专利名称：一种治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗、药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及同时携带人白细胞介素2及人肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因的真核共表达质粒载体的减毒沙门氏菌口服菌苗预防和靶向治疗实体瘤的应用，特别是涉及同时携带人白细胞介素2及人肝细胞生长因子拮抗剂双基因的重组减毒沙门氏菌疫苗在预防和治疗早、中、晚期实体瘤疾病中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康与生命的最主要的疾病之一。最新的流行病学调查结果显示，我国现有癌症病人数300多万，持续以每年3%的速度递增。手术、放疗和化疗是目前恶性肿瘤治疗的主要手段。但手术只适合早期且局限的病灶；而放疗、化疗的“治疗窗”较狭窄，在杀伤肿瘤细胞时，对机体的正常细胞特别是造血和免疫系统也造成损害，常常引起贫血、出血感染、胃肠道反应、脱发等症状，病人的生活质量较差。目前在我国每年因癌症而死亡的人数约130万人。从卫生经济学的角度看，恶性肿瘤是花费最多，治疗效果最差的疾病。因此，恶性肿瘤的治疗问题一直是医药卫生领域亟待解决的重大课题，对于全面提高我国人民的健康水平十分重要。九十年代以来随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤的生物治疗已逐渐被人们所认可。近年来，基因治疗已成为肿瘤治疗的热点，主要是导入有治疗价值的外源基因，从而诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。
肝细胞生长因子(h印atocyte growth factor, HGF)是由间质细胞产生的多功能细胞因子，具有强促分裂、组织形成、诱导上皮细胞迁移，侵袭及诱导血管生成等作用，这些都有利于肿瘤组织的发生与发展(Zeng Q，Chen S，You Z，et al =Hepatocyte growthfactor inhibits anoikis in head and neck squamous cell cancinoma cells byactivation of ERK and AKt signaling independ of NK-KB (J), J Biol Chem,2002,277 (28) :25203)。 1997年Date等用胰弹性蛋白酶对重组人HGF进行消化裂解，发现了一种新的全面拮抗 HGF 生物活性功能的拮抗剂-NK4 (Date K, Matsumoto k, ShimuraH, et al. HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions forhepatocyte growth factor 〔 J). FEBS Lett，1997,420 :1-6.)。NK4 作为肝细胞生长因子(h印atocyte growth factor, HGF)的拮抗剂，由HGF α -链的N末端发卡结构以及4个kringle结构组成，编码序列长度1434bp，相对分子量50kDa，它能显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖和转移、并可抑制血管新生(Date K, Matsumoto K, Shimura H, etal. HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growthfactor FEBS Lett，1997，420 1~6 ； Date K，Matsumoto K，Kuba K，et al. Inhibition ofturn or growth and invasion by a four-kringle antagonist(HGF/NK4) for hepatocytegrowth factor Oncogene，1998，17 : 3045-3054)，体外实验也证实NK4可抑制HGF诱导的肿瘤细胞的增殖、迀徙和侵袭(Okasora T，Jo J I，Tabata Y. Augmented anti-tumortherapy through natural targetability of macrophages genetically engineered byNK4 plasmid DNA. Gene Ther，2008，15(7)524-530)。因此NK4在肿瘤基因治疗中有潜在的应用前景。
