专利名称：猪传染性胃肠炎s/n蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株以及它们在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途，属于猪传染性胃肠炎的防治领域。
背景技术：
猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。TGEV主要存在于空肠和十二指肠，各种日龄的猪均易感。由于仔猪自身抵抗力比较差，易受外界各种刺激因素的影响和病原微生物的侵袭，常会因严重脱水而发生死亡， 并以2周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100%。随日龄的增大，虽然死亡率逐渐下降，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低，给世界范围内的养猪业都带来严重的经济损失。 猪传染性胃肠炎病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗TGEV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对本病的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为技术的关键。TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，并且可以介导细胞的吸附、中和抗体的产生等过程，可以提供有效的免疫保护作用。TGEV感染具有明显的嗜肠性，病毒粒子表面的纤突蛋白(S蛋白)与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶(APN)的结合是感染发生的首要条件，粘膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，肠道粘膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度。针对猪传染性胃肠炎发病的几个特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能。使用细菌病毒等活载体来传递完整无损的抗原成分解决了这个问题，目前有使用减毒细菌作为疫苗抗原的载体的报道，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙门氏菌作为载体传递DNA疫苗可能存在毒力返强的危险，质粒DNA也可能会整合到宿主细胞基因组，引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；本发明的目的之二是提供含有上述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原位点的融合基因的表达载体；本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、 D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)连接得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。本发明将TGEV S蛋白中A、D抗原位点(Md)和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)(以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列)连接起来，考虑到乳酸乳球菌使用密码子的偏嗜情况，为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子丝氨酸(TCG)、苏氨酸(ACG)、 脯氨酸(CCC)、精氨酸(CGG)、苯丙氨酸(TTC)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对 A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC-AAT，ATC-ATT, ACA-ACT)进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。通过两个柔性的Linker ((GGGGS) 3)将TGEV的A、D抗原位点基因和N321抗原位点基因连接起来(顺序为D-Linker-N321-Linker-A)，并把该序列命名为MLSN(SEQ ID No. 1)；此外，在MLSN的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和McI酶切位点。本发明的另一方面是提供由SEQ ID No. 1所示抗原融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。。本发明的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的表达载体，譬如，将本发明的 SEQ ID No. 1所示的抗原融合基因与表达载体pNZ8149进行连接，得到可以在乳酸乳球菌的外表面或细胞壁表达抗原融合基因的分泌表达载体。由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白的重组乳酸乳球菌菌株，能够用其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本发明将SEQ ID No. 1所示融合基因与分泌表达载体pNZ 8149进行双酶切、连接并经电击转化转入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900细胞，获得含有重组质粒的乳酸乳球菌命名为NZ3900-pNZ8149-MLSN ；其微生物保藏号是CCTCC No :M2011444 ；分类命名是=Lactococcus lactis NZ3900_pNZ8149_MLSN ；保藏时间是 2011 年 12 月 5 日；保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是中国武汉武汉大学。进一步的，本发明将重组乳酸乳球菌菌1!1320- !1151525^1^用乳链杆菌肽附8士11 进行诱导，使目的基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与 TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本发明构建了 NZ3900-pNZ8149-MLSN表达载体系统，表达了含有TGEV蛋白A/D 位点和N蛋白N321位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列CWAM6连接序列MLSN(目的蛋白约 28kDa)；免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性。间接免疫荧光也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基石出。
本发明针对TGEV发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，因此所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。同时，乳酸菌本身具有佐剂效应，会明显加强抗原的免疫原性，机体对乳酸菌载体系统本身不产生强的抗体应答反应，乳酸菌还可合成一些生物活性物质，如乳酸菌素、细菌素、多种有机酸等，这些物质本身就具有抑菌抗菌、抗腹泻作用。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人，Nucleic AcidRes. 19:5081(1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮口， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
