专利名称：五味子及其提取物在抗sars冠状病毒感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药学领域，具体而言涉及五味子及其提取物的应用。
背景技术：
严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome, SARS)又称传染性非典型肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。SARS病原体是冠状病毒属的一种病毒(Peiris J et al.Lancet, 2003, 361:1319-1325)。冠状病毒属隶属于冠状病毒科，冠状病毒是正链RNA病毒，在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(SiddelI，
S.G et al.Coronaviruses, toroviruses and arteriviruses.1n Topley & Wilson' sMicrobiology and Microbia Infections,10th edition,Vol.Virology(eds.Mahy,B.ff.J.&ter Meulen, V.) 823-856 (Hodder Arnold.London, 2005))。这个属含有约 26 个种；按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，这个属又可以被分为三个组群:其中第一组群有猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)等；第二组群有SARS冠状病毒等；第三组群有禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious BronchitisVirus, AIBV)等(Spaan, ff.J.M.and Cavanagh, D.Coronaviridae.1n Virus taxonomy,VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.，London,2004)。SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和 pplab(Ziebuhr, Snijder et al.2000 ；Thiel, Herold et al.2001 ；Anand，Yang et al.2005 ；Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能(Ziebuhr, Snijder et al.2000 ；Anand, Yang etal.2005 ；Bartlam, Yang et al.2005)，SARS冠状病毒主要蛋白酶(简称主蛋白酶，mainprotease)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。天然产物又称次级代谢产物，具有结构多样性和生物活性多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM.Nat Prod Rep, 2000,17 (3):215-234 ;LeeK-H.J Nat Prod.2004,67(2):273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是药物小分子化合物的一个巨大的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。中药五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis (Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实。性味:酸、甘，温。归肺、心、肾经。功效为收敛固涩，益气生津，补肾宁心。主要化学成分为五味子素(schizandrin)、脱氧五味子素( de_oxyschizandrin)、新一味子素(neoschizandrin)、五味子酉享(schizan-drol)、五味子酉旨(schisantherin，gomisin)A、B、(:、03、卩、6、!1、了、1(1、1(2、1(3、1^1、1^2、]\11、]\12、吧、0、1 等。陈建操等在CN1539426A中公开了利用植物多酚用于制备药物和保健品抗SARS病毒以及治疗和/或预防SARS病毒所致的疾病；在CN1568945A中公开了姜黄素在制备治疗SARS的药物中的应用；在CN1568968A中公开了黄烷醇多酚在制备治疗SARS的药物中的应用。邵宁生等在CN1443770A中公开了抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶点。赵原在CN1453030A中公开了一种治疗和预防SARS病的中药，它由下述重量配比的原料制成，徐长卿3-10份、僵蚕3-10份、蝉蜕3-10份、鬼白3-10份、女青3_10份、贯众10-15份、槟榔
6-15份、厚朴3-10份、草果3-6份、女贞子6-15份、大黄3_12份。所述中药可制成水剂、冲齐U、丹丸、胶囊的口服药物或针剂，救治已患SARS病的病人。王一飞等在CN1452967A中公开了千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。高平在CN1552387A中公开了一种治疗SARS的清热、润肺药物，是由藿香、茅术、滑石、明雄、前胡、寸香、厚朴、半夏、甘草、青皮、瓜萎、贝母组成的；在CN1552388A中公开了一种治疗SARS的清热、解毒药物，是由榔片、厚朴、草果、甘草、元芩、双花、明白矾、牛子、知母、柴胡、青皮组成；在0附55239(^中公开了一种治疗SARS的清肺药物，是由知母、甘草、当归、元芩、陈皮、麦冬、地骨皮、百合、石膏、柴胡、半夏组成的；在CN1552391A中公开了一种治疗SARS的消炎、退热药物，是由陈皮、双花、元芩、元柏、连翘、甘草、附子、柴胡、川贝、花粉、龙胆组成的；在0附552395八中公开了一种预防SARS病毒的中药制剂，由连翘、黄芩、赤芍、归尾、双花、麻黄、防风、大黄、牛子、青叶、花粉、皂角刺、佩兰磨成细粉，制成中药散剂，该发明是在古秘方治疗古代瘟疫病的基础上，在辨证施治的过程中不断修改完善的经验之方。萧伟等在CN1488380A中公开了一种中药组合物在制备抗SARS病毒的药物中的应用，该种中药组合物由羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄和甘草等原料制成。于灵恩在CN1449817A中公开了抗SARS病毒、治疗心脑血管栓塞的中药， 其组成为禹白附、黑附子、元胡。丁润泉在CN1454665A中公开了一种治疗SARS病毒的中药，主要包括黄芩、银花、连翘、石苇、黄芪、灵芝、丹参、赤芍、佩兰。李建青等在CN1552321A中公开了阿比朵尔在制备预防和治疗SARS病毒药物中的用途，通过体外细胞实验证明阿比朵尔对SARS病毒有显著的抑制作用。楼士荣在CN1451434A中公开了治疗和预防SARS病毒的中药，包含一枝黄花的原料制成的药物对SARS病毒和冠状病毒有十分明显的针对性杀灭和抑制效果。罗伟生等在CN1721387A中公开了一种从中药大黄中分离提取的大黄蒽醌类化合物具有强大的抑制SARS病毒的作用，体外实验表明，对SARS冠状病毒3C-lik印roteinase(3C-蛋白酶)药物剂量在100 μ g/mL时抑制率达85%以上。但是有关五味子在抑制SARS病毒方面的研究尚未见报道。
