专利名称：一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种四肽异构体的制备方法，具体的说本发明涉及一种利用固相多肽合成法合成四异构体的方法及其应用。
背景技术：
N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro)， 简写为Ac-S-D-K-P，它是一个氮端乙酰化的内源性四肽，广泛分布于体内各种组织及体液中。这个四肽主要由它的前体物胸腺素β 4经由脯氨酰寡肽酶(POP)水解而释放。在血液中的浓度一般为纳摩尔级。Ac-S-D-K-P的药代动力学研究发现，Ac-S-D-K-P静脉注入体内后，很快就被降解，半衰期仅为4 5min。Ac-S-D-K-P在人体内通过两种机制从血浆中清除①血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用；②肾小球滤过作用。其中血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用是Ac-S-D-K-P代谢的主要途径。Ac-S-D-K-P是一种多功能性生理调控因子，具有多种生物学活性。早期报道， Ac-S-D-K-P可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其静止在GO期，而抑制造血干细胞的活性。随后发现Ac-S-D-K-P通过促进血管的生成可以提高表皮的再植能力，加速受损的无血管表皮移植的伤口愈合。Ac-S-D-K-P能够抑制MGM刺激的骨髓干细胞分化成巨噬细胞，从而起到抗炎作用。近来发现Ac-S-D-K-P对多种细胞的增殖具有抑制作用。Ac-S-D-K-P是一种重要的抗多种器官纤维化的因子。Ac-S-D-K-P能抑制胶原等细胞外基质的合成。研究发现Ac-S-D-K-P对PDGF介导的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成均有抑制作用；进一步实验表明，Ac-S-D-K-P可能通过抑制血清中诸多因子或活性成分而发挥其抑制血清诱导刺激的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成及表达的作用，这可能与抗心脏纤维化的作用有关。除心脏纤维化以外，目前的研究在Ac-S-D-K-P对肾脏、肝脏、肺脏等器官纤维化方面，都能发挥一定的抗器官纤维化的活性。Ac-S-D-K-P具有非常显著的抗纤维化和抗炎的特点，但由于其进入人体后，在体内ACE的作用下迅速降解，使其浓度大大下降，极大地限制了其生物活性的发挥。因此，提供一种结构稳定，能够抵抗体内ACE的降解作用并持久发挥其生物学功能的Ac-S-D-K-P类短肽具有重要意义，而截止目前，国内外尚未见相关研究报道。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种固相多肽合成四肽的方法，用本发明方法所合成的Ac-S-D-K-P的异构体，通过对部分氨基酸残基进行D型改构，使其能够抵抗体内ACE的降解作用，并能够持久发挥其生物学功能。为实现第一目的，本发明采用如下技术方案一种利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的异构体的方法，所述的异构体包括 N-Acetyl-Ser-(d) Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp- (d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser- (d) Asp-(d)Lys-Pro，所述的方法包括
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以三苯氯甲基型树脂中的任一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得四肽树脂；其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所述的四肽异构体。其中，所述的方法包括四肽树脂的制备(1)制备 Fmoc-Pro-树脂或 Fmoc-D-Pro-树脂以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、 2-氯-三苯氯甲基树脂中的一种作为起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡 10-60分钟，其中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g ；在上述的树脂中，依次加入DIEA 或 DMAP、Rnoc-Pro-0H 或 Rnoc-D-Pro-OH，10-50 °C 反应0. 5-5小时，所得树脂分别用异丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗涤、获得Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树月旨；(2)制备 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤(1)所得Fmoc-Lys (Boc)-Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50°C反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60 分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次，加入用重蒸馏的DMF 溶解的 Fmoc-Lys (Boc) -OH 或 Fmoc-D-Lys (Boc) -0H、DIEA、TBTU/H0Bt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/ HOBt的混合物，10-50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次， 抽干，获得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(3)制备 Fmoc-D-Asp (otBu) - Lys (Boc) - Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤( 所得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂10_50°C反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-500C 