专利名称：含乳酸菌制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型乳酸菌以及以该乳酸菌菌体或其处理物为有效成分的制剂。
背景技术：
近年来，由于饮食生活的欧美化、居住环境、运动不足、过度压力等生活环境的变化，过敏性疾病和生活习惯病等的患者数、预备军均有年年增加的倾向，目前也被称为国民病。过敏性疾病中，特别是花粉症和特异反应性皮炎疾病一直在增加，强烈需要其的预防和改善对策。花粉症和特异反应性皮炎等被分类为I型的过敏性疾病是从将侵入到生物体内 的物质识别为变应原并诱导IgE抗体产生而开始的。当变应原再次侵入时，与肥大细胞和粒细胞上的受体分子相结合的IgE抗体与变应原结合，结果，由肥大细胞和粒细胞释放出过量的组胺和白细胞三烯等化学介质，表现出哮喘、皮炎、鼻涕等过敏症状。对于这种过敏性疾病的治疗，以往是以对症疗法进行抗组胺剂和类固醇剂等的投予。但是，这些药剂具有副作用，现实情况是在使用方法和长期使用中安全性存在问题。另外，被称为生活习惯病的疾病之一有高脂血症，由于偏食生活、运动不足、饮酒或抽烟等不良生活习惯的积累等，中性脂肪值超过标准值的状态成为一个指标。作为降低中性脂肪值的方法，饮食疗法及运动疗法是有效的手段，但很难有耐心地持续这种疗法，需要在没有心理上、肉体上的痛苦伴随的情况下降低中性脂肪的方法。另一方面，在使用了乳酸菌的发酵食品中具有显示整肠(肠调节)作用和免疫激活效果、生活习惯病预防效果等健康效果的物质，备受关注。例如有报告指出，就酸奶而言，发酵中所使用的乳酸菌体或发酵乳中的乳肽显示上述健康功能。目前，乳酸菌的抗过敏功能(专利文献1、2)、中性脂肪减少功能(专利文献3、4)等备受关注。其中，有报告指出专利文献2所记载的副干酪乳杆菌KW3110株(FERM BP-08634)的抗过敏功能特别高，但对于属于片球菌属的乳酸菌，并未报告其具有抗过敏作用。另外，专利文献4中报告了属于片球菌属的乳酸菌具有中性脂肪减少效果，但其效果还不能说很充分。另外，已知通过将具有以整肠作用为代表的功能性的乳酸菌制剂制成鸡尾酒类混合制剂进行摄取，会发挥各种健康功能，但几乎没有发挥多种功能性的乳酸菌制剂。现有技术文献专利文献I :日本特开平9-2959号公报专利文献2 :日本专利第3585487号公报专利文献3 :日本特开平10-298083号公报专利文献4 :日本特公平6-57657号公报
发明内容
发明要解决的课题本发明的课题在于提供具有抗过敏功能、血中中性脂肪的减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能、且安全性高的乳酸菌。进而，本发明的课题在于提供含有具有抗过敏功能、中性脂肪减少功能、抗自身免疫性疾病功能等中至少I种功能的乳酸菌和该乳酸菌来源成分的制剂。用于解决课题的手段本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现属于片球菌属的特定的乳酸菌和该乳酸菌来源成分具有优异的抗过敏功能、中性脂肪减少功能以及抗自身免疫性疾病功能中的至少I种功能，尤其是兼具抗过敏功能和中性脂肪减少功能，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) R037株(保藏号NITEBP-900)或具有抗过敏功能、中性脂肪减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能的所述R037 株的突变体。另外，本发明为含有对上述乳酸菌进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物的组合物。该组合物可以以过敏的预防和改善、血中中性脂肪值的减少和/或自身免疫性疾病的预防和改善为目的而制成药品、健康食品、补充剂来利用。另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的抗过敏剂。另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的血中中性脂肪减少剂。另外，本发明为含有上述组合物、优选含有上述组合物作为有效成分的抗自身免疫性疾病剂。另外，本发明为含有上述组合物的饮食品。另外，本发明还为过敏性疾病、高甘油三酯血症和/或自身免疫性疾病的处置方法，其特征在于，将上述组合物投予至投予对象。发明效果根据本发明，可以提供含有安全性高的乳酸菌菌体或其处理物的组合物。根据本发明的组合物，能够提供可作为目前成为国民病的过敏的预防和改善剂、中性脂肪减少剂和/或自身免疫性疾病的预防和改善剂使用的组合物。