发明内容
在对中药五味子进行研究的过程中，我们发现五味子具有抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用，可以将其制备成SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，从而预防或治疗SARS冠状病毒感染。在一个方面，本发明提供了五味子在制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用。在上述应用中，所述五味子是指木兰科植物五味子(Schisandrachinensis (Turcz.)Baill.)的干燥成熟果实。在上述应用中，所述五味子经溶剂提取。其中，所述溶剂选自水、醇或其混合物。所述醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、乙二醇等，优选甲醇或乙醇。在一个具体实施例中，五味子经95%乙醇提取得到五味子的95%乙醇提取物。在上述应用中，对经提取后的五味子进一步进行有机溶剂萃取。其中所述有机溶剂选自石油醚、氯仿、乙酸乙酯、或正丁醇中的一种或多种。在一个具体实施例中，对经95%乙醇提取后的五味子依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。在上述应用中，所述五味子及其提取物可以用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。本发明采用离体活性测量的方法，对五味子进行活性测定，结果表明，五味子及其提取物具有很好的抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用，说明五味子及其提取物可以成为预防或者治疗SARS冠状病毒感染的潜在药物，或者与本领域公知的药物上可接受的适当载体或者赋形剂组成药物组合物，用于预防或者治疗SARS冠状病毒感染。
图1是五味子乙醇提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图；图2是五味子乙醇提取物各萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图；图3是五味子乙酸乙酯分段后各组分对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图；图4是从五味子乙酸乙酯萃取层中分离得到的4个化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图；图5是五味子甲素对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC5tl曲线图；以及图6是五味子乙素对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制活性IC5tl曲线图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式
。先对中药五味子的乙醇提取物进行SARS冠状病毒主蛋白酶体外活性筛选，发现其有活性。然后对其乙醇提取物进行萃取分段，根据活性指导原则，对活性部位进行进一步地分离纯化，旨在得到对SARS冠状病毒主蛋白酶具有抑制作用的具体化合物。化学提取分离纯化部分1)五味子浸膏的制备取一定量的五味子药材用醇、水或其混合物进行回流提取，料药比例为2: I 20: I (L/Kg)，每次提取I 8小时，共计提取3 5次。将提取液经过滤后减压蒸干得浸膏五味子提取物。2)五味子各萃取物的制备五味子各萃取物包括五味子乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。下面简述它们的制备过程。
取五味子乙醇提取物，用I 5倍量双蒸水超声I 3小时使其分散后，将其倒入分液漏斗中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，充分振摇，静置，分离出有机相和水相，每种溶剂萃取3次，将每种溶剂的有机相合并，并用旋转蒸发仪浓缩，分别得到干膏状的五味子石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。2)五味子乙酸乙酯萃取物的分离纯化。在活性指导下确定五味子乙酸乙酯萃取物为小分子抑制剂主要集中的部位，我们对五味子乙酸乙酯萃取层通过反复娃胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析法、制备HPLC等各种色谱法进行分离，得到一系列联苯环辛烯型木脂素化合物。为了简明起见，这些化合物的具体分离制备方法将在具体实施例中给出。药理活性测试部分1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化根据文献(YangH et al.Proc Natl Acad Sc1.2003 Nov ； 100 (23):13190-5)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化。具体方法如下:(1-1)SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体的构建，具体步骤包括:a.利用北京华大基因中心提供的编号为BJOl的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增；正向引物:5'-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3'反向引物:5'-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3'b.经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为Ikb左右的片段；c.将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌(Escherichiacoli)DH5a感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；d.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨卞青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为Ikb左右的目标基因片段；e.将目标载体pGEX-4T-l (购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；f.将d和e获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片断和目标载体片段按照摩尔数3:1 6:1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16°C反应30分钟 18小时)，转化大肠肝菌Escherichia coli DH5 α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-l载体中。(1-2) SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化，具体步骤包括:a.将上述步骤(1-1)中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的PGEX-4T-1 载体转化 Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用 LB 平板(含 100mg/L 氨苄青霉素)筛选阳性克隆 ；b.