反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的 DMF 溶解的 Fmoc-D-Asp (otBu) -OH 或 Fmoc-Asp (otBu) -OH、DIEA、TBTU/ HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10-50 °C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-树脂或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨；(4)制备 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tBu) -As ρ (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤(3)所得Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂 10-50 °C 反应 5-30 分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF 洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10_50°C反应 10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干；(5)制备 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤(4)所得 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10_50°C反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2 次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10_50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Bo c) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(6)制备四肽异构体粗品将步骤5吹干后的树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20_10°C的切肽试剂，所述的切肽试剂为TFA/EDT/H20/Thio的复合液，其中四者件的体积比为 90-95/2-5/2-5/1-5，10°C _50°C反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀， 离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1-6次，低温冷冻干燥IO-M小时，获得四肽异构体粗品，所述切肽试剂中，树脂的浓度为5-50ml/g。优选所述的步骤1中，DIEA或DMAP的摩尔数为树脂的2_20倍；Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的1-10倍；反应溶液中，树脂的浓度为0. l-5ml/g。优选所述的步骤2-5中，所述的脱帽试剂的组分和体积比为PIP DMF = 1 2-5。优选所述的步骤2-4中，Fmoc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Ser (tBu) -OH的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的1-5倍；Fmoc-Pro-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5_20ml/ g ；TBTU/HBTU/B0P的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2_5倍；H0Bt/H0At摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2-5倍。优选所述的步骤2中Fmoc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Ser (tBu) -OH的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的1-5倍；Fmoc-Pro-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5-20ml/g ； 所述的步骤3中，Fmoc-D-Asp (otBu)-OH摩尔数为树脂的2_5倍；所述的步骤5中，乙酸酐体积为树脂的重量的1-2倍。优选所述的步骤1在反应结束后再加入封闭试剂甲醇或苯甲酰氯吡啶10-50°C反应0. 2-3小时，所得树脂分别用异丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗涤、获得Fmoc-Pro-树脂或 Fmoc-D-Pro-树月旨。所述的四肽异构体粗品经C18或C8色谱柱分离纯化的方法包括如下步骤将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18或C8色谱柱纯化，流动相有两种A:0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；线性梯度洗脱；流速为l-150ml/min ；检测波长为215-285nm ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，分析，获得四肽异构体纯品。以下对本发明技术方案作进一步的详细介绍本发明公开了一种固相多肽四肽异构体的制备方法，所述方法以三苯氯甲基型树脂为合成树脂，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获得保护的四肽异构体树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或B0P/H0Bt或B0P/H0At 或 HBTU/HOBt 或 HBTU/HOAt 或 HATU/HOBt 或 HATU/HOAt 或 HCTU/HOBt 其中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的四肽异构体树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所需的四肽异构体。