专利名称：表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的制作方法
技术领域：
本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVG (其保藏号为CGMCC No. 5402)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。
背景技术：
尼帕病脑炎是一种高度烈性人畜共患传染病，其病原尼帕病毒属于副粘病毒科， 亨尼帕病毒属，同属的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范围非常广泛，其中猪是重要的易感动物。尼帕病毒的自然宿主为果蝠[2]。该病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于马来西亚首次爆发，发病例数高达265例，死亡105例，死亡率为385 %。为了控制疾病的蔓延，马来西亚政府屠杀了一百多万头猪，占该国养猪量40%。此后，该病又在印度、孟加拉等国陆续发生，而本病的致死率也呈现上升趋势(67% -92% ) [3]。尼帕病毒给这些国家的畜牧业发展和人民健康造成了严重危害。我国目前虽然没有该病爆发，但其已经对我国构成了巨大威胁。果蝠在东南亚地区广泛分布，在我国南方地区分布较多，国内已有学者从我国南方地区的蝙蝠当中检测到了尼帕病毒抗体的存在W]。由于我国周边多个国家爆发该病，伴随着贸易往来的不断加深该病传入我国的压力也不断增大。且我国养猪数量极大，养猪业已成为我国农业的重要支柱性产业之一，因此该病一旦爆发势必会对我国的养猪业及人民群众的正常生活和生命安全造成严重危害，防控形势不容乐观。因此，储备可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的战略意义。尼帕病毒G蛋白是一种位于病毒粒子表面的II型跨膜糖蛋白，其主要功能是介导病毒与细胞受体结合从而启动病毒的感染过程。G蛋白是尼帕病毒的主要免疫保护性抗原，具有很好的免疫原性，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白。本研究以新城疫病毒LaSota弱毒株为载体，利用反向遗传操作技术成功构建了表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒活载体疫苗-rLa-NiVG，并在小鼠和猪体内对重组疫苗的免疫效果进行评价，实验证明此疫苗可以产生诱导机体良好的体液免疫反应，是防控尼帕脑炎病毒的优秀的候选疫苗，在我国应对尼帕病毒的潜在危害中显示了良好的应用前景，具有重要的战略意义。
发明内容
本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVG (其保藏号为CGMCC No. 5402)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。具体地，本发明成功构建了表达尼帕病毒(Nipah virus，NiV)G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVG (该疫苗株于2011年10月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC)，并在小鼠和断奶仔猪上系统评价了重组病毒产生的体液免疫反应。本发明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遗传操作系统构建了表达尼帕病毒G 蛋白的重组新城疫病毒rLa-NiVG。用间接免疫荧光和特异性细胞融合实验证实尼帕病毒 G蛋白的表达；将重组病毒免疫小鼠，用酶联免疫吸附试验(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕脑炎病毒G/F蛋白伪型病毒粒子做中和试验(VNA)以检测重组病毒的体液免疫水平。结果显示，rLa-NiVG能够正确表达尼帕病毒G蛋白。将所述重组病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫组小鼠可产生较高水平的特异性IgG;病毒中和试验显示免疫小鼠可以产生针对尼帕病毒的中和抗体；猪免疫试验表明，rLa-NiVG可以诱导猪产生高水平的尼帕病毒中和抗体。本研究成果目前国内外均无报道，具有很强的创新性。rLa-NiVG作为一种具有前瞻性，创新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候选疫苗，对我国应对尼帕病毒潜在威胁具有十分重要的战略意义。本发明提供制备表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤(1)构建重组转录质粒，该转录质粒包括其中插入尼帕病毒G基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因组cDNA序列，将所述重组转录质粒命名为pBRN_NiVG ；(2)构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括编码所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的辅助质粒pBSNP、编码所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白 (P)的cDNA序列的辅助质粒pBSP、和编码所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L) 的cDNA序列的辅助质粒pBSL ；(3)将步骤(1)的所述重组转录质粒PBRN-NiVG和步骤⑵的转录辅助质粒 pBSNP.pBSP.pBSL共转染所述新城疫LaSota疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和(4)收获上清液，过滤后接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。