白细胞介素-2(interleukin_2，IL-2)又称T细胞生长因子，自1976年被发现以来，许多学者对其进行了大量的研究，发现IL-2可通过提高自然杀伤细胞与LAK细胞活性，增强细胞毒性T细胞(cytotoxic tlymphocyte, CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用，并激活肿瘤侵润淋巴细胞从而诱导机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长停止或瘤体减小[孙燕，张弘纲，彭民等.重组白细胞介素-2治疗实体瘤及腹水III期临床研究〔J〕.中国新药杂志，1998，7 C3) 171.]；以IL-2为基础的生物治疗主要通过增强机体固有抗肿瘤机制达到抑制、杀灭肿瘤细胞及根治肿瘤的目的。目前随着分子生物学的发展，IL-2基因已经成为肿瘤基因治疗的热点，其在乳腺癌和黑色素瘤的I期临床实验中取得了明显的疗效(Stewart AK, Lassam NJ, Quirt IC, et al :A denovector-mediated genedelivery of interleukin—2 in metastatic breast cancer and melanoma :results ofa phase 1 clintcal trial (J) .Gene Ther，1999 ;6 (3) :350.)。以 IL-2 为基础的生物疗法也已广泛应用于治疗黑色素瘤[Arkins MB, Lotze MT，Duther JP，et al. High-dose recombinant interleukin2 therapy for patients with metastatic melanoma analysis of 270 patients treated betweer，1095 and 1993·JClinOncol，1999，17(7)； 2105-2116] ^ Sifl^ [Atial Μ, Blaise D, Marir G， etal. Consolidation treatment of adult avutilymphoblastic leukemia :a prospective, randomized trial comparing allogenic versus autologous bone marrowtransp1antation and testing the impact of tecombnant interleukin—2 afterautologous bone mattow transplantation. BGMTGroup. Blood, 1995,86(4) :1619-16 ]、肾癌、胃癌及结直肠癌、肝癌等。
肿瘤基因治疗的主要障碍是不能特异性将抗肿瘤基因传递到肿瘤组织内。减毒沙门氏菌具有直接抗瘤活性，并且具有靶向治疗载体的很多优点。Zheng等(Zheng LM, LuoX, Feng M，et al Tumor amplified protein expression therapy Salmonella as atumor-selective protein delivery vector (J. Oncol Res，2000，12(3) :127-135.)应用减毒沙门氏菌做了临床前实验，将菌株给多种荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人结肠癌、肺癌、乳腺癌、肺肉瘤)小鼠，发现细菌聚集在肿瘤部位(包括转移瘤)是其他正常部位的200-1000 倍。临床前研究发现减毒的沙门氏菌能抑制小鼠同系和异系的移植肿瘤生长。为此，本专利综合了目前国内外肿瘤疫苗设计的各自优势，将基因治疗、免疫治疗合起来，构建同时携带IL-2及NK4基因的真核共表达载体的减毒沙门氏菌口服疫苗，研究其靶向治疗实体瘤的效应。发明内容
本发明旨在发明同时携带人白细胞介素2及人肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因的真核共表达质粒载体的减毒沙门氏菌，以口服方式进行治疗，以达到预防和靶向治疗实体瘤的目的，特别是涉及同时携带人白细胞介素2及人肝细胞生长因子拮抗剂的重组减毒沙门氏菌疫苗株在预防和靶向治疗早、中、晚期结肠癌及肝癌疾病等严重危害人类健康的实体瘤的应用。
本发明的第一个目的是公开了一种治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗。
本发明的第二个目的在于公开了一种治疗实体瘤的基因药物组合物。
本发明的第三个目的在于公开了上述重组减毒沙门氏菌疫苗和药物组合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。
本发明的技术方案如下
一种治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其中，所述重组减毒沙门氏菌疫苗包含同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂NK4双基因的真核表达质粒。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的减毒沙门氏菌为临床已用疫苗减毒沙门氏菌菌株Ty21a或其他功能相似减毒沙门氏菌。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其中，所述真核表达质粒为同时包含白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因的真核表达质粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其中，所述重组减毒沙门氏菌疫苗为重组减毒沙门氏菌TPIN。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其中，所述白细胞介素2为人白细胞介素2，所述肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因为人肝细胞生长因子拮抗剂 NH4基因。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗在制备治疗实体瘤药物中的应用。