本发明所述的四肽异构体为N-Acetyl-Ser-(d) Asp-Lys-Pro、 N-Acetyl-Ser-Asp-(d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser-(d)Asp-(d)Lys_Pro，本说明书中，以下分别简称为四肽异构体①、异构体②和异构体③。本发明所使用的各试剂，均可采用现有市售的产品，供应商如四川三高生化股份有限公司及上海化学试剂公司等。本发明要求保护一种四肽异构体的合成方法，该方法优选包括采取封闭剩余位点的步骤，以减少杂肽的产生，利于纯化。此外，发明人在大大量实验研究的基础上，最终确定了一种最佳的合成路线及反应条件，最终得到了稳定性好、纯度和收率高的四肽异构体。按照本发明，依次连接具有保护集团的氨基酸，获得四肽异构体树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法及乙酰化包括以下步骤(1)制备 Fmoc-Pro-树脂或 Fmoc-D-Pro-树脂以三苯氯甲基型树脂作树脂，用N，N- 二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分钟， 混合物中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g ；然后在上述的树脂中，加入DIEA 或 DMAP、Rnoc-Pro-0H 或 Rnoc-D-Pro-OH，10-50 °C 反应0. 5-5小时，再加入封闭试剂甲醇或吡啶苯甲酰氯10-50°C反应0. 2-3小时，树脂用异丙醇洗涤、N, N- 二甲基甲酰胺，获得Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂；其中DIEA或DMAP的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2_20倍；
Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的1_5倍反应溶液中，树脂的浓度为0. l-5ml/g ；(2)制备 Fmoc-Lys (Boc) -OH 树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤(1)的Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50 °C 反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次，取少量树脂加茚三酮试剂， 沸水中加热3min，检测结果呈阳性，加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-Lys (Boc) -OH或 Fmoc-D-Lys (Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 B0P/H0Bt 的混合物，10-50 "C 反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加
茚三酮试剂，沸水中加热:3min，检测结果呈阴性，获得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树月旨；所述的脱帽试剂的组分和体积比为=PIP DMF = 1 2-5，下同；Fmoc-Lys (Boc) -OH或Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的 1-5 倍；Fmoc-Pro-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5_20ml/g ；TBTU/HBTU/B0P的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2_5倍；H0Bt/H0At摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2_5倍；茚三酮试剂配方5%的无水乙醇溶液；(3)制备 Fmoc-D-Asp (otBu) - Lys (Boc) - Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤⑵所得树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的 DMF 溶解的 RiiOc-D-Asp(OtBu)-OH 或 Rnoc-Asp (otBu)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/ HOBt或BOP/HOBt的混合物，10_50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次， DMF洗涤2次，取少量树脂加細1茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性，抽干，获得 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-丰对月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-丰对月旨；Fmoc-D-Asp (otBu) -OH或Fmoc-Asp (otBu) -OH摩尔数为树脂取代位点摩尔数的 1-5 倍；其余操作以及工艺条件同上；(4)制备 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tBu) -As ρ (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤(3)的Fmoc-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤O)；加入用重蒸馏的 DMF 溶解的 Fmoc-Ser (tBu) -OH 或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt或BOP/HOBt的混合物，10_50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2 次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性；(5)制备 