经修饰的结核抗原的制作方法

专利名称：经修饰的结核抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的结核分枝杆菌(Mycobacterium / 6 /γ 7θ5·Υ5·)Κν3616(3蛋白质，相关多核苷酸以及此类蛋白质和多核苷酸在治疗或预防结核中的用途，特别是在预防或治疗潜伏性结核病中和在预防或延迟结核再活动中的用途。
背景技术：
结核(TB)是通过由结核分枝杆菌及其他分枝杆菌属(Mycobacterium")物种感染引起的慢性传染病。它是发展中国家中的主要疾病，以及全世界的发达地区中的渐增问题。超过20亿人被认为感染TB杆菌，其中每年约920万TB新病例和170万死亡。由TB杆菌感 染的那些中的10%将发展活动性TB，具有活动性TB的每个人每年平均感染10 - 15个其他人。虽然每年发生率在全球已达到峰值，但由于人口增长死亡和病例数目仍是上升的(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008)。结核分枝杆菌通过呼吸途径感染个体。肺泡巨噬细胞吞食该细菌，但它能够通过抑制与酸性溶酶体的吞噬体融合而存活且增殖。涉及CD4+和CD8+ T细胞的复杂免疫应答跟着发生，最终导致肉芽肿的形成。对于结核分枝杆菌作为病原体的成功关键的是下述事实分离但未根除的细菌可以持续长时期，使得个体易受活动性TB的后期发展影响。少于5%的受感染个体在感染后第一年内发展活动性TB。肉芽肿可以持续数十年，并且被认为含有处于休眠状态、剥夺氧和营养素的活结核分枝杆菌。然而，近来，已提出处于休眠状态的大多数细菌位于传播遍及体内的非巨噬细胞细胞类型中(Locht等人，Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7 (11) : 1665-1677)。当宿主的天然免疫和病原体之间的平衡改变时，例如由于免疫抑制事件，活动性TB的发展发生(Anderson P Trends inMicrobiology 2007 15 (I) :7-13 ；Ehlers S Infection 2009 37 (2) :87-95)。描述在潜伏性TB和活动性TB之间的平衡的动态假设也已得到提议(Cardana P-JInflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39 ；Cardana P-J Infection 200937 (2) :80-86)o尽管感染可以对于相当大的时间段是无症状的，但活动性疾病最通常表现为肺的急性炎症，导致疲劳、重量减轻、发热和持续性咳嗽。如果未治疗，那么一般导致严重并发症和死亡。结核一般可以使用延长的抗生素治疗得到控制，尽管此类治疗不足以预防疾病的传播。活动性受感染个体可以主要是无症状的，但一段时间是接触传染的。此外，尽管顺应治疗方案是关键的，但患者行为难以监控。某些患者不完成疗程，这可以导致无效治疗和药物抗性的发展。多药抗性TB (MDR-TB)是未能响应第一线用药的形式。所有TB病例的5%是MDR-TB，其中估计490，000个新MDR-TB病例每年发生。当对于第二线用药的抗性在MDR-TB之上发展时，广泛药物抗性TB (XDR-TB)发生。估计每年出现事实上无法治疗的XDR-TB的40，000 个新病例(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008)。即使抗生素治疗的全过程完成，由结核分枝杆菌的感染也可能未从受感染个体中根除，并且可以作为可以再活动的潜伏性感染保留。为了控制结核的传播，有效疫苗接种计划和疾病的精确早期诊断具有最大限度的
重要性。目前，用活细菌的疫苗接种是用于诱导保护性免疫的最广泛使用的方法。用于这个目的的最常见的分枝杆菌属是卡介苗{Bacillus Calme11e-Guerin) (BCG),牛分枝杆菌(M.的无毒株,其超过60年前首次开发。然而,BCG的安全和功效是争论的来源-虽然在儿童中保护免于表现严重疾病，但BCG在成人生命中不预防潜伏性TB的建立或肺疾病的再活动。另外，某些国家例如美国未用这种试剂给普通民众接种疫苗。目前在临床开发中的几乎所有新生成的TB疫苗已设计为预暴露的疫苗。这些包括亚单位疫苗，其在加强通过先前BCG疫苗接种诱导的免疫中是特别有效的，和晚期活分枝杆菌疫苗，其旨在用更有效和/或更安全的菌株替换BCG。尽管这些疫苗旨在改善对感染的抗性，但它们作为在潜伏性TB病例中的暴露后或治疗疫苗可能是更不有效的(Lin MY等 A Endocrine, Metabolic & Tmmune Disorders - Drug Targets 2008 8:15-29)。US20080269151的实施例2公开了特定经修饰的Rv3616c蛋白质的克隆、构建和表达,包括ΔΤΜ-1，其中残基150 - 160已缺失的Rv3616c多肽(US20080269151的SEQ IDNo: 22) ; ΛΤΜ-2，其中残基 101 - 203 已缺失的 Rv3616c 多肽(US20080269151 的 SEQ IDNo: 24);和其中Rv3616c的残基150 - 160已替换为抗原TbH9的序列(US20080269151的 SEQ ID No: 60)。发明概述
本发明一般涉及经修饰的Rv3616c多肽或编码其的多核苷酸在潜伏性分枝杆菌感染领域中的用途。另外，本发明涉及特定经修饰的Rv3616c蛋白质。本发明人已惊讶地发现破坏Rv3616c序列的特定区域的疏水性可以导致改善的表达,而无对免疫原性性质的有害影响。经修饰的Rv3616c蛋白质具有作为TB抗原的用途，特别是作为潜在TB抗原的用途。在其最广泛的方面，本发明提供了其中对应于H37Rv序列的残基134-183的氨基酸残基的疏水性已被破坏的经修饰的Rv3616c蛋白质,适当地其中对应于H37Rv序列的残基135-154的氨基酸残基的疏水性已被破坏的经修饰的Rv3616c蛋白质。在本发明的一个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述经修饰的Rv3616c蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。在本发明的第二个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述经修饰的Rv3616c蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。在本发明的第三个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，或可替代地基本上由Rv3616c序列组成或由Rv3616c序列组成,其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已从对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域中缺失。本发明的第四个方面提供了经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。本发明的第五个方面提供了包含第一种多肽和第二种多肽的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。本发明的第六个方面提供了经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第
三种多肽与这样的序列具有至少90%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
134-183，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。本发明的第七个方面提供了包含第一种多肽和第二种多肽的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-134具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基155-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第
三种多肽与这样的序列具有至少80%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
135-154，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。在本发明的第八个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域的至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已由亲水残基置换。经修饰的Rv3616c蛋白质可以基于来自结核分枝杆菌的任何菌株的野生型Rv3616c蛋白质序列。例如，SEQ ID Nos: 3_7中的任何一个，特别是SEQ ID Nos: 3-6中的任何一个，可以取代在前述实施方案中的SEQ ID No: I。根据本发明的示例性经修饰的Rv3616c蛋白质是包含SEQ ID Nos: 161-169,179和180中提供的氨基酸序列的那些(例如由SEQ ID Nos: 161-169、179和180中提供的氨基酸序列组成的那些)。特别有利的是包含SEQ ID Nos: 161、163-169、179和180中提供的氨基酸序列的那些(例如由SEQ ID Nos: 161、163-169、179和180中提供的氨基酸序列组成的那些)。还提供的是用于用作药物的此类经修饰的Rv3616c蛋白质。本发明的进一步方面涉及用于在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括经修饰的Rv3616c蛋白质的施用。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善或预防TB的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述多肽诱导免疫应答。在进一步方面，该方法进一步包括诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。经修饰的Rv3616c蛋白质在制造用于治疗、改善或预防TB的药物中的用途代表本发明的另一个方面。本发明提供了包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸。包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的示例性多核苷酸是包含SEQ ID Nos: 170-178中提供的核苷酸序列的那些，例如由SEQ ID Nos: 170-178中提供的核苷酸序列组成的那些。包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的其他示例性多核苷酸是包含核苷酸序列的那些(例如由其组成)，所述核苷酸序列编码SEQ ID Nos: 161-169、179或180中提供的氨基酸序列，例如 SEQ ID Nos: 161、163-169、179 或 180。还提供的是用于用作药物的多核苷酸，其包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列。