一种治疗实体瘤的基因药物组合物，所述药物组合物包括活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述活性成分为上述技术方案中所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的药物组合物，其中，所述药物组合物为口服胶囊。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的药物组合物，其中，所述实体瘤为肝癌、胃癌或结肠癌等。
上述技术方案中所述的治疗实体瘤的基因药物组合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。
本发明所涉及的携带人IL-2及NK4基因真核共表达质粒的减毒沙门氏菌疫苗株口服免疫后将对实体瘤的靶向治疗起到良好的治疗效果。相对于其它肿瘤生物治疗剂， 我们所发明的此疫苗株最主要的优势在于其一，选用IL-2基因与NK4基因联合抗肿瘤 IL-2基因可通过提高机体NK和LAK细胞的活性，增强CTL对肿瘤细胞的杀伤作用，并激活肿瘤浸润淋巴细胞从而诱导机体抗肿瘤免疫效应，使肿瘤生长停止或肿瘤消退；同时，NK4 基因可通过阻断人肝细胞生长因子O^patocyte growth factor, HGF)的促血管形成作用进而抑制癌细胞增值、扩散作用；IL-2与NK4基因同时作用，对肿瘤发生发展的复杂的不同阶段进行阻断，使其可以发挥最大的抗肿瘤效应。其二，我们所发明的此减毒沙门氏菌疫苗菌株可特异性的将抗肿瘤基因传递到肿瘤组织内，同时以沙门氏菌为载体构建的此疫苗可口股免疫，使得服药途径方便、安全，同时该疫苗也具有较高的安全性，不会对机体造成损害。
本发明人发现联合白细胞介素2和肝细胞因子拮抗剂NK4对于实体瘤具有甚为良好的预防和靶向治疗效果。具体地说，本发明发现同时携带人白细胞介素2及肝细胞因子拮抗剂NK4基因的重组质粒、重组减毒沙门氏菌的制剂可局部应用或口服全身免疫以转染 IL-2及NK4基因到肿瘤组织或细胞，得以产生IL-2及NK4，从而对于实体瘤可起到良好的免疫预防和靶向治疗效果。此外，本发明通过裸鼠接种结肠癌、肝癌肿瘤及其他肿瘤细胞的动物模型试验，应用同时携带人IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌直接灌胃的方法，发现此口服疫苗对于靶向治疗实体瘤有良好的实效。此外，本发明还发现，携带人IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌可有效提高裸鼠的免疫力，作用肿瘤组织可有效抑制肿瘤组织及癌旁组织中血管的生成；并且发现携带人IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌无诱发肿瘤风险。本发明基于以上发现而得以完成。
概括地说，本发明第一方面提供了同时携带人IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌在制备用于预防靶向治疗实体瘤的药物中的用途。具体而言，本发明提供的是以减毒沙门氏菌为载体携带IL-2及NK4基因在制备用于基因预防靶向治疗恶性肿瘤的药物中的用途。所述的恶性肿瘤是各种实体瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高、严重威胁人类健康的恶性肿瘤疾病。
在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的同时携带人IL-2及 NK4基因的减毒沙门氏菌是以携带IL-2及NK4基因的真核共表达重组质粒或重组减毒沙门氏菌的形式使用。换言之，本发明所述的携带人IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌是以同时携带IL-2及NK4基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的形式使用。
在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的携带人白细胞介素2 和肝细胞生长因子拮抗剂基因的减毒沙门氏菌是人白细胞介素2和人肝细胞生长因子拮抗剂。本发明所述的白细胞介素2当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的白细胞介素2 ； 肝细胞生长因子拮抗剂也可以使用鼠或者其它哺乳动物的肝细胞生长因子拮抗剂。但本发明优选的是使用人白细胞介素2和人肝细胞生长因子拮抗剂，包括人白细胞介素2及人肝细胞生长因子拮抗剂的所有分类，例如亚类、亚组、亚群、亚族等。
在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为 PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他携带IL-2及NK4基因的真核表达质粒。
在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的减毒沙门氏菌为临床已用疫苗菌株Ty21a或其他功能相似减毒沙门氏菌。
