专利名称：一种呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体来说，涉及一种人呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法。
背景技术：
呼吸道合胞病毒是一种单股负链非节段性的RNA病毒，属于粘病毒科，肺炎病毒属。内部核心是衣壳蛋白包裹的RNA，外层包被有源于宿主的脂质双分子层，以及跨膜蛋白。病毒主要编码11种蛋白质，三种跨膜蛋白与免疫保护及致病毒力相关，分别是融合蛋白F，黏附蛋白G,和小疏水蛋白SH。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV),是在世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的主要原因之一，其作为导致不足一岁婴儿的肺炎和细支气管炎的病因比其它所有的微生物病原体都严重。实际上，所有儿童在两岁内均会被感染，且在较大一点的小孩和青年人身上发生再感染的频率也较高。尽管大多数健康的成年人没有严重的RSV感染的疾病，但是稍老年的病人以及无免疫应答的个体通常会遭受严重的感染甚至可能危及生命。现阶段，抗病毒药物只能一定程度上缓解临床症状和缩短患病时间。因此，预防性给予抗病毒药物仍然是最有效的临床措施。而目前RSV还没有理想的针对性疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中的缺陷，提供一种能够在人体内产生更快、更高的免疫应答反应 ，且副反应少的的人用新型呼吸道合胞病毒疫苗。本发明公开了一种利用VeiO细胞来工业化大规模生产人呼吸道合胞病毒灭活疫苗的方法。本发明方法中病毒繁殖的细胞基质为Veix)细胞，是世界卫生组织(WHO)准予用于人用生物制品的细胞基质。与二倍体细胞相比，具有易培养，并可满足用发酵罐(微载体技术)大规模生产等明显优势，VeiO细胞现在已经被国内外广泛用于生产人用精制狂犬疫苗，乙脑疫苗等升级换代产品。本发明公开了一种利用VeiO细胞制备人呼吸道合胞病毒灭活疫苗的方法，包括下列步骤:1.在培养基中静止或立体吸附培养Vero细胞，获得Vero细胞浓度达到IO5-1O7/ml的细胞基质培养液；2.人呼吸道合胞病毒从发病2天的患者咽拭子采集，经常规分离，以0.01-0.2的感染剂量(M.0.1.)，将病毒接种到步骤I的细胞基质培养液中，培养6-10天；3.用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液；4.纯化病毒制备疫苗。本发明还公开了一种疫苗组合物，包括病毒蛋白含量100-200 μ g/剂的利用上述方法制备获得的人用呼吸道合胞病毒疫苗和0.5mg/剂磷酸铝佐剂。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1自液氮容器中，取出Vero细胞株(来源，中国药品生物制品检定所)，离心IOOOrpm, 10分钟，弃去原保存液，加入含有10%新生牛血清，0.20%水解乳蛋白的MEM营养液(pH用7% NaHCO3调至6.8)置37°C培养，待细胞长成单层，然后用PBS洗涤，胰酶-EDTA消化，加入上述营养液，以1: 2分种率，每5天传代I次，直至获得批量生产需用的足够细胞。在上述细胞培养浓度达到106/ml时，在pH7.4的培养液中按0.05的M.0.1.的分种率加入人呼吸道合胞病毒毒株，静止吸附培养8天。其间换I次维持液。培养期满后，用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液。该病毒-细胞培养悬液经超声波处理而粉碎细胞，至细胞破碎率达95%以上。之后用氯仿提抽4次，每次振荡35分钟，离心3000rpm，40分钟提取上清液，去除杂蛋白。所得上清液用10% PEG (分子量6000)和0.4M的NaC I溶液浓缩，离心lOOOOrpm，2小时，收集沉淀。将收集的沉淀用PBS悬浮，甘油蔗糖不同梯度离心，浓度范围:从底层开始0.5ml，80%甘油(IOOmM NaCl, IOOMm TrispH7.4), 1.8ml 30%蔗糖，1.8ml 20%鹿糖,，1.8 ml 10%鹿糖(含 10% SDS)。离心 37000rpm,6 小时。Sepharose_4FF凝胶过柱进一步出去宿主残余DNA和杂蛋白。将纯化后的病毒用1: 4000甲醛灭活12天，分装成品每剂量为含有病毒蛋白100-200 μ g，磷酸铝佐剂0.5mg/剂。实施例2用上述实施例1方法的磷酸铝佐剂，灭活病毒疫苗和疫苗组合物(灭活病毒疫苗+磷酸铝佐剂)分别免疫小鼠，每次免疫0.5ml，O天、7天分别免疫两次，观察14天后采血，检测血清中和抗体和效价。表1
权利要求
1.一种制备人呼吸道合胞病毒灭活疫苗的方法，包括下列步骤: a.在培养基中静止或立体吸附培养Vero细胞，获得Vero细胞浓度达到105-107/ml的细胞基质培养液； b.人呼吸道合胞病毒从发病2天的患者咽拭子采集，经常规分离，以0.01-0.2的感染剂量(M.0.1.)，将病毒接种到步骤a的细胞基质培养液中，培养6-10天； c.用胰酶-EDTA消化获得病毒-细胞培养悬液； d.纯化病毒制备疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞基质培养液为含有2%-10%新生牛血清和0.20-0.30%水解乳蛋白的MEM营养液，该MEM营养液pH为6.8-7.4。
3.根据权利要求1所述方 法制备获得的人呼吸道合胞病毒灭活疫苗。
4.一种疫苗组合物，包含如权利要求3所述的人呼吸道合胞病毒灭活疫苗和磷酸铝佐剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于所述人呼吸道合胞病毒灭活疫苗的含量为100-200 μ g/剂，磷酸铝佐剂的含量为0.5mg/剂。
全文摘要
本发明公开了一种人呼吸道合胞病毒灭活疫苗及其制备方法，所述的疫苗含有呼吸道合胞病毒全病毒颗粒经裂解后的膜蛋白。其中，人呼吸道合胞病毒灭活疫苗每剂量含有病毒蛋白100-200μg，磷酸铝佐剂0.5mg/剂。本发明的人用人呼吸道合胞病毒灭活疫苗，相比现有的病毒纯化原液含有的杂蛋白大大减少，具有更高的免疫原性和效力，使用更加安全，更加适于大规模化生产。
文档编号A61K39/155GK103182079SQ20111045897
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者田平生, 丛薇, 陈明杰 申请人:上海泽润生物科技有限公司