图I为表示根据本发明的乳酸菌的投予的有无所导致的特异反应性皮炎模型小鼠的皮炎总得分的变化的图。图2为表示根据本发明的乳酸菌的投予的有无所导致的特异反应性皮炎模型小鼠的耳廓厚度的变化的图。
具体实施例方式以下对本发明详细地进行说明。本发明的乳酸菌即乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) R037株(以下也称作“R037株”)是从发酵乳中分离出的新型乳酸菌，其以保藏号NITEBP-900保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(日本国千葉県木更津市 鎌足2-5-8)。R037株具有下述菌学上的性质，确认了其为属于乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的菌株。A形态学性状I.细胞形态球菌
2.革兰氏染色性阳性3.胞子的有无无4.运动性无B培养基上的生长状态MRS琼脂培养基上的群落形态透镜状的白色球状C生理学性质1.37°C下的生长能力阳性2.45°C下的生长能力阳性3.过氧化氢酶反应阳性4.各种碳水化合物(糖类)的分解性(阳性+、阴性_)阿拉伯糖_半乳糖+乳糖-麦芽糖-松三糖-核糖+木糖+D化学分类学特性由16S rDNA的全碱基序列解析的结果可知，以99. 7%的同源性与乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) UL5 株一致。如后述的实施例所示，R037株不仅具有优异的抗过敏/抗特异反应性皮炎功能，而且还具有优异的中性脂肪减少功能。本发明中，不仅是上述R037株，它们的突变体只要具有同等的功能，则也属于本发明的技术范围，可以代替上述R037株含有在本发明的组合物中。作为这种突变体并无特别限定，可举出由自然突变所产生的突变体、通过放射线或突变诱导物质等公知的方法人为地诱导突变所获得的突变体等。在上述R037株或者它们的突变体的培养中，只要是它们能够生长的培养基，则可以使用任何的培养基，对于培养方法，可以通过试管培养、烧瓶培养、利用发酵槽的培养等进行培养，并无特别限定，例如使用在乳酸菌培养中通常使用的MRS培养基、在一般的条件下进行通常的乳酸菌培养即可。本发明的组合物是含有对从发酵乳中分离出的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)R037株进行培养而得到的菌体或其处理物的组合物。作为组合物中含有的菌体，可以是活菌也可以是死菌(灭活菌)。这里，活菌是指活着的乳酸菌，死菌(灭活菌)是指通过加热、加压、药物处理等实施了灭菌处理的菌体。进而,本发明中，只要具有同等的功能,贝U不仅是全菌体(whole cell)、菌体的处理物也可含有在本发明的组合物中。这里所说的菌体的处理物除了这些乳酸菌的通过磨碎或粉碎、抽提等获得的液状化物、实施了选自浓缩、糊化、干燥(喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、滚筒干燥等)、稀释中的至少I个处理的处理物之外，还指乳酸菌的抽提残渣。含有本发明的R037株、其突变体或者这些乳酸菌来源的成分的本发明组合物由于具有优异的抗过敏功能，因而可作为抗过敏剂使用。本发明的抗过敏剂具有在倾向于Th2型的免疫系统中将对抗原刺激的免疫应答转变成Thl型免疫应答的作用，还可以抑制IgE抗体的产生量。因此，具有预防或改善花粉症、特异反应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等过敏性疾病的功能。本发明中，抗过敏功能例如可以如后述的实施例那样来评价将免疫了卵清蛋白(OVA)的BALB/c小鼠的脾细胞在添加有OVA及待测物质的培养基中进行培养，测定培养上 清中的细胞因子(IL-12、IL-4)，由此进行评价。