在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的实体瘤包括各种实体肿瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高、严重威胁人类健康的恶性肿瘤疾病。
本发明第二方面提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂的联合制剂和任选的药学可接受的载体。根据本发明，所述的药物组合物可用于预防和/或靶向治疗实体肿瘤。所述的实体肿瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高、 严重威胁人类健康的恶性肿瘤。
在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的白细胞介素2 和肝细胞生长因子拮抗剂是以携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中。
在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的白细胞介素2 和肝细胞生长因子拮抗剂是人白细胞介素2和人肝细胞生长因子拮抗剂。
在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他同时携带IL-2及NK4基因的真核表达质粒。
在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为临床已用疫苗菌株Ty2Ia或其他功能相似减毒沙门氏菌。
根据本发明第二方面的药物组合物，其可用于预防和/或靶向治疗实体肿瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高的恶性肿瘤。
在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的实体瘤特别是早中晚期结肠癌、肝癌等严重威胁人类健康、发病率高的恶性肿瘤。
根据本发明第二方面任一项所述药物组合物，其为口服胶囊等。
本发明第三方面提供了一种在需要的受试者中预防和/或靶向治疗实体肿瘤的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂的联合制剂。
在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂是以同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的形式使用。
在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂是人白细胞介素2和人肝细胞生长因子拮抗剂。本发明所述的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂。但本发明优选的是使用人白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂。
在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为 PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他同时携带IL-2及NK4基因的真核表达质粒。
在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为临床已用疫苗菌株Ty21a或其他功能相似减毒沙门氏菌。
在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的实体瘤包括各种实体肿瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高、严重威胁人类健康的恶性肿瘤。
在下文中，本发明还提供了白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因联合制剂的医疗用途。
本发明第四方面提供了白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂的联合制剂在制备用于预防和/或靶向治疗实体瘤药物中的用途。具体而言，本发明提供的是白细胞介素 2和肝细胞生长因子拮抗剂的联合制剂在制备用于基因预防和/或靶向治疗实体瘤药物中的用途。所述的实体瘤特别是结肠癌、肝癌等发病率高、严重威胁人类健康的恶性肿瘤。
下面对本发明作进一步详细的描述。
本领域技术人员公知，本发明使用的术语“预防”和“靶向治疗，，具有它们的一般意义上的含义。
本发明使用的术语“白细胞介素2”是指哺乳动物例如人的白细胞介素2。本发明优选的白细胞介素2是人白细胞介素2。本领域技术人员清楚，“人白细胞介素2”具有本领域公知的含义。
本发明使用的术语“肝细胞生长因子拮抗剂”是指哺乳动物例如人的肝细胞生长因子拮抗剂。本发明优选的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。本领域技术人员清楚， “人肝细胞生长因子”具有本领域公知的含义。
本发明使用的术语“TPIN”是指同时携带IL-2基因及NK4基因真核共表达质粒载体的减毒沙门氏菌疫苗株。本发明的TPIN具备肿瘤靶向性，转染白细胞介素2及NK4基因的效率比质粒要高，且只在局部分泌IL-2和NK4，无进入血流而引起或诱发肿瘤发展的危险和顾虑，因此具有实用的价值。另外，本发明认为联合IL-2及NK4基因的减毒沙门氏菌 TPIN同时具有调节免疫功能并抑制肿瘤组织血管生长的作用而具有对实体瘤的治疗效果， 为此，本发明进行裸鼠接种肿瘤细胞的动物试验，并应用TPIN直接灌胃的方法观察和鉴定疗效，取得实效。