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂(肽的乙酰化)在步骤的 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tB u) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤O)；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10-50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF 洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，所得到的肽树脂为Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或Ac-S er (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro -树脂；其中，乙酸酐体积为树脂的重量的1-2倍；按照本发明，对获得的四肽异构体树脂，需进行切割分离，得到四肽异构体粗品。 其按以下步骤进行把吹干的 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (ο tBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂或Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20-10°C的切肽试剂(TFA/EDT/H20/Thio = 90-95/2-5/2-5/1-5， 体积比)，IO0C -50°C反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1-6次，低温冷冻干燥IO-M小时，获得四肽异构体粗品；切肽试剂中，树脂的浓度为5-50ml/g。按照本发明，对得到四肽异构体粗品，需进行分离纯化，粗品经C18或C8色谱柱纯化的方法包括如下步骤将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18或C8色谱柱纯化，流动相有两种A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为 l-150ml/min ；检测波长为215-285nm ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，分析，获得四肽异构体纯品(MW 487. 5)。
本发明还要求保护一种含有上述四肽异构体的冻干粉针剂，所述的冻干粉针剂可采用现有技术公开的各种制备方法制备而成。具体制备方法的选择为本领域技术人员所掌握。此外，本发明要求保护的四肽异构体还可以进一步制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。此外，上述冻干粉针剂及其他剂型中还可以进一步含有一种或多种药学上可以接受的载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。上述药物的用量以四肽异构体的用量记，一般为每天800 μ g/kg体重。本发明的四肽异构体合成工艺路线有以下特点原辅材料来源方便，工艺稳定，生产周期短，生产成本低，收率高，纯度好，质量稳定，可规模化生产，极具市场竞争力。采用上述合成方法，本发明能够得到高纯度和产率的四肽异构体。
图1为实施例1中四肽异构体粗品色谱图；图2为实施例1中四肽异构体纯化图；图3为实施例1中四肽异构体纯品色谱图；图4为实施例2中四肽异构体粗品色谱图；图5为加入阴性抗体的裸细胞对照图6为阳性对照组，不加药物处理图7为异构体①处理组图8为异构体②处理组图9为异构体③处理组图10为四肽异构体对细胞增殖的影响
具体实施例方式以下用实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，将有助于对本发明的技术方案的优点及效果有更进一步的了解，此处仅例举最具代表性的实施方式，但实施例不限定本发明的保护范围，本发明的保护范围由权利要求决定。实施例1四肽异构体的合成方法以5g 二氯树脂为起点的四肽异构体①(N-Acetyl-kr-(d)ASp-LyS-PrO-C00H)合成过程为例1.肽树脂的合成(1)制备 Fmoc-Pro-树脂称取5克2-氯-三苯氯甲基树脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分钟，在上述的树脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH, 25°C反应2小时，再加入封闭试剂甲醇 1. 5ml，25°C反应2小时，树脂用35ml异丙醇洗涤两次、再用35ml N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF) 洗两次，获得Fmoc-Pro-树脂；(2)制备 Fmoc-Lys (Boc) -OH 树脂
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在步骤(1)的Fmoc-Pro-树脂中，加入35ml脱帽试剂，25 °C反应10分钟，用真空泵抽干，重新加入35ml脱帽试剂25 °C反应30分钟，抽干，用35ml异丙醇洗涤2次， 35mlDMF洗涤2次，重蒸馏的35mlDMF洗涤2次，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阳性。加入用重蒸馏的DMF溶解的4. 69gFmoc-Lys (Boc) _0H、2mlDIEA、 3. 22gTBTU、5mlH0Bt的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF 洗涤2次，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树月旨；所述的脱帽试剂的组分和体积比为=PIP DMF = 1 2. 5，下同；(3)制备 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤O)的Fm0c-Lys(B0c)-Pr0-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的 DMF 溶解的 4. 12g Fmoc-D-Asp (otBu)-0H、2mlDIEA、3. 