即，与在未添加有待测物质的培养基中培养的脾细胞所产生的细胞因子IL-12、IL-4产生量相比，通过添加待测物质，如果诱导了脾细胞的IL-12的产生且抑制了 IL-4的产生，则评价待测物质具有抗过敏功能。抗过敏功能还可通过对经口投予了待测物质的小鼠免疫OVA并测定该小鼠的血中总IgE量来进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比血中总IgE量有所减少时，则评价待测物质具有抗过敏功能。抗特异反应性皮炎功能可以如后述的实施例那样来评价向特异反应性皮炎模型小鼠(Nc/Nga系SPF小鼠)投予待测物质并利用苦基氯致敏和诱导特异反应性皮炎，由此进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比皮炎得分有所减少时，则评价待测物质具有抗特异反应性皮炎功能。含有R037株、其突变体或这些乳酸菌来源成分的组合物由于具有优异的中性脂肪减少功能，因而还可作为中性脂肪减少剂使用。本发明的中性脂肪减少剂具有减少血液中的中性脂肪量、控制血清中的中性脂肪浓度、预防或改善脂质代谢和高甘油三酯血症的效果。中性脂肪减少功能可以例如如后述的实施例那样通过测定2型糖尿病模型小鼠(KK-Ay小鼠)的血清中中性脂肪量来进行评价。即，当与未投予待测物质的小鼠相比血清中的中性脂肪量降低时，则评价待测物质具有中性脂肪减少功能。含有R037株、其突变体或这些乳酸菌来源成分的组合物由于具有优异的抗自身免疫性疾病功能，因而还可作为自身免疫性疾病的预防和改善剂使用。本发明的自身免疫性疾病是指类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、克罗恩病等自身免疫性疾病。本发明的组合物可作为食品、功能性食品或补充剂、饲料(包括宠物食品)、动物用药品或药品使用。本发明的组合物在作为食品日常摄取时，含有本发明的组合物的食品的形态并无特别限定，例如可举出食用油脂组合物、烹饪油类、喷淋油类、黄油类、人造黄油类、起酥油类、鲜奶油类、炼乳类、增白剂类、调味品类、腌制液类、面包类、蛋糕类、馅饼类、饼干类、日本点心类、小吃点心类、油炸点心类、巧克力及巧克力点心类、米果类、乳酪面粉糊类、调味汁类、佐料汁类、顶层配料类、冰冻点心类、面类、糕点混合料类、油炸食品类、加工肉产品类、豆腐魔芋等其它加工品、水产酱产品类、冷冻主菜类、畜产冷冻食品、农产冷冻食品等冷冻食品类、米饭类、果酱类、奶酪、干酪食品、类奶酪食品、口香糖类、糖果类、发酵乳类、罐头类、饮料类等一般食品形态。将本发明的组合物制成食品时的乳酸菌或乳酸菌来源成分的含量并无特别限定，例如在食品中可以按照达到O. 00001 100重量％、优选达到O. 001 50重量％、更优选达到O. I 30重量％的比例的方式来含有。将本发明的组合物作为功能性食品或补充剂、饲料或动物用药品使用时，其剂型并无特别限定，例如可举出胶囊剂、糖浆剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、饮剂、注射剂、输液、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、贴剂、喷雾剂等。在制剂化中，可以适当添加药剂学上可允许的其它制剂、例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧化剂、着色剂、抗凝集剂、吸收促进剂、溶解辅助剂、稳定化剂等进行制备。而且，该制剂还可混合在配合饲料或混合饲料中，也可悬浮在饮用水中施予。或者还可将本发明的组合物直接混入饲料中。
这些情况下，本发明的组合物以乳酸菌或乳酸菌来源成分计，与动物种类无关地按照每日可摄取优选O. 01 1000mg/kg体重、更优选O. I 500mg/kg体重的方式施予I次或分多次施予。使用本发明的组合物作为药品时，其剂型并无特别限定，例如可举出胶囊剂、糖浆齐 、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、饮剂、注射剂、输液、滴鼻剂、滴眼剂、栓剂、贴剂、喷雾剂等。在制剂化中，可以适当添加药剂学上可允许的其它制剂、例如赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合齐 、抗氧化剂、着色剂、抗凝集剂、吸收促进剂、溶解辅助剂、稳定化剂等进行制备。