在本发明中，所述的白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂是以同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的形式使用。插入的质粒为氨苄抗性的真核表达质粒，例如本发明人自行构建的PCMV-IL-2-IRES-NK4、重组减毒沙门氏菌例如本发明人构建的携带IL-2及NK4基因的真核共表达质粒的减毒沙门氏菌 Ty21a 的菌株 TPIN。
本发明提供了用于靶向治疗实体瘤的一种新颖方法，该方法包括将同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌，给予癌症患者从而治疗该疾病。实体瘤包括很多种，如肝癌、结肠癌等严重威胁人类健康的恶性实体肿瘤等。根据本发明的精神，还提供了治疗上述实体肿瘤的方法，该方法包括将携带白细胞介素 2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌，给予癌症患者从而治疗该疾病。
本发明的药物组合物中除了白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂外，根据需要还可含有本领域技术人员已知的制药中常用的药用辅助剂，例如赋形剂、稳定剂、防腐剂、 载体等。
本发明具有以下有益效果
应用本发明提供的治疗方法比其他的治疗手段更具有科学性，安全性、和肿瘤治疗的靶向性、疗效更明确。在目前尚无针对实体瘤较好临床治疗手段的情况下，本发明提供了一种新的有效治疗方法，本发明的治疗方法比以往的肿瘤防治手段更具有科学性，靶向性更好、安全性高、疗效更明确。
1、图1为IL-2基因的PCR扩增；
2、图2为NK4基因的PCR扩增；
3、图3为pCMV-IL-2酶切鉴定4、图4为pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒的酶切鉴定5、图5为重组减毒沙门氏菌TPIN的PCR筛选；
6、图6为肿瘤细胞接种2W后TPIN组和Ty21a组瘤体直径大小对比7、图7为PCR检测TPIN组及Ty21a组真核表达启动子CMV在组织中的分布8、图8为PCR检测TPIN组及Ty21a组真核表达启动子CMV在组织中的分布；
9、图9为PCR检测各组裸鼠组织基因中IL_2基因表达水平；
10、图10为PCR检测各组裸鼠组织基因中NK4基因表达水平。
具体实施例方式
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
下面通过具体实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。这些实施例描述同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的制备以及对裸鼠移植肿瘤细胞后的治疗作用以进一步阐述本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1
ω檇带白细胞,介素2及肝细胞,牛长因子桔杭剂NK4;S因的重_质粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4和重组减毒沙门氏菌TPIN的构津与制备
(A) IL-2 cDNA 的克降
按文献 艮道(Eizenberg, 0, et al. R Interleukin-2 transcripts in human and rodentbrains :possible expression by astrocytes. J. Neurochem. 1995,64(5) 1928-1936)的人白细胞介素2 (interleukin-2，IL-2) cDNA序列设计引物，在正向引物中引入BioI酶切位点，反向引物中引入MLu I酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为 5-gacctcgagatgtacaggatgcaactc -3, Jx. ( iJ 1^Μ^Μ^^, ψβ] % 5-cgaacgcgttcacagtgt tgagatgatgc-3，用常规分子生物学技术，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国) 中通过多聚酶链反应(PCR)中克隆人白细胞介素2(IL-2)基因。PCR参数为94°C预变性 5min，94°C 30s, 48°C 30s, 72°C lmin，循环数为 30，72°C延伸 lOmin。PCR 产物(如图 1所示，其中M :Maker2000 ；1 :PCR产物)用Sanger双脱氧终止法测定人IL_2cDNA序列(上海生工生物工程技术服务公司)。将测得的人IL-2 cDNA序列与文献报道的人IL-2 cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人IL-2 cDNA序列与文献报道的人IL-2 cDNA序列完全一致，IL-2 cDNA(444bp)序列为序列表中序列1所示。
(B) NK4 cDNA 的克隆