22gTBTU、 5mlH0Bt的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，取少量树脂加細1茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂；其余操作以及工艺条件同上； (4)制备 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤(3)的Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的DMF溶解的3. 84g Fmoc-Ser (tBu)-OH、2mlDIEA、 3. 22gTBTU,2mlH0Bt的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性，获得Fmoc -Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树月旨；(5)制备 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂(肽的乙酰化)在步骤的 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤O)；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，所得到的肽树脂为获得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (B oc) -Pro-树脂；2.肽树脂的切割分离把吹干的Ac-Ser (tBu)-D-Asp (otBu)-Lys (Boc)-Pro-树脂倒入玻璃的切割瓶中， 加入预冷至_20°C的切肽试剂(TFA H2O = 95 5，体积比)80ml，20°C反应1. 5小时，过滤除去树脂，加-20°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用冷乙醚洗涤1次，低温冷冻干燥16 小时，获得四肽异构体粗品2. Ig ；3.对四肽异构体粗品的分离纯化(1)样品准备将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，备用。(2)四肽异构体粗品HPLC分析取滤液20 μ 1用HPLC分析，色谱条件CW色谱柱 (Hypersil-0DS2, Φ5· 4. 6X250mm)，流动相:A :0. 三氟乙酸力口 99. 9%/jC ；B :0. 1%H 氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为lml/min ；检测波长为215nm ；色谱图见图1。(3)四肽异构体粗品HPLC纯化
取滤液3ml 用 HPLC 纯化，选用 C18 色谱柱(Hypersil_0DS2，Φ5· 10X250mm)， 流动相A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为lOml/min ；检测波长为215nm ；收集目标峰液，样品峰合并后去盐，冻干，获得四肽异构体纯品1. 56g。纯化色谱图见图2。(4)四肽异构体纯品分析取少量样品，配成0. 5mg/ml，过滤，取20μ 1用HPLC分析，条件同四肽异构体粗品 HPLC分析条件，色谱图见图3。本实施例中，N-AcetyHer-(d)Asp-Lys-Pro粗品的纯度为91. 8670%，收率为 74.3%,纯度为98% (HPLC归一化法)。实施例2四肽异构体的合成方法(未封闭)以5g 二氯树脂为起点的四肽异构体①(N-Acetyl-Ser-(d)-Asp-Lys-Pro-COOH) 合成过程为例与实施例1相比，本实施例的区别点仅在于步骤1中未加入封闭试剂，步骤1制备 Fmoc-Pro-树脂步骤具体为称取5克2-氯-三苯氯甲基树脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分钟，在上述的树脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH，25°C反应2小时，树脂用35ml异丙醇洗涤两次、再用35ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗两次，获得Fmoc-Pro-树脂；本实施例中，采用不封闭的方法合成N-ACetyl-kr-(d)Asp-Lys-Pro，其粗品纯度为84. 8936%，其纯品的纯度为98% (HPLC归一化法)，收率为61. 7%。粗品色谱图见图4， 纯化图和纯品图和实例1相似，故略。实施例3四肽异构体②的合成方法以5g 二氯树脂为起点的四肽异构体②(Ν-Acetyl-Ser-Asp-d-Lys-Pro-COOH)合成过程为例1.肽树脂的合成(1)制备 Fmoc-Pro-树脂称取5克2-氯-三苯氯甲基树脂，用二氯甲烷(DCM) IOOml浸泡60分钟，在上述的树脂中，加入DIEA 4. 5ml, 3. 38g Fmoc-Pro-OH, 25°C反应2小时，再加入封闭试剂甲醇 1. 5ml，25°C反应2小时，树脂用35ml异丙醇洗涤两次、再用35ml N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF) 洗两次，获得Fmoc-Pro-树脂；(2)制备 Fmoc-D-Lys (Boc) -OH 树脂在步骤(1)的Fmoc-Pro-树脂中，加入35ml脱帽试剂，25°C反应10分钟，用真空泵抽干，重新加入35ml脱帽试剂25 °C反应30分钟，抽干，用35ml异丙醇洗涤2次， 35mlDMF洗涤2次，重蒸馏的35mlDMF洗涤2次，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热 3min，检测结果呈阳性。加入用重蒸馏的DMF溶解的4. 69gFmoc-D-Lys (Boc) _0H、2mlDIEA、 3. 22gTBTU、5mlH0Bt的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF 洗涤2次，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树月旨；所述的脱帽试剂的组分和体积比为PIP DMF = 1 2. 5，下同；(3)制备 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂
在步骤O)的Fm0c-D-Lys(B0c)-Pr0-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的 DMF 溶解的 4. 12g Fmoc-Asp (otBu)-0H、2mlDIEA、3. 22gTBTU、 5mlH0Bt的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，取少量树脂加細1茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂；其余操作以及工艺条件同上； (4)制备 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤(3)的Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤；加入用重蒸馏的DMF溶解的3. 84g Fmoc-Ser (tBu) -OH或 3. 84gFmoc-D-Ser (tBu) -OH,2mlDIEA,3. 22gTBTU、2mlH0Bt 的混合物，22 °C 反应 60 分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加茚三酮试剂，沸水中加热 3min，检测结果呈阴性，获得 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(5)制备 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂(肽的乙酰化)在步骤的 Fmoder (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22°C反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，所得到的肽树脂为获得Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (B oc) -Pro-树脂；2.肽树脂的切割分离把吹干的Ac-Ser (tBu)-Asp (otBu)-D-Lys (Boc)-Pro-树脂倒入玻璃的切割瓶中， 加入预冷至_20°C的切肽试剂(TFA H2O = 95 5，体积比)80ml，20°C反应1. 5小时，过滤除去树脂，加-20°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用冷乙醚洗涤1次，低温冷冻干燥16 小时，获得四肽异构体粗品2. 2g ；3.对四肽异构体粗品的分离纯化(1)样品准备将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，备用。(2)四肽异构体粗品HPLC分析取滤液20 μ 1用HPLC分析，色谱条件CW色谱柱 (Hypersil-0DS2, Φ5· 4. 6X250mm)，流动相:A :0. 三氟乙酸力口 99. 9%/jC ；B :0. 1%H 氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为lml/min ；检测波长为215nm。(3)四肽异构体粗品HPLC纯化取滤液3ml 用 HPLC 纯化，选用 Cw 色谱柱(Hypersil_0DS2，Φ5um 10X250mm)，流动相A:0. 三氟乙酸加99. 9%水；B 0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；梯度洗脱；流速为 lOml/min ；检测波长为215nm ；收集目标峰液，样品峰合并后去盐，冻干，获得四肽异构体纯品1. 6g。(4)四肽异构体纯品分析取少量样品，配成0. 5mg/ml，过滤，取20 μ 1用HPLC分析，条件同四肽异构体粗品 HPLC分析条件。本实施例中，异构体②(N-AcetyHer-Asp-(d)-Lys-Pro)的收率为72. 7%，纯度为98% (HPLC归一化法)。色谱图和实例1、2相似，故略。
实施例4四肽异构体③的合成方法以5g二氯树脂为起点的四肽异构体③，与实施例1相比，区别仅在于本实施例仅将合成过程中Fmoc-Lys (Boc) -OH换为Fmoc-D-Lys (Boc) -0H,本实施例中，异构体③的纯度 ^ 98. 8% (HPLC归一化法)，纯品收率为79.3%。色谱图和实例1、2相似，故略。实验例1本发明短肽及其异构体抑制BMSC分化为巨噬细胞小鼠的骨髓干细胞(BMSC)在巨噬细胞生长培养基(MGM)中培养，7天后可刺激分化为巨噬细胞，在刺激过程中，加入本发明短肽，则对BMSC分化为巨噬细胞起有效的抑制作用。断颈处死小鼠，并浸泡于75%的酒精中消毒;3min。将小鼠的股骨和胫腓骨去除， 并剥离表面组织，用1640培养液冲洗骨髓腔，收集冲洗出的细胞液，贴壁缓慢加入ficoll 分离液上层，1800rpm离心20min。吸取云雾层，并用1640培养液洗涤2遍。移入6孔板， 于37°C 0)2孵箱培养。每天给每孔加Ac-S-D-K-P，终浓度为ΙΟηΜ，第8天常规消化细胞， 并离心收集各孔细胞，用流式细胞洗液洗涤细胞两次，加入巨噬细胞特异性的FITC标记的 F4/80抗体，4°C避光孵育30min。离心收集细胞，流式细胞洗液洗涤两次，加入流式细胞固定液固定细胞，细胞样品进行流式细胞仪检测。结果如图5、图6、图7、图8、图9所示，图5 为加入阴性抗体的裸细胞对照，显示巨噬细胞的表达率为3. 7% ；图6为阳性对照组，不加药物处理，显示巨噬细胞表达率为91. 5% ；图7为异构体①处理组，显示巨噬细胞表达率为 75. 6% ；图8为异构体②处理组，显示巨噬细胞表达率为74. ；图9为异构体③处理组， 显示巨噬细胞表达率为68.4%。说明本发明短肽及其异构体具有抑制BMSC分化为巨噬细胞的能力。本实验例中，BMSC分化成巨噬细胞后，能分泌TNF等因子，导致局部炎症发生， 本发明的四肽异构体能从源头抑制BMSC向巨噬细胞分化，从而具有抗炎的活性。其中，异构体①、②、③分别采用实施例1、3、4所得的四肽异构体。实验例2本发明短肽及其异构体抑制细胞的增殖。实验前用无血清的DMEM培养液培养细胞Mh。常规消化细胞，以5000个/孔的细胞密度种96孔板，每孔180 μ L，待细胞贴壁后，每孔加入20 μ L Ac-S-D-K-P溶液，使孔内Ac-S-D-K-P终浓度为10 μ Μ,每种Ac-S-D-K-P药物设6个复孔。放入37°C CO2孵箱培养Mh，然后每孔加20 μ L MTT溶液(5mg/mL)，继续37°C孵育4h。吸弃各孔液体，每孔加入 100 μ L 二甲基亚砜(DMSO)，充分震荡混勻lOmin。用酶联免疫标定仪，检测490nM的吸光度值。结果如图10，其中1组为阳性对照，2组为天然Ac-S-D-K-P处理组，3组为本发明四肽异构体①处理组，4组为四肽异构体②处理组，5组为四肽异构体③处理组。天然Ac-S-D-K-P 处理组与阳性对照组相比D49tl降低(P < 0. 05)；异构体①处理组与阳性对照组相比D49tl明显降低(P < 0. 01)；异构体②处理组与阳性对照组相比D49tl明显降低(P < 0. 01)；异构体 ③处理组与阳性对照组相比D49tl明显降低(P < 0. 01)。该实验例说明本发明短肽及其异构体均具有抑制细胞的增殖的能力，并且比天然Ac-S-D-K-P的效果更为显著。本实验例中，L929是小鼠成纤维细胞，本发明的四肽异构体能够抑制成纤维细胞增殖，从而能够说明它们具有抗纤维化的活性。其中，异构体①、②、③分别采用实施例1、3、4所得的四肽异构体。实验例3稳定性试验
将本发明的四肽异构体①、异构体②和异构体③分别与ACE在37°C作用12h，HPLC 检测分析，结果显示均未被ACE降解；而天然Ac-S-D-K-P与ACE在37°C作用lOmin，HPLC 检测分析，结果显示天然Ac-S-D-K-P已基本完全降解。足以说明本发明制备所得的四肽异构体具有优越的稳定性，其中，尤其以异构体③的稳定性最佳。由上述实验例可知，本发明要求保护的四肽异构体具有非常显著的抗纤维化和抗炎效果，以本发明的四肽异构体为活性成份的抗纤维化药物和抗炎药物，具有优于天然 Ac-S-D-K-P的特性，而且在体内抗ACE降解，半衰期大大延长(> 12h)，更能够持续有效的发挥功能。该四肽异构体可以广泛应用于制备抗纤维化和抗炎药物。
权利要求
1.一种利用固相多肽合成四肽Ac-S-D-K-P的异构体的方法，其特征在于所述的异构体为 N-Acetyl-Ser-(d)Asp-Lys-Pro、N-Acetyl-Ser-Asp-(d) Lys-Pro 及 N-Acetyl-Ser- (d)Asp- (d) Lys-Pro，所述的方法包括以三苯氯甲基型树脂中的任一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得四肽树脂；其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所述的四肽异构体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括四肽树脂的制备(1)制备Fmoc-Pro-树脂或 Fmoc-D-Pro-树脂以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂中的一种作为起始原料，用N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷浸泡10-60分钟， 其中，树脂的重量体积浓度为5-20ml/g ；在上述的树脂中，依次加入DIEA或DMAP、Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH，10_50°C反应0. 5-5小时，所得树脂分别用异丙醇和N，N-二甲基甲酰胺洗涤，获得Fmoc-Pro-树脂或 Fmoc-D-Pro-树月旨；(2)制备Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤1所得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50°C反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟， 抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次，加入用重蒸馏的DMF溶解的 Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Rnoc-D-Lys(Boc)-OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10-50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干， 获得 Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(3)制备 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) - Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤2所得Fmoc-Lys (Boc) -Pro-树脂或Fmoc-D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂10-50°C反应5-30分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟， 抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的DMF溶解的 Fmoc-D-Asp (otBu) -OH 或 Fmoc-Asp (otBu) -OH、DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10-50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，获得 Fmoc-D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(4)制备Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tBu) -Asp (ot Bu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂在步骤 3 所得 Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树月旨或 Fmoc-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂 10-50 °C 反应 5-30 分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF 洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入用重蒸馏的DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH或 Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, DIEA、TBTU/HOBt 或 HBTU/HOBt 或 BOP/HOBt 的混合物，10_50°C反应 