还可以以胶囊剂或片剂等补充剂形态制成特定保健用食品、营养功能食品等保健功能食品或健康食品、营养辅助食品等功能性食品，还可注明用于过敏症状的预防改善和/或中性脂肪减少。此时，作为本发明组合物的投予量，以乳酸菌或乳酸菌来源成分计，按照每个成人每日可摄取优选O. I 1000mg/kg体重、更优选10 300mg/kg体重的方式投予I次或分多次投予。本发明的组合物通过投予至投予对象，可以预防和改善过敏或特异反应性皮炎等过敏性疾病。此时,作为投予对象并无特别限定,可举出过敏性疾病患者、特异反应性皮炎患者等表现出过敏症状者；虽然目前未表现出过敏症状、但通过抗体检查等被指出有其潜在风险者；以及想对过敏或特异反应性皮炎等的发病防患于未然的健康者或健康动物。另外，本发明的组合物通过投予至投予对象，可以减少血液中的中性脂肪。此时，作为投予对象并无特别限定，可举出高甘油三酯血症患者；在血液检查等中中性脂肪值高而成为高甘油三酯血症预备群者；以及积累了不良生活习惯而需要注意中性脂肪值的健康者或健康动物。另外，本发明的组合物通过投予至投予对象，可以预防和改善自身免疫性疾病。作为自身免疫性疾病的预防和改善目的中的投予对象，可举出患有作为自身免疫性疾病的例子在前述示例过的疾病的对象；目前虽然未表现出症状、但通过抗体检查等被指出有其潜在风险者；或者想对这些疾病的发病防患于未然的健康者或健康动物。实施例以下示出实施例更为具体地说明本发明，但本发明并非限定于这些实施例。另外，实施例中利用以下所示的方法来评价抗过敏功能、抗特异反应性皮炎功能、中性脂肪减少功能。<抗过敏功能的评价>将以OVA为抗原进行了免疫的过敏模型小鼠(雄性BALB/c小鼠)的脾细胞与OVA和待测物质进行共培养时，对能否抑制IL-4的产生且促进IL-12的产生进行评价。另外，对经口投予了待测物质的小鼠(雄性BALB/c小鼠)经时地免疫0VA，测定血清中IgE，评价相对于未投予待测物质的小鼠的血清中IgE量经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的血清中IgE量的增加是否被抑制。<抗特异反应性皮炎功能的评价>对经口投予了待测物质的特异反应性皮炎模型小鼠(雄性Nc/Nga系SPF小鼠)，将苦基氯涂布在背部和足垫上致敏，通过涂布在背部和左右耳廓，对小鼠诱发特异反应性皮炎，研究皮炎得分及耳廓厚度。评价相对于未投予待测物质的小鼠的皮炎得分及耳廓厚 度经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的皮炎得分及耳廓厚度的经时性增加是否被抑制。<中性脂肪减少功能的评价>测定经口投予了待测物质的2型糖尿病模型小鼠(雄性KK-Ay小鼠)的血清中中性脂肪量，评价相对于未投予待测物质的小鼠的血清中中性脂肪量经时地增加、经口投予了待测物质的小鼠的血清中中性脂肪量的增加是否被抑制。(制造例I 4)各乳酸菌的制备将表I记载的乳酸菌分别在MRS培养基(将MRS bouillon (关东化学株式会社制)52g溶解在IL水中并进行121°C、15分钟的高压灭菌所得的的培养基)中培养48小时，培养结束后，通过离心分离将菌体回收，用灭菌水洗涤3次后，分散于20ml的灭菌水中，在80°C下加热10分钟后进行冷冻干燥，获得各乳酸菌的冷冻干燥菌体I 4。表I
所添加的乳酸菌株
制造例I (冷冻干燥菌体I)乳酸片球菌R037 (保藏号ΝΓΓΕ BP-900)
制造例2 (冷冻干燥菌体2)德氏乳杆菌乳酸亚种KR-188 (保藏号ΝΓΓΕ P-396)
制造例3 (冷冻干燥菌体3)耐久肠球菌KR-211 (保藏号ΝΓΓΕ P-397)