根据PUBMED上公布的肝细胞生长因子(h印atocyte growth factor, HGF))拮抗剂NK4 cDNA序列设计引物，在正向引物中引入Ml I酶切位点，反向引物中引入Not I酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5-CTG GTCGAC ATG TGG GTG ACC AAA CTC-3，反向引物的寡核苷酸序列为5-GCA GCGGCCGC TCAG ACT ATT GTA GGT GTG GT-3，从pcKH质粒中扩增得到NK4 cDNA序列，pcKH质粒为本实验室先前构建，其构建过程如下用常规分子生物学技术，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国)中通过多聚酶链反应(PCR)(上游弓丨物为 5，-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3，，下游弓丨物为 5，-tgggatccgcggccgc ctatgactgtggtacctt-3，)分离得到人HGF编码区cDNA Ql84bp)，测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列完全一致，然后将其亚克隆至我们自行改构的真核表达载体PcK的多克隆位点(BamH I, Apa I位点)， 获得携带人肝细胞生长因子基因的重组载体pcKH，人肝细胞生长因子基因受CMV启动子调控。PcK是将商业载体pcDNA3(购自^witrogen公司，美国)的氨卞抗性基因换为卡那霉素抗性基因而改构所得，将PCDNA3载体用kpl (购自！Iomega)及AvrII (购自Promega) 双酶切，切去氨苄基因(约0. 6kb)，pEGFP-Nl (购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4. 8kb)及小片段(1. Ikb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4 DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK ；分别用 BamHI (购自！Iomega)和ApaI (购自！Iomega)双酶切pcK及pSK-HGF，分别回收大片段及小片段(2. 2kb的DNA片段，该片段含有完整的人HGF基因)用T4 DNA连接酶连接，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcKH。以pcKH为扩增模板通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增得到NK4基因，PCR参数为94°C预变性 5min，94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，循环数为 30，72°C延伸 10min。PCR产物(如图2所示，其中M :Maker2000，1 :PCR产物)用Sanger双脱氧终止法测定人NK4 cDNA 序列(上海生工生物工程技术服务公司)。将测得的人NK4 cDNA序列与文献报道的人NK4 cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人NK4 cDNA序列与文献报道的人NK4 cDNA序列完全一致，NK4 cDNA序列(1434bp)为序列表中序列2所示。(C)檇带人白细胞,介素2某因的直核表汰裁体DCMV-IL-2的制各将pIRES-SEQ 载体(购自 hvitrogen 公司)用)(ho I (购自 TaKaRa)及 MLu I (购自TaKaRa)双酶切；同时用)(ho I (购自TaKaRa)及MLu I (购自TaKaRa)双酶切已纯化的白细胞介素2基因；酶切3小时后用凝胶电泳(凝胶回收试剂盒，购自!Iomega)分别回收线性化的PlRES质粒片段(约6. Ikb)及白细胞介素2基因片段G90bp)；回收的pIRES-SEQ 和IL-2以摩尔数比7 1混合，加入T4连接酶及连接8吐作1~，41连接1211，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含氨苄青霉素抗性基因，命名为pCMV-IL-2(如图3所示，其中 M :250bp DNA Ladder ；1 :pIRES_SEQ Xhol 单酶切；2 :pCMV-IL_2 Xhol 单酶切；3 pCMV-IL-2 质粒 Xhol、Mlul 双酶切)。用本领域的常规技术方法，将pCMV-IL-2质粒转化常规的感受态细菌(例如大肠杆菌DH5 α )，然后大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒， 柱层析法大规模纯化质粒(采用无内毒素质粒大提试剂盒，TIANGEN)，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。(D) mm^mm^m 2基因及肝细朐,牛长因子拮抗剂nm基因的真核共表达裁体 PCMV-IL-2-IRES-NK4 的制备将步骤(C)中构建的pCMV-IL-2载体用Ml I (购自TaKaRa)及Not I (购自 TaKaRa)双酶切；同时用Ml I (购自TaKafci)及Not I (购自TaKafci)双酶切已纯化的肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因；酶切3小时后用凝胶电泳(凝胶回收试剂盒，购自 Promega)分别回收线性化的pCMV_IL_2质粒片段(约6. 