图IPCR产物电泳结果。图2PCR产物电泳结果；M 蛋白质分子量标准；1、pNZ8149_MLSN的Ncol、SacI酶切结果；4、MLSN的PCR鉴定。图3表达产物的SDS-PAGE及flfestern-blot分析；M 蛋白质分子量标准；1 重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149诱导后的蛋白质；2_3、重组NZ3900_pNZ8149-MLSN诱导后的蛋白质；4 重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN诱导后的蛋白质的免疫印迹。图4表达产物的间接免疫荧光检测(X40) ；A :NZ3900-pNZ8149-MLSN重组菌的IFA试验结果，菌体细胞散发了强烈的黄绿色荧光；B :NZ3900-pNZ8149重组菌的IFA试验结果，没有荧光，菌体呈红色。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例IMLSN基因乳酸乳球菌分泌表达载体的构建及鉴定1多抗原表位序列MLSN的设计与合成猪传染性胃肠炎病毒S蛋白含有A、B、C、D共4个抗原位点，其中A (536-593残基区)和D (376-392残基区)抗原位点在诱导产生中和抗体中起重要作用，并且A抗原位点是一个主要的B细胞抗原表位。猪传染性胃肠炎病毒含有4个主要的T细胞表位，其中N 蛋白上的(321-335残基区)抗原位点能够诱导最强烈的T细胞反应，而且能诱导T细胞在体内协助合成中和抗体即抗S蛋白的特异性抗体。 通过两个柔性的Linker ((GGGGS) 3)将TGEV的A、D抗原位点基因和N321抗原位点基因连接起来(顺序为D-Linker-N321-Linker-A)，并把该序列命名为ADN。对稀有密码子丝氨酸(TCG)、苏氨酸(ACG)、脯氨酸(CCC)、精氨酸(CGG)、苯丙氨酸(TTC)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC-AAT，ATC-ATT，ACA-ACT) 进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。在MLSN(SEQ ID No. 1)所示的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和McI酶切位点。将设计好的MLSN序列进行人工合成，构建了重组质粒 pMD18-MLSN。pMD18-T Simple Vector 购白 TaKaRa (大连)公司，pMD18_MLSN 的具体构建过程如下PCR扩增目的基因在PCR反应管中加入下列试剂和溶液表IMLSN的PCR反应体系成分用量(yL)
合成基因模板Γο
dNTPs (2. 5mmol/L)2. O
引物Pl1.0引物 P21-0
IOXExTaq buffer5. O
ExTaq DNA聚合酶1. O
二馏水38. O
总体积50.0Pl :5，-GA AGA TCT ATGTCTGTAAGTGATTCAAGCT 3，P2 :5， -ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTAC 3，混勻并离心后放置于PCR仪中，94°C预变性5min后，进行如下循环94°C，30s ； M°C，30s ;72°C，30s。30个循环后72°C延伸lOmin。PCR扩增完成后，取5 μ L产物用1 % 琼脂糖凝胶电泳观察。并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下将100 μ L PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE-A溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，混合均勻后于75°C加热融化。加0.5个DE-A体积的DE-B溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，混合均勻。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加
0.5mlWl溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0. 7ml W2溶液(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)，12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心lmin。将制备管置于洁净的
1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量(20 μ L)水或洗脱液室温静置lmin，12000rpm离心 lmin洗脱DNA。取回收产物IyL 1 %琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于_20°C 保存备用。PCR产物与克隆载体的连接及转化按pMD18-T Simple Vector说明书将回收的PCR产物与pMD18_T Vector连接。连接体系见表2 表2连接反应体系
权利要求
1.猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus of swine)S/N 蛋白抗原融合基因，其特征在于其多核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。
2.由权利要求1所述融合基因编码的蛋白序列，其特征在于其氨基酸序列为SEQID No. 2所示。
3.含有权利要求1所述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组宿主细胞株。
5.按照权利要求4所述的重组宿主株，其特征在于所述的重组宿主细胞株是重组乳酸乳球菌(Laciococcw1S hciis)菌株，其微生物保藏号是CCTCC No:M2011444。
6.权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。
7.权利要求2所述的蛋白在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。
8.权利要求3所述的重组表达载体在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。
9.权利要求4或5所述的重组宿主细胞株在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。
10.按照权利要求6-9任何一项所述的用途，其特征在于所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本发明公开了猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用。本发明提供了由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列连接一起后得到的融合基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。本发明进一步提供了含有该融合基因的表达载体及含有该重组表达载体的重组乳酸乳球菌菌株。将重组乳酸乳球菌菌株用乳链杆菌肽Nisin进行诱导，融合基因可在细菌细胞壁表面进行表达。免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，可将其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文档编号A61P31/14GK102399807SQ20111042471
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者张金林, 胡晓芬, 马立保 申请人:武汉华扬动物药业有限责任公司