10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干；(5)制备Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu)-D-Lys (Boc) -Pro-树月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树月旨在步骤 4 所得 Fmoc-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树脂或 Fmoc-Ser (tBu) -A sp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂中，加入脱帽试剂10_50°C反应5_30分钟，用真空泵抽干， 重新加入脱帽试剂10-50°C反应10-60分钟，抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤2次；加入乙酸酐、DCM、DIEA的混合物，10_50°C反应10-60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，重蒸馏的DMF洗涤1次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60 分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，得Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -Lys (Boc) -Pro-树月旨或 Ac-Ser (tBu) -Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-丰对月旨或 Ac-Ser (tBu) -D-Asp (otBu) -D-Lys (Boc) -Pro-树脂；(6)制备四肽异构体粗品将步骤5吹干后的树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20-10°C的切肽试剂，所述的切肽试剂为TFA、H20或加入EDT/Thio中的任意一种以上组成的复合液，各组分的体积比分别为90-95/2-5/2-5/1-5，10°C _50°C反应1-5小时，过滤除去树脂，加-20-10°C的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1-6次，低温冷冻干燥IO-M小时，获得四肽异构体粗品，所述切肽试剂中，树脂的浓度为5-50ml/g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1中，DIEA或DMAP的摩尔数为树脂的2-20倍；Fmoc-Pro-OH或Fmoc-D-Pro-OH的摩尔数为树脂的1_10倍；反应溶液中， 树脂的浓度为0. l-5ml/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2-5中，所述的脱帽试剂的组分和体积比为PIP 2-5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2-4中，TBTU/HBTU/BOP的摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2-5倍；HOBt/HOAt摩尔数为树脂取代位点摩尔数的2_5倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2中，Fmoc-Lys(Boc)-OH或 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的1_5倍；Fmoc-Pro-树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5-20ml/g ；所述的步骤3中，Fmoc-D-Asp (otBu)-OH摩尔数为树脂的2_5倍；所述的步骤5中，乙酸酐体积为树脂的重量的1-2倍。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于所述的步骤1在反应结束后再加入封闭试剂甲醇或苯甲酰氯吡啶10-50°C反应0. 2-3小时，以封闭剩余的未结合位点，，所得树脂分别用异丙醇和N，N- 二甲基甲酰胺洗涤、获得Fmoc-Pro-树脂或Fmoc-D-Pro-树脂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的四肽异构体粗品经Cw或C8色谱柱分离纯化的方法包括如下步骤将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18或C8色谱柱纯化，流动相有两种 A :0. 三氟乙酸加99. 9%水；B :0. 三氟乙酸加99. 9%乙腈；线性梯度洗脱；流速为 l-150ml/min ；检测波长为215-285nm ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，分析，获得四肽异构体纯品。
9.一种包含权利要求1所述方法所制得四肽Ac-S-D-K-P的异构体的冻干粉针剂。
10.权利要求1所述方法所制得四肽Ac-S-D-K-P的异构体在制备治疗抗纤维化和抗炎药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种利用固相多肽合成四肽异构体的方法，所述的方法包括以三苯氯甲基型树脂的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获得四肽异构体树脂；其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用缩合剂进行接肽反应，获得保护的四肽异构体树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得四肽异构体粗品，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，获得所述的四肽异构体。本发明要求保护的四肽异构体合成方法具有原辅材料来源方便，工艺稳定，生产周期短，生产成本低，收率高，纯度好，质量稳定的优点，可规模化生产，极具市场竞争力。
文档编号A61K38/07GK102558298SQ20111043667
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者张伟, 张昭, 张英起, 李萌, 杨赛, 王增禄, 黄同列 申请人:中国人民解放军第四军医大学