6kb)及肝细胞生长因子拮抗剂NK4 基因片段(1471bp)；回收的pCMV-IL-2和NK4以摩尔数比5 10 1混合，加入T4连接酶及连接BUffer，4°C连接12h，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含氨苄青霉素抗性基因，命名为pCMV-IL-2-IRES-NK4(酶切鉴定如图4，其中M:250bp DNA Ladder ；1 :pCMV-IL-2 Sail 单酶切；2 :pCMV-IL-2-IRES_NK4 Sail 单酶切；3 :pCMV-IL-2-IRES_NK4 质粒Mil、Notl双酶切)。用本领域的常规技术方法，将质粒pCMV-IL-2-IRES-NK4转化常规的感受态细菌 (例如大肠杆菌DH5 α )，然后大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒，柱层析法大规模纯化质粒(采用无内毒素质粒大提试剂盒，TIANGEN)，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。(E)重组减毒沙门氏菌TPIN的制备i、电穿孔转化将减毒沙门氏菌Ty21a冻存菌液50 μ L接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约0. 4)，4°C条件下，4000r. mirT1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于Iml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法 (Multiporator 4308 Eppendorf 电转仪)将 pCMV_IL-2-IRES_NK4 质粒 0. 2 μ g 转化 200 μ L 预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件电压2. 5kV，电容25 μ F，电阻200 Ω，放电时间0. k。 加入SOC培养基lml，37°C轻柔震荡培养45min，涂布于含氨苄青霉素(IOOmg.!/1)固体LB 培养基平皿，37°C培养1 后各挑取2个菌落进行鉴定。ii、阳件工稈菌的筛诛从培养板挑取2个单菌落，分别接种于3mL含卡那霉素的LB培养液中，37°C震摇培养。转入PCMV-IL-2-IRES-NK4的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过氨苄青霉素抗性、 PCR(PCR 筛选如图 5 所示，其中 M :250bp DNA Ladder ； 1 =TPIN PCR 鉴定 IL-2 基因；2 TPINPCR鉴定NK4基因)(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因IL_2、NK4) 及提取质粒后)(hoL、Mlul双酶切，Sall、Notl双酶切鉴定。扩增真核表达启动子CMV的引物为5'-CCC agt aca tga cct tat ggg-3‘, 5‘-gga gac ttg gaa atcccc gt_3，， PCR 参数为94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，循环数为 30，72°C延伸 5min。扩增 IL-2 1 弓 1. Jlilf 5' -gacctcgagatgtacaggatgcaactc-3', 5' -cgaacgcgttcacagtgttga gatgatgc-3，，PCR 参数为94°C 预变性 5min，94°C 30sec,48°C 30sec,72°C 60sec，循环数为 30，72°C 终延伸 IOmin。扩增 NK4 的引物为上游 5，-CTG GTCGAC ATG TGG GTG ACC AAA CTC-3，，下游 5，-GCA GCGGCCGC TCAGACT ATT GTA GGT GTG GT-3，，PCR 参数为94°C预变性 5min，94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 2min，循环数为 30，72°C延伸 lOmin。iii、工程菌TPIN的制备将携带IL-2及NK4基因的真核共表达载体的减毒沙门氏菌菌种(TPIN)接种于含氨苄青霉素(50yg/mL)的LB培养基中，35 37°C 8% CO2培养箱中培养24h做为一代菌种，将一代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养做为二代菌种，并在无菌条件下取一代菌种和二代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将二代克氏瓶菌种刮于IOOmL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为1. 7 X 101°个/ mL，30L发酵罐发酵1 后3000r/min离心20min，收集菌体73g，加入70mL脱脂牛奶充分混勻，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约23g。以下通过TPIN的药效学实验来说明本发明所具有的有益效果试验例1 :IL-2及NK4重组真核共表达质粒pCMV-IL-2-IRES_NK4及重组减毒沙门氏菌TPIN在肝癌靶向治疗中的效果观察
