6细胞的传代与培养:
QT6细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，一瓶传三瓶，用细胞生长液于37°C继续培养，每4天传一代。形成良好单层时，即可用于继续传代或接种病毒。细胞接种密度为2X 105cells/ml ；
(2)细胞毒种的繁殖:
取液氮保存的鸡马立克氏病毒CVI988/RiSpenS株，在上述细胞上复壮继代I 2代，制备工作种毒；
(3)接种工作毒种:
取已形成良好单层的10000ml细胞转瓶，弃去细胞生长液，接种含CVI988/Rispens株的维持液1000ml，每毫升含I 2万个含毒细胞，在37 38°C下转动培养。
(4)收获:
培养至80%以上的细胞出现致病变效应时，即可收获，弃去维持液，加入28mlEDTA-胰酶细胞分散液，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入维持液，停止消化，收获，无菌检验后，分至离心瓶中；
(5)离心提取细胞:
于2 8 、1500r/min离心10 20min,离心后弃去上清，收集沉淀细胞；
(6)配苗分装:
将配苗体积75 85%的培养液、配苗体积10 20 %的胎牛血清和配苗体积5 10%的DMS0，混匀后加入收集的沉淀细胞中，摇匀，取样做收获前的无菌检验，进行活细胞计数后，分装到无菌安瓿瓶中，2ml/瓶，封口，使每毫升所含的病毒蚀斑数不低于3 X IO6PFU ；
(7)程序降温:
利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至_90°C _120°C时将疫苗放入液氮中保存；
上述步骤可参考本发明的附图1。
(8)疫苗稀释液配制:
普通肉汤培养基50ml ;L_ 谷氨酸单钠 0.83g ；KH2PO4 0.52g ；Κ2ΗΡ04.3H20 1.64g ；蔗糖76.62g，加去离子水配成1000ml，115°C高压灭菌20min，经检验无菌后4°C保存，疫苗使用前稀释使用。
上述细胞生长液为5%胎牛血清浓度的Ham' s F12K培养液，PH值调为7.2 ;维持液为3%胎牛血清浓度的Ham' s F12K培养液，PH值调为7.4 ;配苗用Ham' s F12K培养液不加血清，PH值调为7.2。胎牛血清的生产厂家是PAA Laboratories GmbH。
上述EDTA-胰酶细胞分散液的配制方法:
0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液配制(EDTA):乙二胺四乙酸二钠溶液配制(EDTA) 0.2g ；NaCl 8.0g ;Na2HP04.12H20 1.15g ；KC1 0.2g ；KH2PO4 0.2g ;葡萄糖0.2g ;补去离子水至1000ml溶解后分装，高压灭菌(15磅15min)4°C保存；
0.25 %胰蛋白酶:胰蛋白酶0.25g溶于IOOml 0.0lM PH7.4的PBS，过滤分装，-20°C保存。
0.0lM PH7.4 的PBS:7.9g NaCl, 0.2g KCl，0.24g KH2PO4 (或 1.44gNa2HP04)和 1.8gK2HPO4，溶于800ml去离子水中，调PH值至7.4，最后加去离子水定容至1000ml。于4°C冰箱中保存即可。
临用时0.25%胰蛋白酶与0.02%的乙二胺四乙酸二钠溶液配制(EDTA)按1: 4混合即为EDTA-胰酶细胞分散液。
实施例2鸡马立克氏病疫苗与使用CEF细胞制备鸡马立克氏病疫苗的比较研究
1制备现有的鸡马立克氏病疫苗主要步骤如下:
(1)鸡胚成纤维细胞(CEF)单层的制备:
选择10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酊棉球消毒气室部位，再用75%的酒精棉球脱碘，无菌挑出胚体置于无菌平皿中，用0.1M的PBS洗涤胚体并去除眼睛、爪及内脏，然后采用连续消化法制备CEF悬液，制成150万/ml的细胞密度，混匀后接种细胞培养瓶。；
(2)细胞毒种的繁殖:
取实施例1中的鸡马立克氏病毒CVI988/Rispens株，在上述CEF上复壮继代I 2代，制备工作种毒；
(3)接种病毒:
将培养24h生长状态良好的细胞单层的10000ml转瓶，弃去培养液，接种含CVI988/Rispens株的维持液1000ml，每毫升含I 2万个含毒细胞，在37 38°C下转动培养。
(4)收获:
当80%以上的细胞出现典型病变时，即可收获。弃去维持液，加入28ml EDTA-胰酶细胞分散液，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入维持液，停止消化，收获，无菌检验后，分至离心瓶中；
(5)离心提取细胞:
于2 8°C、1500r/min离心10 20min，离心后弃去上清，收集沉淀细胞；
(6)配苗分装:
将配苗体积75 85%的培养液、配苗体积10 20 %的胎牛血清和配苗体积5 10%的DMS0，混匀后加入收集的沉淀细胞中，摇匀，取样做收获前的无菌检验，进行活细胞计数后，分装到无菌安瓿瓶中，2ml/瓶，封口，使每毫升所含的病毒蚀斑数不低于3X 1O6PFU ；
(7)程序降温:
利用程序降温仪进行程序降温，待苗温降至_90°C _120°C时将疫苗放入液氮中保存；
上述细胞生长液为4%胎牛血清的M199培养液；维持液为2%胎牛血清的M199培养液；配苗用M199营养液不加血清。
(8)疫苗稀释液配制:
普通肉汤培养基50ml ;L_ 谷氨酸单钠 0.83g ；KH2PO4 0.52g ；Κ2ΗΡ04.3H20 1.64g ；蔗糖76.62g，加去离子水配成1000ml，115°C高压灭菌20min，经检验无菌后4°C保存备用。
2免疫比较:
将160只由北京梅里亚维通实验技术有限公司提供的I日龄SPF鸡，随机分成4组，每组40只。免疫组共2组，分别接种实施例1生产的鸡马立克氏病疫苗和使用原代鸡胚成纤维细胞生产的鸡马立克氏病疫苗，用疫苗稀释液稀释后每只颈背部皮下注射0.2ml (含2000PFU)。另外2组为非免疫组，其中一组为不免疫也不攻毒对照组(空白对照)，另一组为攻毒对照组(阳性对照组)。4组鸡分别在隔离器中饲养，喂给消毒的饲料和饮水。
3 攻毒:
免疫后21天，将免疫组和阳性对照组分别接种马立克氏病标准强毒株京-1株(购自中国兽医药品监察所，保藏号CVCC AV86)，lml/支。攻毒时，分别用M199培养液作10倍稀释，每只鸡腹腔注射0.5ml。继续在隔离其中饲养，每天观察、记录发病和死亡情况，对死亡鸡及时剖检，观察病变。攻毒后63天，对存活鸡剖检观察肉眼病变，计算保护指数。
4实验结果:
疫苗免疫组的攻毒保护结果:
结果表明，两组鸡马立克氏病疫苗均能有效抵抗MD标准强毒的攻击，保护指数分别为90.6%、87.5%。具体数据见表I。
表I免疫组和对照组接种强毒后的保护指数和死亡情况表
权利要求
1.一种连续传代细胞系生产的马立克氏病疫苗，其特征在于， 每2ml马立克氏病疫苗成品包含以下组分:Ham' s F12K 培养液:1.4 1.7ml ； 胎牛血清:0.2 0.4ml ； DMSO:0.1 0.2ml ； 马立克氏病病毒含量> 6X IO6PFU,其中，所述的马立克氏病病毒为使用传代细胞系生产获得。
2.根据权利要求1所述的马立克氏病疫苗，其特征在于，所述传代细胞系为鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6。
3.根据权利要求1所述的马立克氏病疫苗，其特征在于，所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒CVI988/Rispens株。
4.根据权利要求1所述的马立克氏病疫苗，其特征在于，所述马立克氏病病毒为血清I型、血清II型或血清III型中的任意一个或多个的组合。
5.根据权利要求1所述的马立克氏病疫苗，其特征在于，所述马立克氏病疫苗为液氮疫苗或冻干疫苗。
6.一种用连续传代细胞系生产马立克氏病疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将传代细胞使用细胞分散液进行消化传代，用细胞生长液培养，以形成良好的细胞单层； 2)将马立克氏病病毒在步骤I)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞继代，以获得工作种毒； 3)将步骤I)获得的形成良好的细胞单层的传代细胞，弃去细胞生长液，接种含细胞维持液的工作种毒，在37 38°C下培养，以繁殖马立克氏病病毒； 4)当培养至CPE≥ 80%以上时，沉淀细胞，收获马立克氏病病毒，并配苗分装以获得马立克氏病疫苗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)还包括将获得的马立克氏病疫苗进行降温，至_90°C _120°C时将疫苗放入液氮中保存，以获得马立克氏病液氮疫苗的过程。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述传代细胞为鹌鹑肉瘤纤维细胞系QT6。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒 CVI988/Rispens 株。
10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述马立克氏病病毒为血清I型、血清II型或血清III型中的任意一个或多个的组合。
全文摘要
本发明公开了一种用可传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗的方法，包括如下步骤(1)制苗用细胞的传代与培养；(2)细胞毒种的繁殖；(3)接种病毒；(4)离心提取细胞，收获病毒；(5)配苗分装。本发明使用传代细胞替代原代鸡胚成纤维细胞生产鸡马立克氏病疫苗大大降低了生产成本，且具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒蚀斑含量高，批间差异小，质量易控制，可显著提高疫苗的产量和质量。利用本发明生产的鸡马立克氏病疫苗对标准强毒株有较高的免疫效力，免疫效果高于同类制品。
文档编号A61P31/22GK103157107SQ201110420140
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司