制造例4 (冷冻干燥菌体4)肠膜明串珠菌肠膜亚种KLAB-2(保藏号NITE P-393)(实施例I)利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能本实验中，将5周龄的雌性BALB/c小鼠(Charles River株式会社制)驯化饲养I周后使用。对BALB/c小鼠腹腔内免疫将100 μ g的OVA和2mg的氢氧化铝凝胶混合并用生理盐水调整为200 μ I的抗原液(一次免疫)，一周后进一步腹腔内免疫等量的抗原液(二次免疫)。距离二次免疫I周后，利用ELISA法测定OVA特异性IgE抗体效价，将确认到抗体效价上升的小鼠作为过敏模型小鼠。由过敏模型小鼠制备脾细胞后，按照达到2. OX 106cells/ml的方式悬浮在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(商品名RPMI1640、Sigma公司制)中，作为抗原刺激，将OVA(lmg/ml)和制造例I中制备的乳酸菌干燥菌体I (I μ g/ml)添加至培养基中。在37°C、5%C02孵育箱中培养脾细胞7天，利用ELISA法(产品名Quantikine、R & D Systems公司制)测定培养后上清中所含的IL-4及IL-12，将该测定值作为评价值。它们的结果汇总于表2。(参考例I 3)利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能作为参考例，使用乳酸菌干燥菌体2 4，除此之外与实施例I同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。(比较例I)利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能作为阴性对照，不添加乳酸菌液而使用PBS (_)，除此之外与实施例I同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。
(参考例4)利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能作为阳性对照，不添加乳酸菌液而使用具有Thl活化能力的免疫激活剂Picibanil (中外制药株式会社制)I μ g/ml,除此之外与实施例I同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。(参考例5)利用体外试验测定乳酸菌的抗过敏功能为了与日本专利第3585487号进行比较，作为使用了乳酸菌的阳性对照，代替制造例I 4中使用的乳酸菌而使用具有抗过敏活性的乳酸菌干酪乳杆菌L14株(乳业技术协会，与副干酪乳杆菌KW3110、FERM BP-08634相同)，与制造例I 4同样地制备乳酸菌的干燥菌体，并与实施例I同样地进行抗过敏功能的测定。结果汇总于表2。表 2(单位pg/ml)
权利要求
1.一种乳酸菌，其特征在于，其是保藏号为NITE BP-900的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)R037株、或者是具有抗过敏功能、中性脂肪减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能的所述R037株的突变体。
2.一种组合物，其含有对权利要求I所述的乳酸菌进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物。
3.一种抗过敏剂，其含有权利要求2所述的组合物。
4.一种中性脂肪减少剂，其含有权利要求2所述的组合物。
5.一种抗自身免疫性疾病制剂，其含有权利要求2所述的组合物。
6.根据权利要求3飞任一项所述的剂，其为药品或动物用药品。
7.一种饮食品，其含有权利要求2所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的饮食品，其具有抗过敏功能、血中中性脂肪的减少功能和/或抗自身免疫性疾病功能。
9.根据权利要求7或8所述的饮食品，其为功能性食品或补充剂。
10.一种过敏疾病、高甘油三酯血症和/或自身免疫性疾病的处置方法，其特征在于，将权利要求2所述的组合物投予至投予对象。
全文摘要
本发明提供对过敏的预防治疗和/或血中中性脂肪的减少有效且安全性高的乳酸菌及乳酸菌制剂。将含有对乳酸菌乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)R037株进行培养而获得的乳酸菌菌体或其处理物的组合物作为有效成分添加在药品、饮食品中。
文档编号A61P3/06GK102791849SQ20118001308
公开日2012年11月21日 申请日期2011年3月9日 优先权日2010年3月10日
发明者渡边丰辉, 滨田和也, 立垣爱郎 申请人:株式会社钟化