更具体地，制备表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下以人工合成的尼帕病毒G基因cDNA为模板，利用PCR方法分别在G基因两端插入新城疫病毒特异性基因起始和终止序列以及Riie I限制性酶切位点，测序鉴定无误，将G基因插入到LaSota全长基因组质粒(该质粒由本实验室制备，其制备方法可参见已获得授权的专利申请号200510097997. 8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人步志高，陈化兰，申请时间2005年9月2日)的P (磷蛋白)和M(基质蛋白) 基因之间的Pme I位点，构建成全长重组质粒pBRN-NiVG，利用质粒提取试剂盒大量制备此重组质粒，同时以辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL(所述辅助质粒的构建参见参考文献[5])共同转染BHK-21细胞(预先感染表达T7聚合酶的重组痘病毒)，72小时后以转染的细胞上清接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种72小时后取接种鸡胚的尿囊液做血凝试验HA和新城疫血凝抑制试验HI均呈阳性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重组病毒rLa-NiVG 感染BHK-21细胞，并同时转染表达尼帕病毒F蛋白的真核表达质粒PCAGG-NiVF，24小时后可以观察到尼帕病毒G和F蛋白共同表达介导的特异性细胞融合；另用鼠抗MVG蛋白单克隆抗体作一抗用间接免疫荧光检测尼帕G蛋白在rLa-NiVG感染的BHK-21细胞上的表达， 在荧光显微镜下可以观察到特异性的强烈的荧光信号。细胞融合试验与间接免疫荧光均证明重组病毒rLa-NiVG能够正确表达尼帕病毒G蛋白。本发明所用的新城疫LaSota疫苗株 AV1615(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC)也由本实验室制备，其制备方法可参见已获得授权的专利申请号200510097997. 8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人步志高，陈化兰，申请时间2005年9月2日。本发明还提供所述表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株用于制备预防尼帕病脑炎的疫苗的应用，优选地，所述表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株为rLa_NiVG。所述应用还包括所述表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株与表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株进行联合免疫。本发明还提供用于预防尼帕病脑炎的疫苗，所述疫苗包含有效量的本发明所述的表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。优选地，所述疫苗包含有效量的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa_NiVG。另外，所述疫苗还可以包含药用的佐剂或赋形剂等。本发明的用于预防尼帕病脑炎的疫苗可以用于预防哺乳动物中的尼帕病脑炎，所述哺乳动物包括，但不限于，猪、犬，猫，鼠和马等。本发明还提供用于预防哺乳动物中的尼帕病脑炎的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的包含本发明所述的表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株的疫苗，优选为rLa-NiVG。附图
简述参考下述附图，进一步描述本发明，在所述附图中图IrLa-NiVG的构建示意图；图2rLa_NiVG感染细胞的间接免疫荧光；图3尼帕病毒G、F蛋白共表达形成的合胞体；图4重组病毒的鸡胚生长曲线，纵轴表示LoglO鸡胚半数感染量，横轴表示接种时间；图5最大剂量重组病毒免疫后小鼠后体重变化；图6A rLa-NiVG免疫小鼠血清中特异性IgG水平(ng/ml)；图6B rLa-NiVG免疫小鼠中和抗体水平，纵坐标表示血清稀释的倍数；图7重组病毒诱导猪产生抗尼帕病毒中和抗体。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1:毒株与质粒新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(GenBank登录号AY84M00.2，由本实验室制备，其制备方法可参见已获得授权的专利申请号 200510097997. 8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人步志高，陈化兰，申请时间2005年9月2日)，表达尼帕病毒G蛋白的重组杆状病毒 rBac-NiVG[6]由本实验室保存(其详细的构建方法参见参考文献[6])，表达T7聚合酶的重组痘病毒VTF7-3由美国NIH的Bernard. Moss博士提供，其制备与滴定过程均按文献进行[7]，滴定后的病毒液-70°C保存备用。LaSota全长基因组转录质粒pBRN-FL以及辅助质粒pBSNP、pBSP、pBSL由本实验室保存[5](参考文献5详细说明了上述质粒的制备方法)，LaSota的反向遗传操作的详细过程已在文献[5]中详细说明。另外LaSota疫苗株的反向遗传操作系统可参见已获得授权的专利申请号200510097997. 8，发明名称为“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”，发明人步志高，陈化兰，申请时间2005年 9月2日。表达尼帕病毒G和F蛋白的真核表达质粒pCAGG-NiVG，pCAGG_NiVF[8]由本实验室保存(参考文献8详细说明了上述质粒的制备方法)。