本发明的进一步方面涉及用于在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括多核苷酸的施用，所述多核苷酸包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善、延迟或预防结核再活动的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列，其中所述多肽诱导免疫应答。在进一步方面，该方法进一步包括诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。包含核酸序列的多核苷酸在制造用于治疗、改善或预防TB的药物中的用途代表本发明的另一个方面，所述核酸序列编码包含经修饰的Rv3616c蛋白质的多肽。另外，提供的是包含下述的药物组合物
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；或
(b)包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸；
和
(c)药学可接受的载体或赋形剂。进一步地，提供的是免疫原性组合物，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；或
(b)包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸；和
(C)非特异性免疫应答增强剂。还提供的是包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的表达载体。用所述表达载体转化的宿主细胞形成本发明的进一步方面。另外提供的是重组表达经修饰的Rv3616c蛋白质的宿主细胞。进一步地，提供的是用于产生经修饰的Rv3616c蛋白质的方法；
所述方法包括在宿主细胞内重组表达所述多肽的步骤。还提供的是诊断试剂盒，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；
(b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与来自个体的样品(例如全血或更适当地PBMC)接触的仪器；和
(C)定量样品的T细胞应答的装置(means)。本发明的另一个方面涉及诊断试剂盒，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；和
(b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与患者的表皮细胞接触的仪器。本发明的进一步方面涉及用于检测受试者中的结核分枝杆菌感染的方法，其包括
Ca)使来自所述受试者的样品与经修饰的Rv3616c蛋白质接触；和
(b)在生物学样品中检测结合经修饰的Rv3616c蛋白质的抗体的存在。本发明还提供了诊断试剂盒，其包含
(a)经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质任选固定在固体载体上；和
(b)检测试剂。在一个实施方案中，接受根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物的受试者可以具有活动性结核(例如通过结核分枝杆菌的活动性感染)。在第二个实施方案中，受试者可以具有潜伏性结核(例如通过结核分枝杆菌的潜伏感染)。在第三个实施方案中，受试者可以不具有结核(例如不具有通过结核分枝杆菌的感染)。接受根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物的受试者可以先前已就结核接种疫苗(例如针对通过结核分枝杆菌的感染接种疫苗)，例如已用卡介苗(BCG)接种疫苗。可替代地，接受本发明的多肽、多核苷酸或组合物的受试者可以先前未就结核接种疫苗(例如未针对通过结核分枝杆菌的感染接种疫苗)，例如未用卡介苗(BCG)接种疫苗。根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物可以提供用于下述目的
-治疗活动性结核；
-预防活动性结核(例如通过施用于未感染的受试者或可替代地具有潜伏性感染的受试者)；
-治疗潜伏性结核；
-预防潜伏性结核；或
-预防或延迟结核的再活动(特别是TB再活动的延迟，例如数月、数年或甚至无限期的时间段)。还提供的是用于治疗潜伏性TB的方法，其包括步骤
(i)将受试者鉴定为具有潜伏性TB感染(例如通过pro或基于T细胞的测定)；和
(ii)给所述受试者施用安全和有效量的经修饰的Rv3616c蛋白质或编码经修饰的Rv3616c蛋白质的多核苷酸(例如以药物组合物或免疫原性组合物的形式)。还提供的是本发明的多肽在制造用于鉴定测试受试者中的TB (例如潜伏性TB)的诊断试剂盒中的用途。附图简述
图I :与全长序列的Rv3616c肽比对。
图2 :对 Rv3616c 肽的 PBMC 应答。图3 :在第21天时(即第二次免疫接种后7天)表达IFN- Y和/或IL_2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的CB6F1小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图4 :在免疫接种的CB6F1小鼠中抗原特异性⑶4应答的在第21天时(即第二次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图5 :在免疫接种的CB6F1小鼠中抗原特异性⑶8应答的在第21天时(即第二次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图6 :在第35天时(即第三次免疫接种后7天)表达IFN-Y和/或IL_2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的CB6F1小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图7 :在免疫接种的CB6F1小鼠中抗原特异性⑶4应答的在第35天时(即第三次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图8 :在免疫接种的CB6F1小鼠中抗原特异性⑶8应答的在第35天时(即第三次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图9 :在第21天时(即第二次免疫接种后7天)表达IFN-Y和/或IL_2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的C57BL/6小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。

图10 :在免疫接种的C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶4应答的在第21天时(即第二次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图11 :在第35天时(即第三次免疫接种后7天)表达IFN-Y和/或IL_2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的C57BL/6小鼠的⑶4和⑶8细胞百分比。图12 :在免疫接种的C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶4应答的在第35天时(即第三次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图13 :在免疫接种的C57BL/6小鼠中抗原特异性⑶8应答的在第35天时(即第三次免疫接种后7天)的细胞因子概况。图14 :在首次用于实验且潜伏性感染的人中的抗原特异性⑶4 T细胞应答。图15 :野生型Rv3616c蛋白质序列的比对。图16A和16B :示例性经修饰的Rv3616c蛋白质序列的比对。图17 :起始抗原表达实验的SDS-PAGE结果。图18 :进一步抗原表达实验的SDS-PAGE结果。图19 :另外抗原表达实验的SDS-PAGE结果。图20 :在用Rv3616 Δ 138-145第二次免疫接种后7天和第三次免疫接种后7天时表达IFN-Y和/或IL-2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的小鼠的CD4细胞百分比。图21 :在用Rv3616 Δ 138-145第二次免疫接种后7天时Rv3616c特异性CD4 T细胞应答的细胞因子概况。图22 :在用Rv3616 Δ 138-145第三次免疫接种后7天时Rv3616c特异性CD4 T细胞应答的细胞因子概况。图23 :在用Rv3616 Δ 138-145第二次免疫接种后7天和第三次免疫接种后7天时表达IFN-Y和/或IL-2和/或TNF-α细胞因子的来自免疫接种的小鼠的CD8细胞百分比。图24 :在用Rv3616 Δ 138-145第二次免疫接种后7天时Rv3616c特异性CD8 T细胞应答的细胞因子概况。
图25 :在用Rv3616 Δ 138-145第三次免疫接种后7天时Rv3616c特异性CD8 T细胞应答的细胞因子概况。列出序列的描述
SEQID No: I:来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c的多肽序列。SEQ ID No: 2:来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c的多核苷酸序列。SEQ ID No: 3:来自结核分枝杆菌CDC1551菌株的Rv3616c的多肽序列。SEQ ID No: 4:来自结核分枝杆菌Fll菌株的Rv3616c的多肽序列。SEQ ID No: 5:来自结核分枝杆菌Haarlem A菌株的Rv3616c的多妝序列。SEQ ID No: 6:来自结核分枝杆菌C菌株的Rv3616c的多肽序列。SEQ ID No: 7:来自及石的Rv3616c的多肽序列。SEQ ID No: 8 :Mtb8. 4 的多肽序列。SEQ ID No: 9 :Mtb9. 8 的多肽序列。SEQ ID No: 10 :Mtb9. 9 的多肽序列。SEQ ID No: 11 :Ral2 的多肽序列。SEQ ID No: 12 :Ra35 的多肽序列。SEQ ID No: 13 :TbH9 的多肽序列。SEQ ID No: 14 :Mtb41 的多肽序列。SEQ ID No: 15 :ESAT_6 的多肽序列。SEQ ID No: 16 :Ag85A 的多肽序列。SEQ ID No: 17 :Ag85B 的多肽序列。SEQ ID No: 18 : α -晶体蛋白的多肽序列。SEQ ID No: 19 :ΜΡΤ64 的多肽序列。SEQ ID No: 20 :Mtb32A 的多肽序列。SEQ ID No: 21 :Ser/Ala 突变的成熟 Mtb32A 的多肽序列。SEQ ID No: 22 :ΤΒ10· 4 的多肽序列。SEQ ID No: 23 :Mtb72f 的多肽序列。SEQ ID No: 24 :M72 的多肽序列。SEQ ID No: 25 :Mtb71f 的多肽序列。
SEQ ID No:26 :M92融合物的多肽序列。SEQ ID No:27 :M103融合物的多肽序列。SEQ ID No:28 :M114融合物的多肽序列。SEQ ID No:29 :假定的人CD4细胞表位I。SEQ ID No:30 :假定的人CD4细胞表位2。SEQ ID No:31 :假定的人CD4细胞表位3。SEQ ID No:32 :假定的人CD4细胞表位4。SEQ ID No:33 :假定的人CD4细胞表位5。 SEQ ID No:34 :假定的人CD4细胞表位6。SEQ ID No:35 :假定的人CD4细胞表位7。SEQ ID No:36 :假定的人CD4细胞表位8。SEQ ID No:37 :假定的人CD4细胞表位9。SEQ ID No:38 :假定的人CD4细胞表位10。SEQ ID No:39 :假定的人CD4细胞表位11。SEQ ID No:40 :假定的人CD4细胞表位12。SEQ ID No:41 :假定的人CD4细胞表位13。SEQ ID No:42 :假定的人CD4细胞表位14。SEQ ID No:43 :假定的人CD4细胞表位15。SEQ ID No:44 :假定的人CD4细胞表位16。SEQ ID No:45 :假定的人CD4细胞表位17。SEQ ID No:46 :假定的人CD4细胞表位18。SEQ ID No:47 :假定的人CD4细胞表位19。SEQ ID No:48 :假定的人CD8细胞表位I。SEQ ID No:49 :假定的人CD8细胞表位2。SEQ ID No:50 :假定的人CD8细胞表位3。SEQ ID No:51 :假定的人CD8细胞表位4。SEQ ID No:52 :假定的人CD8细胞表位5。SEQ ID No:53 :假定的人CD8细胞表位6。SEQ ID No:54 :假定的人CD8细胞表位7。SEQ ID No:55 :假定的人CD8细胞表位8。SEQ ID No:56 :假定的人CD8细胞表位9。SEQ ID No:57 :假定的人CD8细胞表位10。SEQ ID No:58 :假定的人CD8细胞表位11。SEQ ID No:59 :假定的人CD8细胞表位12。SEQ ID No:60 :假定的人CD8细胞表位13。SEQ ID No:61 :假定的人CD8细胞表位14。SEQ ID No:62 :假定的人CD8细胞表位15。SEQ ID No:63 :假定的人CD8细胞表位16。SEQ ID No:64 :假定的人CD8细胞表位17。
SEQ ID No:65 :假定的人CD8细胞表位18。SEQ ID No:66 :假定的人CD8细胞表位19。SEQ ID No:67 :假定的人CD8细胞表位20。SEQ ID No:68 :假定的人CD8细胞表位21。SEQ ID No:69 :假定的人CD8细胞表位22。SEQ ID No:70 :假定的人CD8细胞表位23。SEQ ID No:71 :假定的人CD8细胞表位24。SEQ ID No:72 :假定的人CD8细胞表位25。 SEQ ID No:73 :假定的人CD8细胞表位26。SEQ ID No:74 :假定的人CD8细胞表位27。SEQ ID No:75 :假定的人CD8细胞表位28。SEQ ID No:76 :假定的人CD8细胞表位29。SEQ ID No:77 :假定的人CD8细胞表位30。SEQ ID No:78 :假定的人CD8细胞表位31。SEQ ID No:79 :假定的人CD8细胞表位32。SEQ ID No:80 :假定的人CD8细胞表位33。SEQ ID No:81 :假定的人CD8细胞表位34。SEQ ID No:82 :假定的人CD8细胞表位35。SEQ ID No:83 :假定的人CD8细胞表位36。SEQ ID No:84 :假定的人CD8细胞表位37。SEQ ID No:85 :假定的人CD8细胞表位38。SEQ ID No:86 :假定的人CD8细胞表位39。SEQ ID No:87 :假定的人CD8细胞表位40。SEQ ID No:88 :假定的人CD8细胞表位41。SEQ ID No:89 :假定的人CD8细胞表位42。SEQ ID No:90 :假定的人CD8细胞表位43。SEQ ID No:91 :假定的人CD8细胞表位44。SEQ ID No:92 :假定的人CD8细胞表位45。SEQ ID No:93 :假定的人CD8细胞表位46。SEQ ID No:94 :假定的人CD8细胞表位47。SEQ ID No:95 :假定的人CD8细胞表位48。SEQ ID No:96 :假定的人CD8细胞表位49。SEQ ID No:97 :假定的人CD8细胞表位50。SEQ ID No:98 :假定的人CD8细胞表位51。SEQ ID No:99 :假定的人CD8细胞表位52。SEQ ID No:100 :假定的人CD8细胞表位53。SEQ ID No:101 :假定的人CD8细胞表位54。SEQ ID No:102 :假定的人CD8细胞表位55。SEQ ID No:103 :假定的人CD8细胞表位56。
SEQ ID No:104 :假定的人CD8细胞表位57。SEQ ID No:105 :假定的人CD8细胞表位58。SEQ ID No:106 :假定的人CD8细胞表位59。SEQ ID No:107 :假定的人CD8细胞表位60。SEQ ID No:108 :假定的人CD8细胞表位61。SEQ ID No:109 :假定的人CD8细胞表位62。SEQ ID No:110 :假定的人CD8细胞表位63。SEQ ID No:111 :假定的人CD8细胞表位64。
SEQ ID No:112 :假定的人CD8细胞表位65。SEQ ID No:113 :假定的人CD8细胞表位66。SEQ ID No:114 :假定的人CD8细胞表位67。SEQ ID No:115 :假定的人CD8细胞表位68。SEQ ID No:116 :假定的人CD8细胞表位69。SEQ ID No:117 :假定的人CD8细胞表位70。SEQ ID No:118 :假定的人CD8细胞表位71。SEQ ID No:119 :假定的人CD8细胞表位72。SEQ ID No:120 :假定的人CD8细胞表位73。SEQ ID No:121 :假定的人CD8细胞表位74。SEQ ID No:122 :假定的人CD8细胞表位75。SEQ ID No:123 :假定的人CD8细胞表位76。SEQ ID No:124 :假定的人CD8细胞表位77。SEQ ID No:125 :假定的人CD8细胞表位78。SEQ ID No:126 :假定的人CD8细胞表位79。SEQ ID No:127 :肽 I。SEQ ID No:128 :肽 2。SEQ ID No:129 :肽 3。SEQ ID No:130 :肽 4。SEQ ID No:131 :肽 5。SEQ ID No:132 :肽 6。SEQ ID No:133 :肽 7。SEQ ID No:134 :肽 8。SEQ ID No:135 :肽 9。SEQ ID No:136 :肽 10。SEQ ID No:137 :肽 11。SEQ ID No:138 :肽 12。SEQ ID No:139 :肽 13。SEQ ID No:140 :肽 14。SEQ ID No:141 :肽 15。SEQ ID No:142 :肽 16。
SEQ ID No: 143 :肽 17。SEQ ID No: 144 :肽 18。SEQ ID No: 145 :肽 19。SEQ ID No: 146 :肽 20。SEQ ID No: 147 :肽 21。SEQ ID No: 148 :肽 22。SEQ ID No: 149 :肽 23。SEQ ID No: 150 :肽 24。 SEQ ID No: 151 :肽 25。SEQ ID No: 152 :肽 26。SEQ ID No: 153 :肽 27。SEQ ID No: 154 :肽 28。SEQ ID No: 155 :肽 29。SEQ ID No: 156 :肽 30。SEQ ID No: 157:来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rvl753c的多肽序列。SEQ ID No: 158:来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No: 159:来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv2707c的多肽序列。SEQ ID No: 160:关于来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c的大肠杆菌(万.cWi)密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 161:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 136-183的多肽序列。SEQ ID No: 162:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 150-160的多肽序列。SEQ ID No: 163:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 136-154的多肽序列。SEQ ID No: 164:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 166-182的多肽序列。SEQ ID No: 165:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 135-139的多肽序列。SEQ ID No: 166:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 142-145的多肽序列。SEQ ID No: 167:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 138-145的多肽序列。SEQ ID No: 168:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 145-152的多肽序列。SEQ ID No: 169:衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 149-154的多肽序列。SEQ ID No: 170:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 136-183的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。
SEQ ID No: 171:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 150-160的
大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 172:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 136-154的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 173:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 166-182的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 174:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 135-139的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。
·
SEQ ID No: 175:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 142-145的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 176:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 138-145的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 177:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 145-152的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 178:编码衍生自结核分枝杆菌H37Rv菌株的Rv3616c Λ 149-154的大肠杆菌密码子最佳化的多核苷酸序列。SEQ ID No: 179:基于在来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的残基137-139周围的分离和重排，包括Cysl38的缺失，经修饰的Rv3616c蛋白质的多肽序列。SEQ ID No: 180:基于在来自结核分枝杆菌H37Rv菌株的残基152-153周围的分离和重排，经修饰的Rv3616c蛋白质的多肽序列。详述
本发明一般涉及经修饰的Rv3616c多肽或编码其的多核苷酸在潜伏性分枝杆菌感染领域中的用途。另外，本发明涉及特定经修饰的Rv3616c蛋白质。本发明人已惊讶地发现破坏Rv3616c蛋白质序列的特定区域的疏水性可以导致改善的表达,而无对免疫原性性质的基本有害影响。经修饰的Rv3616c蛋白质具有作为TB抗原的用途，特别是作为潜在TB抗原的用途。在分枝杆菌属感染的早期过程中强烈表达的几种蛋白质已显示在动物疫苗接种模型中提供强保护功效。然而，用在感染的早期过程中高度表达的抗原的疫苗接种可能不提供用于处理感染的稍后期的最佳免疫应答。在潜伏性感染过程中的足够控制可能要求在那个时间表达的对于特定抗原特异性的T细胞。直接靶向休眠持续细菌的暴露后疫苗可以帮助保护不受TB再活动，从而增强TB控制，或甚至使得感染的清除成为可能。靶向潜伏性TB的疫苗因此可以显著地和节约地减少全球TB感染率。基于晚期抗原的亚单位疫苗还可以与早期抗原组合利用，以提供多期疫苗。可替代地，晚期抗原可以用于补充且改善BCG疫苗接种(通过加强BCG应答或通过晚期重组BCG菌株的开发)。虽然巨噬细胞已显示充当分枝杆菌属免疫的主要效应物，但T细胞是此类免疫的占优势诱导物。T细胞在保护不受结核中的基本作用通过由于CD4+ T细胞的相关耗尽，在人免疫缺陷病毒感染个体中TB再活动的增加率举例说明。此外，在对于结核分枝杆菌的初次免疫应答达到最高点时取得的CD4+ T细胞的过继转移已显示在T细胞缺陷小鼠中赋予不受结核分枝杆菌的保护(Orme等人J Exp. Med. 1983 158:74-83)。分枝杆菌属反应性⑶4+ T细胞已显示为Y-干扰素(IFN-Y)的潜在生产者，所述Y-干扰素(IFN-Y)又已显示在小鼠中触发巨噬细胞的抗分枝杆菌效应(Flynn等人J. Exp. Med. 1993 178:2249-2254)。虽然IFN-Y在人中的作用较不明确，但研究已显示单独或与IFN-Y或肿瘤坏死因子-α组合的1，25-二羟基-维生素D3激活人巨噬细胞，以抑制结核分枝杆菌感染。此外，已知IFN- Y刺激人巨噬细胞，以制备1，25- 二羟基-维生素D3。类似地，白细胞介素-12 (IL-12)已显示在刺激对结核分枝杆菌感染的抗性中起作用。关于结核分枝杆菌感染的免疫学的综述，参见Chan & Kaufmann, Tuberculosis:Pathogenesis，Protection and Control ΓΒΙοοι 1994), Tuberculosis (胃 2 片反，Rom和 Garay,编辑，2003),和/zkrriso/ 7 S Principles of Internal Medicine，第 150 章，第953-966 页(第 16 版，Braunwald,等人,编辑，2005)。潜伏性TB感染的诊断通常使用结核菌素皮肤测试来实现，其涉及对于结核菌素纯蛋白衍生物(PB))的皮内暴露。抗原特异性T细胞应答导致到注射后48-72小时在注射部位的可测量硬结，这指示暴露于分枝杆菌抗原。然而，灵敏度和特异性已成为关于这种测试的问题，并且用BCG接种疫苗的个体无法始终容易地区别于受感染个体(根据BCG不保护不受潜伏性感染的事实，这是特别重要的)。一般而言，已接受BCG但未受结核分枝杆菌感染的个体显示直径小于10 mm的PH)反应，而具有直径超过10 mm的PB)反应的人视为已受结核分枝杆菌感染。然而，这个规则不可应用于由于HIV感染具有免疫抑制的个体，这导致直径小于10 mm的PB)反应)；或在地方性流行的国家中，其中受非结核分枝杆菌感染的人可以显示直径超过10 mm的PF1D反应。经过近年的进展已看到体外基于T细胞测定的开发，基于干扰素-Y释放且使用对于结核分枝杆菌比pro更特异性的抗原，即ESAT-6和CFP-10。这些高特异性测试看起来至少与结核菌素皮肤测试一样灵敏，且还证实由于BCG疫苗接种更少的交叉反应性。关于潜伏性TB诊断的近期综述,参见Pai I等}ν Expert Rev. MoL Diagn. 2006 6
(3):413-422。然而，因为ESAT-6/CFP-10是早期抗原，所以基于ESAT-6/CFP-10的测定只能在近期感染的人中最佳表现。因此，与潜伏性结核特异性相关的抗原的鉴定可以帮助开发更灵敏的测定，其可以确保更长期潜伏性感染的检测。仍存在关于有效策略的需要用于治疗和预防结核，特别是治疗和预防潜伏性TB和预防TB再活动。近来，基于全基因组结核分枝杆菌基因组的生物信息学分析(ZVi等人SJCMedical Genetics 2008 1:18)，和基于在活动性和潜伏性感染的个体中差异表达的蛋白质的测试(Schuck SD等人ONE 2009 4 (5) :e5590)，已提议一系列结核分枝杆菌疫苗候选物。Rv3616c也称为Mtb40、HTCCl和EspA，涉及结核分枝杆菌ESX-1分泌系统(Woodsworth 等人and Iimunity 2008 76(9): 4199-4205)。Rv3616c 先前已牵涉与结核相关的免疫应答(参见例如，W098/53075)。Al-Attiyah等人Exp. Immunol.2004 138:139-144已显示Rv3616c是通过肺部结核患者充分识别的(通过PMBC增殖和IFN- Y 生产)。Mustafa 等人 Tmmun. 2006 74 (8):4566-4572 已研究通过牛分枝杆菌感染和BCG接种疫苗的牛的Rv3616c识别。作为W02010/010177 公开的国际专利申请 PCT/EP2009/059580 描述了 Rv3616c 作为与TB感染的潜伏期相关的抗原的鉴定。国际专利申请W02010/121618提议组成性表达的蛋白质和编码其的基因用于免疫组合物例如疫苗的用途，包括EspA (即Rv3616c)。希望产生具有其野生型序列的疫苗抗原，从而确保通过疫苗诱发的免疫应答紧密对应于对抗通过病原体的感染所需的那些。然而，抗原的有效生产是减少与疫苗制造相关的成本中的重要因素。因此，以高水平方便地表达但避免对免疫原性的任何有害影响的经修饰的抗原可以提供基本利益。本发明寻求提供解决这个及其他问题的经修饰的Rv3616c抗原。不受理论束缚，结核分枝杆菌H37Rv菌株Rv3616c的氨基酸残基134-183被认为 对应于潜在跨膜区，其为低复杂性区域和卷曲螺旋。这些结构元件的一个、两个或所有三个的破坏使得所得到的经修饰的Rv3616c蛋白质序列能够以改善水平表达。因此，在其最广泛的方面，本发明提供了其中对应于H37Rv序列的残基134-183的氨基酸残基的疏水性已被破坏的经修饰的Rv3616c蛋白质，适当地其中对应于H37Rv序列的残基135-154的氨基酸残基的疏水性已被破坏的经修饰的Rv3616c蛋白质。术语‘破坏疏水性’意指序列修饰，其导致充分减少的疏水性，从而使得经修饰的Rv3616c蛋白质序列可以更有效地表达。希望地，相对于野生型序列的修饰程度应保持至最低限度，以减少对免疫原性的任何有害影响的可能性。如本文使用的，‘直接肽连接(direct peptide linkage)’是其中两种肽经由肽键直接彼此连接并且无需插入氨基酸序列的肽连接。‘间接肽连接’是其中两种肽经由肽键连接至第三种插入肽的肽连接。在本发明的背景下，存在用于破坏疏水性的四种主要方法-即，分离疏水残基、缺失疏水残基、用未水残基替换疏水残基和加入未水残基。技术人员将认识到还可以利用此类方法的组合。然而，如先前提及的，序列修饰的程度应理想地降到最低，以避免对免疫原性的不需要的有害影响。分离疏水残基可以通过下述实现在对应于SEQ ID No: I的残基133 - 184的氨基酸之间的位置上将Rv3616c蛋白质序列分成N末端和C末端片段，随后重排此类部分，从而使得N末端片段位于经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端区域，并且C末端片段位于经修饰的Rv3616c蛋白质的N末端区域。在本发明的一个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述经修饰的Rv3616c蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。第一种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基1_133具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。第二种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基184-392具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。适当地，第一种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基1_134具有至少90%同一性的序列，特别是至少95%同一性，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。 适当地，第二种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少90%同一性的序列，特别是至少95%同一性，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。适当地，第一个方面的经修饰的Rv3616c蛋白质不包含与全长SEQ ID No: I具有至少90%同一'丨生的序列。适当地,第一个方面的经修饰的Rv3616c蛋白质小于500个氨基酸长，例如小于450个氨基酸长，特别是小于400个氨基酸长。肽连接可以是直接的。肽连接可以可替代地是间接的。在本发明的第二个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述经修饰的Rv3616c蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。第一种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基1_133内的至少110个氨基酸的邻接序列，例如至少120个氨基酸或至少130个氨基酸，例如残基1-133。第二种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基184-392内的至少180个氨基酸的邻接序列，例如至少190个氨基酸或至少200个氨基酸，例如残基184-392。适当地，第一种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列，特别是至少110个氨基酸，例如至少120个氨基酸或至少130个氨基酸，例如残基1-134。适当地，第二种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列，特别是至少200个氨基酸，例如至少210个氨基酸或至少220个氨基酸，例如残基155-392。其中第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少235个氨基酸的邻接序列的实施方案也是有利的。适当地，第二个方面的经修饰的Rv3616c蛋白质不包含来自SEQ ID No: I的超过259个氨基酸的邻接序列。可替代地，第二个方面的经修饰的Rv3616c蛋白质不包含超过257个氨基酸的邻接序列、超过255个氨基酸的邻接序列或超过253个氨基酸的邻接序列。适当地，第二个方面的经修饰的Rv3616c蛋白质小于500个氨基酸长，例如小于450个氨基酸长，特别是小于400个氨基酸长。 肽连接可以是直接或间接连接。第一个和第二个方面的例子包括经修饰的Rv3616c蛋白质，其中第一种和第二种多肽对应于起因于在对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的氨基酸之间的位置上分开Rv3616c序列的N末端和C末端片段，例如残基138-139或152-153，例如其中肽连接是直接的残基138-139或152-153。适当地，当第一种和第二种多肽是重排的时，起始甲硫氨酸留在经修饰的Rv3616c蛋白质的N末端处。参见例如举例说明这类排列的SEQ ID Nos: 179和 180。缺失疏水残基可以通过去除对应于SEQ ID No: I的残基134 - 183的至少一个氨基酸来实现。缺失的残基可以是非邻接和/或邻接的。适当地，缺失疏水残基可以通过去除对应于SEQ ID No: I的残基134 - 183的至少两个氨基酸来实现。缺失疏水残基还可以通过去除对应于SEQ ID No: I的残基134 -183的至少三个氨基酸来实现。缺失的残基可以是非邻接和/或邻接的。可以指出野生型Rv3616c序列含有在位置138上的Cys残基。适当地，这个Cys残基是缺失或替换的(例如C138Q)。在本发明的第三个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，或可替代地基本上由Rv3616c序列组成或由Rv3616c序列组成,其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已从对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域中缺失。经修饰的Rv3616c蛋白质可以包含Rv3616c序列，或可替代地基本上由Rv3616c序列组成或由Rv3616c序列组成，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已从对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域中缺失。特别有利的是包含Rv3616c序列的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中至少I个氨基酸(例如至少2个)已从对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域中缺失。其他有利的序列是包含Rv3616c序列的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已从对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域中缺失。缺失的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 30，例如5 - 20或5 - 15)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 - 30，例如6 - 20或6 - 15)，特别是至少7个氨基酸(例如7-30，例如7 - 20或7 - 15)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 30，例如8 - 20或8 - 15)，或至少10个氨基酸(例如10 - 30，例如10 - 20或10 - 15)。在特定实施方案中，缺失的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-5个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基135-139的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；
-8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；
-17个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基166-182的那些；
-19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些；
-31个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-166的那些；
-48个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-183的那些。在其他实施方案中，缺失的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。缺失的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。在其他实施方案中，缺失的部分可以是对应于SEQ ID No: I中的残基135-138、SEQ ID No: I 中的残基 136-138、SEQ ID No: I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I 中的残基 152-154 的那些，或SEQ ID No: I中的残基149-151的缺失。本发明的第四个方面提供了经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。特别有利的是包含第一种和第二种多肽、或可替代地基本上由第一种多肽和第二种多肽组成、或由第一种多肽和第二种多肽组成的蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基 134-183。第一种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基1_133内的至少110个氨基酸的邻接序列，例如至少120个氨基酸或至少130个氨基酸(例如残基1-133)。第二种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基184-392内的至少180个氨基酸的邻 接序列，例如至少190个氨基酸或至少200个氨基酸(例如残基184-392)。来自对应于SEQ ID No: I中的134-183残基的缺失的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 30，例如5 - 20或5 - 15)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 - 30，例如6-20或6 - 15)，特别是至少7个氨基酸(例如7 - 30，例如7 - 20或7 - 15)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 30，例如8 - 20或8 - 15)，或至少10个氨基酸(例如10 - 30，例如10 - 20 或 10 - 15)。在特定实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的134-183残基的缺失的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-5个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基135-139的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；
-8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；
-17个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基166-182的那些；
-19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些；
-31个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-166的那些；
-48个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-183的那些。在其他实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的134-183残基的缺失的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。缺失的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。在其他实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的134-183残基的缺失的部分可以是对应于SEQ ID No: I 中的残基 135-138、SEQ ID No: I 中的残基 136_138、SEQ ID No:I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I中的残基152-154的那些，或SEQ ID No: I中的残基149-151的缺失。在某些实施方案中，第一种和第二种多肽将是直接连接的。在其他实施方案中，第一种和第二种多肽将是经由第三种多肽间接连接的。第三种多肽可以对应于其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。另外，第三种多肽可以对应于其中缺失已在多个不同位置(例如1-10个，例如1-5个，特别是I或2个位置)上发生的SEQ ID No: I中的残基134-183，每个缺失是1_10个，例如1_5个氨基酸残基。适当地，第三种多肽是48个氨基酸或更少(例如10-48，例如20_48或30_48个残基),例如46个氨基酸或更少(例如10-46，例如20-46或30-46个残基)，44个氨基酸或更少(例如10-44，例如20-44或30-44个残基)，或42个氨基酸或更少(例如10-42，例如20-42或30-42个残基)。本发明的第五个方面提供了包含第一种多肽和第二种多肽的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基
135-154。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸(例如至少2个)已缺失的SEQ ID No: I中的残基
135-154。特别有利的是包含第一种和第二种多肽、或可替代地基本上由第一种多肽和第二种多肽组成、或由第一种多肽和第二种多肽组成的蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和
(ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列；
其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的至少邻接部分已缺失的SEQ IDNo: I中的残基135-154。第一种多肽可以是在SEQ ID No: I的残基1_134内的至少110个氨基酸的邻接序列，例如至少120个氨基酸或至少130个氨基酸，例如残基1-134。第二种多肽还可以是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少200个氨基酸的邻接序列，例如至少210个氨基酸或至少220个氨基酸，例如残基155-392。其中第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少235个氨基酸的邻接序列的实施方案也是有利的。来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的缺失的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 20，例如5 - 15或5 - 10)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 - 20，例如6-15或6 - 10)，特别是至少7个氨基酸(例如7 - 20，例如7 - 15或7 - 10)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 20，例如8 - 15或8 - 10)，或至少10个氨基酸(例如10 - 20，例如10 - 15)。在特定实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的缺失的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；· -8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；或 -19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些。在其他实施方案中，来自对应于135-154残基的缺失的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。缺失的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、
6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。在其他实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的缺失的部分可以是对应于SEQ ID No: I 中的残基 135-138、SEQ ID No: I 中的残基 136_138、SEQ ID No:I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I中的残基152-154的那些，或SEQ ID No: I中的残基149-151的缺失。在某些实施方案中，第一种和第二种多肽可以是直接连接的。在其他实施方案中，第一种和第二种多肽可以是经由第三种多肽间接连接的。第三种多肽可以对应于其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的单个邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。另夕卜，第三种多肽可以对应于其中缺失已在多个不同位置(例如1-10个，例如1-5个，特别是I或2个位置)上发生的SEQ ID No: I中的残基135-154，每个缺失是1_10个，例如1_5个氣基酸残基。适当地，第三种多肽是20个氨基酸或更少(例如5-20，例如10_20个残基)，例如18个氨基酸或更少(例如5-18，例如10-18个残基)，16个氨基酸或更少(例如5-16，例如10-16个残基)，或14个氨基酸或更少(例如5-14，例如10-14个残基)。本发明的第六个方面提供了经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第
三种多肽与这样的序列具有至少90%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
134-183，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第
三种多肽与这样的序列具有至少90%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
134-183，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。第一种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基1_133具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。 第二种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基184-392具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。在某些实施方案中，第一种和第二种多肽可以是直接连接的。在其他实施方案中，第一种和第二种多肽将是经由第三种多肽间接连接的。第三种多肽可以是与下述序列具有至少95%同一性的序列，其对应于SEQ ID No: I中的残基134-183，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。从对应于SEQ ID No: I中的134-183残基中缺失的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 30，例如5 - 20或5 - 15)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 - 30，例如6 -20或6 - 15)，特别是至少7个氨基酸(例如7 - 30，例如7 - 20或7 - 15)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 30，例如8 - 20或8 - 15)，或至少10个氨基酸(例如10 - 30，例如10-20 或 10 - 15)。在特定实施方案中，从对应于SEQ ID No: I中的134-183残基中缺失的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-5个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基135-139的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；
-8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；
-17个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基166-182的那些；
-19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些；
-31个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-166的那些；
-48个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-183的那些。在其他实施方案中，缺失的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。缺失的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。在其他实施方案中，从对应于SEQ ID No: I中的134-183残基中缺失的部分可以是对应于 SEQ ID No: I 中的残基 135-138、SEQ ID No: I 中的残基 136-138、SEQ ID No:I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I中的残基152-154的那些，或SEQ ID No: I中的残基149-151的缺失。适当地，第三种多肽是48个氨基酸或更少(例如10-48，例如20_48或30_48个残基),例如46个氨基酸或更少(例如10-46，例如20-46或30-46个残基)，44个氨基酸或更少(例如10-44，例如20-44或30-44个残基)，或42个氨基酸或更少(例如10-42，例如20-42或30-42个残基)。本发明的第七个方面提供了包含第一种多肽和第二种多肽的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-134具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基155-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第 三种多肽与这样的序列具有至少80%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
135-154，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端,并且其中
(i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-134具有至少90%同一性的序列；和
(ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基155-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第
三种多肽与这样的序列具有至少80%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基
135-154，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失。第一种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基1_134具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。第二种多肽可以是与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少95%同一性的序列，例如至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。在某些实施方案中，第一种和第二种多肽将是直接连接的。在其他实施方案中，第一种和第二种多肽将是经由第三种多肽间接连接的。第三种多肽可以是与下述序列具有至少90%同一性的序列，其对应于SEQ ID No: I中的残基135-154，其中至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已缺失，例如至少95%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性或甚至100%等同的。来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的邻接部分缺失的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 20，例如5 - 15或5 - 10)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 -20，例如6 - 15或6 - 10)，特别是至少7个氨基酸(例如7 - 20，例如7 - 15或7 - 10)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 20，例如8 - 15或8 - 10)，或至少10个氨基酸(例如10 -20，例如 10 - 15)。在特定实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的邻接部分缺失的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；
-8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；或 -19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些。在其他实施方案中，缺失的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。缺失的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。在其他实施方案中，来自对应于SEQ ID No: I中的135-154残基的邻接部分缺失的部分可以是对应于SEQ ID No: I中的残基135-138、SEQ ID No: I中的残基136-138、SEQ ID No: I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I 中的残基 152-154 的那些，或 SEQ ID No: I 中的残基 149-151的缺失。适当地，第三种多肽是20个氨基酸或更少(例如5-20，例如10_20个残基)，例如18 个氨基酸或更少(例如5-18，例如10-18个残基)，16个氨基酸或更少(例如5-16，例如10-16个残基)，或14个氨基酸或更少(例如5-14，例如10-14个残基)。置换疏水残基可以通过用亲水残基替换对应于SEQ ID No: I的残基134 - 183的至少一个(例如至少2个)氨基酸来实现。在这点上，合适的亲水残基一般将是Gln (Q)、Asp (D)、Glu (E)、Asn (N)> His (H)> Lys (K)> Arg (R)、Ser (S)或 Thr (T)0特别有利的是用亲水残基替换对应于SEQ ID No: I的残基135 - 154的至少一个(例如至少2个)氨基酸。在这点上，合适的亲水残基一般将是Gln (Q)、Asp (D)、Glu (E)、Asn (N)> His (H)> Lys (K)> Arg (R)、Ser (S)或Thr (T)0置换的残基可以是非邻接的，尽管适当地是邻接的。在本发明的第八个方面，提供的是经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域的至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已由亲水残基置换。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质基本上由第一种多肽和第二种多肽组成，或可替代地由第一种多肽和第二种多肽组成，其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域的至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已由亲水残基置换。特别有利的是包含Rv3616c序列的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中来自对应于SEQID No: I中的残基135-154的区域的至少3个氨基酸(例如至少4个)的邻接部分已由亲水残基置换。置换的邻接部分可以是至少5个氨基酸(例如5 - 30，例如5 - 20或5 - 15)，尤其是至少6个氨基酸(例如6 - 30，例如6 - 20或6 - 15)，特别是至少7个氨基酸(例如7-30，例如7 - 20或7 - 15)，例如至少8个氨基酸(例如8 - 30，例如8 - 20或8 - 15)，或至少10个氨基酸(例如10 - 30，例如10 - 20或10 - 15)。在特定实施方案中，置换的邻接部分可以是
-4个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基142-145的那些；
-5个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基135-139的那些；
-6个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基149-154的那些；
-8个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基138-145或SEQ ID No: I中的残基145-152的那些；
-11个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基150-160的那些；
-17个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基166-182的那些；
-19个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-154的那些；
-31个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-166的那些；
-48个氨基酸，例如对应于SEQ ID No: I中的残基136-183的那些。在其他实施方案中，置换的邻接部分可以是3 - 10个氨基酸残基，例如4 - 10个，例如4 - 8个。置换的氨基酸的具体数目可以是3、4、5、6、7、8、9或10个，尤其是4、5、6或8个。 在其他实施方案中，置换的部分可以是对应于SEQ ID No: I中的残基135-138、SEQ ID No: I 中的残基 136-138、SEQ ID No: I 中的残基 137-138、SEQ ID No: I 中的残基 138-140、SEQ ID No: I 中的残基 138-141、SEQ ID No: I 中的残基 152-154 的那些，或SEQ ID No: I中的残基149-151的缺失。破坏疏水性还可以通过加入亲水残基来实现，例如在对应于SEQ ID No: I的残基133 - 184的那些残基之间的位置上加入至少一个亲水氨基酸残基(例如至少2个，例如2-10个)。适当地，可以加入至少3个亲水残基(例如3 - 20，例如3 - 15，尤其是3 -10)，例如至少4个亲水残基(例如4 - 20，例如4 - 15，尤其是4 - 10)，特别是至少5个亲水残基(例如5 - 20，例如5 - 15，尤其是5 - 10)，任选地至少6个亲水残基(例如6 - 20，例如6 - 15，尤其是6 - 10)。在这点上，合适的亲水残基一般将是Gln (Q)、Asp (D)、Glu (E)、Asn (N)> His (H)> Lys (K)> Arg (R)、Ser (S)或 Thr (T)0另外的亲水残基一般将位于对应于SEQ ID No: I的残基133 - 184的那些残基之间，尤其是对应于SEQ ID No: I的残基134 - 155的那些残基之间(例如对应于SEQ IDNo: I的残基135 - 154的那些残基之间)。另外的亲水残基可以分布在对应于SEQ ID No: I的残基133 - 184的那些残基之间的不同位置(例如1-10个,例如1-5个,特别是I或2个位置)上,每个位置具有1-10个另外的亲水残基，例如1-5个另外的残基。另外的亲水残基将适当地位于一个邻接基团中。在上文各个方面中所述的经修饰的Rv3616c蛋白质的特定实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质不是SEQ ID No: 162 (Rv3616c Λ 150-160)。在其他实施方案中，经修饰的Rv3616c 蛋白质不包含 SEQ ID No: 162 (Rv3616c Λ 150-160)。经修饰的Rv3616c蛋白质可以基于来自结核分枝杆菌的任何菌株的野生型Rv3616c蛋白质序列。例如，SEQ ID Nos: 3_7中的任何一个，特别是SEQ ID Nos: 3-6中的任何一个，可以取代在前述实施方案中的SEQ ID No: I。上文讨论的各个方面的蛋白质在本文中统称为经修饰的Rv3616c蛋白质。还提供的是用于用作药物例如用于治疗或预防TB的药物的此类经修饰的Rv3616c蛋白质。本发明的进一步方面涉及用于在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括经修饰的Rv3616c蛋白质的施用。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善或预防TB的方法，其包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述多肽诱导免疫应答。在进一步方面，该方法进一步包括诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善、延迟或预防结核再活动的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述多肽诱导免疫应答。在进一步方面，该方法进一步包括诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。经修饰的Rv3616c蛋白质在制造用于治疗、改善或预防TB的药物中的用途代表本发明的另一个方面。本发明提供了包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸。还提供的是用于用作药物例如用于治疗、改善或预防TB的药物的多核苷酸，其包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列。本发明的进一步方面涉及用于在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括含有编码 经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸的施用。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善或预防TB的方法，其包括给有此需要的受试者施用安全和有效量的多核苷酸，其包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列，其中所述多核苷酸诱导免疫应答。在进一步方面，本发明提供了用于诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答的方法。本发明的进一步方面涉及用于治疗、改善、延迟或预防结核再活动的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的多核苷酸，其包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列，其中所述多肽诱导和免疫应答。在进一步方面，该方法进一步包括诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。包含核酸序列的多核苷酸在制造用于治疗、改善或预防TB的药物中的用途代表本发明的另一个方面，所述核酸序列编码包含经修饰的Rv3616c蛋白质的多肽。另外，提供的是包含下述的药物组合物
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；或
(b)包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸；
和
(c)药学可接受的载体或赋形剂。进一步地，提供的是免疫原性组合物，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；或
(b)包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的多核苷酸；
和
(C)非特异性免疫应答增强剂。还提供的是包含编码经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列的表达载体。用所述表达载体转化的宿主细胞形成本发明的进一步方面。另外提供的是重组表达经修饰的Rv3616c蛋白质的宿主细胞。进一步地，提供的是用于产生经修饰的Rv3616c蛋白质的方法；
所述方法包括在宿主细胞内重组表达所述多肽的步骤。还提供的是诊断试剂盒，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；
(b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与来自个体的样品(例如全血或更适当地PBMC)接触的仪器；和
(c)定量样品的T细胞应答的装置。本发明的另一个方面涉及诊断试剂盒，其包含
Ca)经修饰的Rv3616c蛋白质；和
(b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与患者的表皮细胞接触的仪器。本发明的进一步方面涉及用于检测受试者中的结核分枝杆菌感染的方法，其包括
Ca)使来自所述受试者的样品与经修饰的Rv3616c蛋白质接触；和
(b)在生物学样品中检测结合经修饰的Rv3616c蛋白质的抗体的存在。本发明还提供了诊断试剂盒，其包含
(a)经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质任选固定在固体载体上；和
(b)检测试剂。在一个实施方案中，接受根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物的受试者可以具有活动性结核(例如通过结核分枝杆菌的活动性感染)。在第二个实施方案中，受试者可以具有潜伏性结核(例如通过结核分枝杆菌的潜伏感染)。在第三个实施方案中，受试者可以不具有结核(例如不具有通过结核分枝杆菌的感染)。接受根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物的受试者可以先前已就结核接种疫苗(例如针对通过结核分枝杆菌的感染接种疫苗)，例如已用卡介苗(BCG)接种疫苗。可替代地，接受本发明的多肽、多核苷酸或组合物的受试者可以先前未就结核接种疫苗(例如未针对通过结核分枝杆菌的感染接种疫苗)，例如未用卡介苗(BCG)接种疫苗。根据本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质、多核苷酸或组合物可以提供用于下述目的
-治疗活动性结核；
-预防活动性结核(例如通过施用于未感染的受试者或可替代地具有潜伏性感染的受试者)；
-治疗潜伏性结核；
-预防潜伏性结核；或
-预防或延迟结核的再活动(特别是TB再活动的延迟，例如数月、数年或甚至无限期的时间段)。还提供的是用于治疗潜伏性TB的方法，其包括步骤
(i)将受试者鉴定为具有潜伏性TB感染(例如通过pro或基于T细胞的测定)；和
(ii)给所述受试者施用安全和有效量的经修饰的Rv3616c蛋白质或编码经修饰的Rv3616c蛋白质的多核苷酸(例如以药物组合物或免疫原性组合物的形式)。还提供的是本发明的多肽在制造用于鉴定测试受试者中的TB (例如潜伏性TB)的诊断试剂盒中的用途。术语“结核复合物的分枝杆菌属物种”包括传统上认为引起疾病结核的那些物种，以及在免疫损害的患者例如具有AIDS的患者中引起结核和肺疾病的分枝杆菌属环境和机会种，例如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌CK africanum)、BCG為分枝杆菌CK an'a )、胞内分枝杆菌CK i/7irac<977w7ar<9)、隐藏分枝杆菌CK celatum)、日内瓦分枝杆菌CK geflaFeflse)、嗜血分枝杆菌CK Aa6 o/7A27tt )、堪萨斯分枝杆菌CK)、猿分支杆菌CK)、母牛分支杆菌CK raccae)、偶然分枝杆菌CK
fortuiia )和療病分枝杆菌 CK scrofulaceum)(参见例如,/ferriso/ ^sPrinciplesoflnternalMedicine，第 150 章，第 953-966 章(第 16 版，Braunwald,等人,编辑,2005)。本发明特别涉及由结核分枝杆菌的感染。术语“活动性感染”指具有表现的疾病症状和/或病灶(适当地具有表现的疾病症状)的感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)。术语“非活动性感染”、“潜伏感染”或“潜伏性感染”指不具有表现的疾病症状和/或病灶(适当地不具有表现的疾病症状)的感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)。具有潜伏 性感染的受试者适当地将是其测试对于感染阳性(例如通过pro或基于τ细胞测定)但未证实与活动性感染相关的疾病症状和/或病灶的受试者。术语“原发性结核”指在感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)后直接的临床病(例如疾病症状的表现)。参见，Harrison f sPrinciplesofInternalMedicine,第 150 章，第953-966 页(第 16 版，Braunwald,等人,编辑，2005)。术语“继发性结核”或“原发后结核”指潜伏、非活动性或潜伏性感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)的再活动。参见Harrison f sPrinciplesoflnternalMedicine,第150章,第 953-966 页(第 16 版，Braunwald,等人,编辑,2005)。术语“结核再活动”指其测试对于感染测试阳性(例如在结核菌素皮肤测试中，适当地在体外基于T细胞测定中)但不具有明显疾病症状的个体中疾病症状的以后表现。适当地，个体将不再暴露于感染。阳性诊断测试指示个体是受感染的，然而，个体可以先前已表现或仍未表现活动性疾病症状，其已充分治疗以使结核达到非活动性或潜伏性状态。应认识到用于预防、延迟或治疗结核再活动的方法可以在表现疾病的活动性症状的个体中起始。术语“药物抗性”结核指其中感染菌株未保持静止或被杀死(即有抵抗力)在治疗结核中有效的一种或多种所谓的“第一线”化学治疗剂(例如异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺)的感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)。术语“多药抗性”结核指其中感染菌株对在治疗结核中有效的一种或多种“第一线”化学治疗剂有抵抗力的感染(例如通过结核分枝杆菌的感染)。“化学治疗剂”指本领域已知且用于治疗结核(例如通过结核分枝杆菌的感染)的药理学试剂。用于治疗结核的示例性药理学试剂包括但不限于阿米卡星、氨基水杨酸、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟肼、异烟肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福喷汀和利福布汀)、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和荧光喹诺酮。用于治疗并非药物抗性的结核的“第一线”或“前线”化学治疗剂包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺。用于治疗已证实对于一种或多种“第一线”药物的药物抗性的结核的“第二线”化学治疗剂包括氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟肼、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。此类药理学试剂在and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics, