专利名称：一种提高畜禽免疫功能的甘草次酸纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，及其提高畜禽免疫功能的应用，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。
背景技术：
甘草是一味最常用的补气药，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药等功效，在多种疾病防治中起到重要作用。甘草次酸作为甘草的主要有效成分，主要从甘草的根部或根茎提取而得，属五环三萜皂苷类化合物。现代研究表明甘草次酸具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、肾上腺皮质激素样作用等多种药理作用。但由于甘草次酸难溶于水，常规的给药方式，如口服、皮下注射、静脉注射等，甘草次酸几乎不能被吸收，生物利用度非常低，这样大大降低了甘草次酸的临床应用价值。同时，甘草次酸会产生钠潴留、钾流失、高血压等不良副作用，而且这些副作用可能存在剂量依赖关系。因而，研究甘草次酸新剂型，提高其生物利用度，减小其不良副作用就变得非常必要。脂质体是由类脂质制备的具有复层或单层单位膜结构的小囊，其结构类似生物膜，在体内能生物降解。由于脂质体成份为磷脂和胆固醇，也是生物细胞膜的主要成分，属机体内源性物质，具有良好的生物相容性和可降解性，无毒、无免疫原性。脂质体的结构和生物细胞相似，易被细胞吸附、融合、脂交换、内吞而被细胞摄取；且具有一定的弹性和变形性，比相同粒径的其他类型的纳米粒容易进入病灶组织。因此，脂质体已成为现代药物载体研究的内容之一。同时脂质体还可用作免疫佐剂，早在1974年由Allison等首次报道脂质体能增强机体的体液和细胞介导的免疫应答，对疫苗的增效作用可达数十倍甚至更高。脂质体具有靶向释药、 缓释、无免疫原性、降低药物毒副作用等优势。脂质体是微米级类脂质双分子层结构，大小于I οομπι之间。如果在脂质体的类脂质双分子层中加入适当表面活性剂，则可形成纳米脂质体。纳米脂质体除粒径小于普通脂质体外，还具有高度的自身变形性，更易于提高其生物利用度。如将甘草次酸包封于脂质体中，脂质体不仅可以避免甘草次酸的不良副作用，而且可以有效维持甘草次酸在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度。因而脂质体可以作为甘草次酸的一种优良载体。本发明首次将甘草次酸制备成纳米脂质体，并将其和动物疫苗一起应用，建立了甘草次酸纳米脂质体的制备方法，优化了制备条件，发现甘草次酸纳米脂质体能显著提高甘草次酸的免疫增强作用，提高其生物利用度。
发明内容
技术问题本发明针对甘草次酸水溶性低、不易被吸收、易产生不良反应，生物利用度低等问题，提供一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，达到显著提高甘草次酸免疫增强作用目的，并应用于畜禽临床。技术方案
用薄膜分散法及响应面法设计甘草次酸纳米脂质体的制备方法。经优化后甘草次酸纳米脂质体最佳制备方法为:称取大豆磷脂150mg、胆固醇60mg、吐温-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振摇使之充分溶解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22 μ m的微孔滤膜。将脂质体置于-20°C条件下冻结，之后置于31°C水浴中融化，如此反复操作两次。按此方法制备的甘草次酸纳米脂质体，平均包封率为83.46%、粒径在150nm以下。将甘草次酸纳米脂质体和疫苗一起应用于鸡，能显著提高其细胞免疫功能和体液免疫功能，对提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要应用价值。有益效果动物疫病主要靠疫苗来预防，但是很多疫苗存在免疫原性较弱等缺点，需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等常存在刺激性强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点，从中药中开发免疫增强剂已成为热点。甘草次酸是甘草的主要药效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、肾上腺皮质激素样等多种药理作用。但由于甘草次酸难溶于水，常规的给药方式，如口服、皮下注射、静脉注射等，甘草次酸几乎不能被吸收，生物利用度非常低，这样大大降低了甘草次酸的临床应用价值。利用脂质体包封甘草次酸，不仅可以有效维持甘草次酸在机体内的有效浓度，提高了其生物利用度，而且可以避免甘草次酸的不良副作用。本发明采用卵磷脂、胆固醇及表面活性剂吐温-80将甘草次酸制备成纳米脂质体，包封率较高、粒径小，不仅便于药物的吸收，而且可以使药物缓慢地的释放，有效地延长了药效，能显著提高动物细胞免疫功能和体液免疫功能，对抵抗疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药，没有副作用。与现有技术相比，本发明优点如下:1.甘草次酸纳米脂质体的制备国内外未见报道，本发明提供了一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法及其优化的条件，填补了国内外研究的空白。2.甘草次酸纳米脂质体的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施，证明甘草次酸的免疫增强作用弱，通过制备成纳米脂质体后能够显著提高其免疫增强活性，表现为明显提高抗体效价、淋巴细胞增殖、IgG和IgM含量、淋巴细胞亚群⑶4+和⑶8+比率，与甘草次酸比，在免疫后期效果更好，具有较强的缓释作用，从而增强动物体液免疫和细胞免疫。因此，甘草次酸纳米脂质体可以作为研制新型免疫增强剂的材料，为研制新型免疫增强剂提供了材料和不范。
具体实施例方式1.甘草次酸纳米脂质体的制备采用薄膜分散法制备甘草次酸脂质体。精密称取大豆磷脂、胆固醇、吐温-80和甘草次酸，加入IOmL氯仿振摇使之充分溶 解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22 μ m的微孔滤膜。将脂质体置于_20°C条件下冻结，之后置于水浴中融化，如此反复操作两次，以提高包封率。在单因素试验的基础上，选出对脂质体包封率有较显著影响的三个因素:脂药比(大豆磷脂与甘草次酸质量比，A)、膜材比(大豆磷脂与胆固醇质量比，B)和水浴温度(°C)。再根据脂药比、膜材比和水浴温度3个单因素试验所确定的水平范围，采用Design-Expert 7.0软件设计响应面试验，选用BBD模型，以脂质体的包封率为响应值，做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表I。由表I可见，包封率从44.32%到81.00%变化。对试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得出Y与影响因素Xi之间关系的拟合方程式如下:Y = 80.33-7.83x^5.25χ2+0.76χ3_1.32χ1χ2-7.29χ1χ3+3.06χ2χ3_9.δΙχ^-6.46χ2_12.40χ32表IBox-Behnken试验设计表及结果
权利要求
1.一种甘草次酸纳米脂质体的制备方法，采用薄膜分散法及响应面法设计优化制备甘草次酸纳米脂质。
(1)采用薄膜分散法制备甘草次酸纳米脂质体。精密称取大豆磷脂150mg、胆固醇60mg、吐温-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振摇使之充分溶解。在旋转蒸发仪上减压蒸发除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一层均匀的薄膜，后加入磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)，继续旋转洗脱至薄膜完全溶解，经水浴超声20min，形成纳米脂质体，再将其过孔径为0.22 μ m的微孔滤膜。将脂质体置于-20°c条件下冻结，之后置于31°C水浴中融化，反复2次。
(2)按照上述方法制备甘草次酸纳米脂质体的条件为:脂药比为9.0: 1，膜材比为2.5: 1，水浴温度为31°〇。
(3)在最佳条件下制备的甘草次酸纳米脂质体，包封率平均值为83.46±0.55%。
2.权利要求1所述方法获得的甘草次酸纳米脂质体能够显著提高动物体液免疫和细胞免疫功能，具有较好 免疫增强功能。
全文摘要
本发明涉及一种提高畜禽免疫功能的甘草次酸纳米脂质体及其制备方法，属于中兽药制备技术及免疫应用领域。用薄膜分散法制备甘草次酸纳米脂质体，以包封率为指标，采用响应面法研究了脂药比、膜材比和水浴温度3个因素并对其进行优选，确定最佳制备条件为脂药比为9.0∶1，膜材比为2.5∶1，水浴温度为31℃，所得甘草次酸纳米脂质体的包封率高，免疫增强活性强。本发明甘草次酸纳米脂质体显著提高了甘草次酸的免疫增强活性。
文档编号A61P37/04GK103181895SQ20111044837
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者王德云, 赵晓娟, 胡元亮, 刘家国, 范云鹏, 袁菊 申请人:南京农业大学