用于制备囊膜嵌合尼帕病毒G 和F蛋白的表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎假病毒粒子(VSVAG*GFP-NiVG/F)的重组 VSV基因组cDNA克隆质粒pVSV Δ G*GFP及辅助表达质粒pBS_G、pBS_L、pBS-N和pBS_P由美国田纳西大学的Michael Whitt博士提供[9](参考文献9详细说明了上述质粒的制备方法)。1. 1.2 细胞和血清细胞系BHK-21，Sf9昆虫细胞(购自美国典型培养物保藏中心ATCC)并在本实验室保存和使用。BHK-21细胞生长及维持液为含5%胎牛血清的 DMEM(购自Gibco) ；Sf9昆虫细胞培养液为Sf-900II (购自Gibco)无血清培养液。1. 1. 3单克隆抗体尼帕病毒G蛋白特异性单克隆抗体G3E9由本实验室制备并保存，详细制备方法见文献[10]；1. 1. 4 实验动物6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物公司。四周龄断奶仔猪购自哈尔滨兽医研究所实验动物基地并由哈尔滨兽医研究所实验动物基地繁殖并饲养。1. 2 表达NiV G基因的病毒基因组cDNA克隆的构建以PCAGG-NiVG为模板，通过PCR引物(见表1)在尼帕病毒G基因(其基因序列为SEQ ID No. 1，所编码的蛋白序列为SEQ ID No. 2)开放阅读框5'端引入Rne I限制性酶切位点识别序列(GTTTAAAC)和NDV(新城疫病毒)自身聚合酶L识别的转录终止序列GE (TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS (ACGGGTAGAA)，在3 ‘端引入Rne I限制性酶切位点；PCR产物经测序验证后，末端经Riie I酶切后插入pBRN-FL-Pmel (即，经过RiieI酶切的 pBRN-FL质粒)，构建成的重组全长基因组cDNA克隆命名为pBRN_FL_NiVG。表1构建表达NiV G基因全长基因组克隆质粒所用的引物
权利要求
1.一种表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。
2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕脑炎病毒G蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 2。
3.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕脑炎病毒G蛋白的基因序列为SEQ ID No. 1。
4.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其中所述用于表达G蛋白的新城疫LaSota疫苗株是AV1615。
5.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名为rLa_NiVG，保藏号为 CGMCC No. 5402。
6.一种用于预防尼帕病脑炎的疫苗，其包含有效量的权利要求1所述的表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其包含有效量的权利要求5所述的重组新城疫病毒 LaSota 疫苗株 rLa_MVG。
8.权利要求1-5中任一项所述的表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota 疫苗株用于制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其还包括所述表达尼帕病毒G蛋白的重组新城疫病毒 LaSota疫苗株与表达尼帕病毒F蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株进行联合免疫。
10.构建表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤(1)构建重组转录质粒，该转录质粒包括其中插入尼帕病毒G基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因组cDNA序列，将所述重组转录质粒命名为pBRN_NiVG ；(2)构建转录辅助质粒系统，该辅助质粒系统包括编码所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的辅助质粒pBSNP、编码所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的 cDNA序列的辅助质粒pBSP、和编码所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列的辅助质粒PBSL;(3)将步骤(1)的所述重组转录质粒pBRN-NiVG和步骤的转录辅助质粒pBSNP、 pBSP、pBSL共转染所述新城疫LaSota疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和(4)收获上清液，过滤后接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株。
全文摘要
本发明提供一种表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株及其制备方法和应用。具体而言，本发明提供表达尼帕脑炎病毒G蛋白的重组新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVG(其保藏号为CGMCC No.5402)及其在制备用于预防尼帕病脑炎的疫苗中的应用。
文档编号A61K39/155GK102559612SQ20111043188
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者步志高, 温志远, 葛金英 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所