( 一 ) TPIN对棵鼠肝癌预防效果观察(1)实验动物及樽型甘肃省中医学院实验动物中心提供的裸小鼠30只，雄性，体重60 80克。实验前一周购入，自由饮水与摄食。HEPG2在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养。培养条件为37°C 5% CO20待小鼠口服免疫6周，空白对照组(Blank)、TPIN组、Ty21a组各取裸小鼠10只，每只于右腹部皮下接种5 X IO5个HEP&细胞。(2) TPIN 的应用将模型裸鼠随机分为三组分别是空白对照组(Blank)、TPIN组、Ty21a组。将 TPIN、Ty21a分别接种于2mL含2uLAmp和无抗生素的LB培养液中，振荡过夜，次日取50uL 加入50mL含相应抗生素的LB培养液中，池后收集菌体，PBS清洗后，用10% NaHCO3悬浮， 调整细菌数为lX109/mL。各实验组小鼠用胃管饲服相应细菌0. lmL，Blank组服等量10% NaHCO3溶液。2周1次，共三次。(3)淋巴细胞亚群分析口服免疫6周后作外周血⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+T淋巴细胞亚群分析。与Ty21a组、 空白对照组比较，TPIN免疫组外周血中⑶4+、⑶4+/⑶8+比值有显著差别(P < 0. 01)。与 Ty21a组、空白对照组比较TPIN免疫组⑶4+、⑶4+/⑶8+比值也有明显增高(P < 0. 05)。 Ty21a免疫组与空白对照组比较⑶4+/⑶8+比值有所提高(P < 0. 05)。结果见表1。表1 口服免疫后对小鼠外周血⑶4' T、⑶8' T、⑶4' /⑶8 ‘比值的影响 G 土 s, %)
权利要求
1.一种治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其特征在于所述重组减毒沙门氏菌疫苗包含同时携带白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂NK4双基因的真核表达质粒。
2.根据权利要求1所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其特征在于所述减毒沙门氏菌为减毒沙门氏菌Ty21a或其他功能相似减毒沙门氏菌。
3.根据权利要求1所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其特征在于所述真核表达质粒为同时包含白细胞介素2和肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因的真核表达质粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4。
4.根据权利要求1所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其特征在于所述重组减毒沙门氏菌疫苗为重组减毒沙门氏菌TPIN。
5.根据权利要求1 4所述的防治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗，其特征在于 白细胞介素2为人白细胞介素2，肝细胞生长因子拮抗剂NK4基因为人肝细胞生长因子拮抗剂NH4基因。
6.权利要求1 5中任一权利要求所述的治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗在制备治疗实体瘤药物中的应用。
7.一种治疗实体瘤的药物组合物，所述药物组合物包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于所述活性成分为权利要求1 5中任一权利要求所述的重组减毒沙门氏菌疫苗。
8.根据权利要求7所述的治疗实体瘤的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为口服胶囊。
9.根据权利要求7或8所述的治疗实体瘤的药物组合物，其特征在于所述实体瘤为肝癌、胃癌或结肠癌等。
10.权利要求7 9中任一权利要求所述的治疗实体瘤的药物组合物在制备治疗实体瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明名称为“一种治疗实体瘤的重组减毒沙门氏菌疫苗、药物组合物及其应用”。本发明涉及细胞因子预防和靶向治疗实体肿瘤的应用，白细胞介素2联合肝细胞生长因子拮抗剂基因在制备用于预防和靶向治疗实体瘤的药物中的用途。本发明还涉及包含所述白细胞介素2联合肝细胞生长因子拮抗剂的基因药物组合物，以及使用所述白细胞介素2联合肝细胞生长因子拮抗剂在需要的受试者中预防和靶向治疗实体瘤的方法。根据本发明可以有益地预防和靶向治疗各种实体肿瘤。
文档编号A61P35/00GK102526760SQ20111046220
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者哈小琴, 尹强, 张俊, 张尚弟, 张红宾, 惠玲, 昌业伟, 王晓辉, 王美亮, 贾庆华 申请人:中国人民解放军兰州军区兰州总医院