在a中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入IL的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当0D_达到0.6-0.8时，加入ImM左右的IPTG，在16°C培养12小时左右；c.5000 8000rpm离心10 15min，收集细胞，然后冰浴超声破菌20 30min ；破菌液13000rpm 15000rpm离心20 40min后收集上清液；d.将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20 30个柱床体积去除杂蛋白。最后加入2ml 0.lmg/ml左右的人类鼻病毒3C蛋白酶,在4°C酶切12 20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；e.将步骤(l-2d)中获得的SARS冠状病毒主蛋白酶再用Mono Q (GE公司)阴离子交换层析进行纯化，便可得到纯度较高的SARS冠状病毒主蛋白酶。2.SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法本发明所采用的筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法，具体方法如下:SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys (Dnp) -Lys_NH2 (纯度大于95%，上海吉尔生化有限公司)来完成的。该荧光底物的氨基酸序列来源于SARS冠状病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。用于突光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent突光仪(ThermoLabsystems,Helsinki, Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。在缓冲溶液(5OmMTris-HCl (pH 7.3)，ImM EDTA (含或不含 DTT))中加入 SARS 冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5 ii M)，加入备选样品的DMSO溶解物(使其终浓度为:500 u g/mL,底物浓度为20 u M，29 8K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL (DNP)1-册12，终浓度2(^10。设定对照:不加入备选样品，其余条件相同。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数，共测定10个点。以时间为X轴，荧光值为Y轴作图便可得到酶活动力学曲线。通过图上前两个点的数值计算斜率便可得到反应的初速度V，将阴性对照的反应初速度定义为Vtl,加入备选样品的反应初速度定义为Vi,从而计算出加入相应备选样品后蛋白酶的剩余活性(ViAtl)，相应备选样品的抑制率则为(1-ViZX)。对剩余活性小于20% (或抑制率大于80%)的备选样品进行进一步的分离纯化，直到分离到纯化合物。3.化合物对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的IC5tl值的测定将溶剂挥发干的各个化合物分别用95 %的DMSO溶解成50mg/mL的溶液。取10 yl的上述溶液用95 %的DMSO进行2倍的梯度稀释，共稀释成12个左右的样品溶液。用上述测定方法测试不同化合浓度下酶的剩余活性。将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的剩余活性值为Y轴，用GraphPad Prism5 (GraphPad software公司)作图并计算出相应的IC5tl值。下列实施例仅仅是用于解释本发明，而不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。实施例1五味子95%乙醇提取物的制备取2公斤的五味子药材(安徽省亳州市新兴中药材有限公司)用95%乙醇8升进行回流提取三次，每次提取2小时，将提取液经过滤后合并，用EYELAN1001型旋转蒸发仪(日本理化公司)减压浓缩，蒸干后得浸膏220克。实施例2五味子95%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的制备
将实施例1所得的五味子乙醇提取物取出30g，用300毫升双蒸水悬浮超声2小时进行分散，然后将其倒入I升分液漏斗中，按照有机溶剂极性依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次,每次用有机溶剂500晕升,充分振摇,静置3小时,分离出有机溶剂相并按有机溶剂种类合并，将各种有机溶剂萃取液用EYELAN1001型旋转蒸发仪浓缩，得到干膏状的五味子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，其中得到石油醚萃取物4克、乙酸乙酯萃取物9克、正丁醇萃取物6克。实施例3五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、和五味子醇甲的制备
权利要求
1.五味子在制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述五味子是中药五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述五味子经溶剂提取。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述溶剂选自水、醇或其混合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述醇是甲醇或乙醇。
6.根据权利要求3所述的应用，其中，所述溶剂是95%乙醇。
7.根据权利要求3所述的应用，其中，对经溶剂提取后的五味子进一步进行有机溶剂萃取。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述有机溶剂选自石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的一种或多种。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的应用，其中，所述五味子用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂 。
全文摘要
本发明提供了五味子及其提取物在预防或者治疗SARS冠状病毒感染中的应用。在终浓度为500μg/mL时，五味子95％乙醇提取物对于离体的SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制率达到92％，五味子95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制率为89.1％。
文档编号A61K131/00GK103156921SQ201110425050
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者饶子和, 杨诚, 娄智勇, 牛国君, 李燕星, 王波, 李金楠, 冯金磊, 陈卫强, 王鹏 申请人:天津市国际生物医药联合研究院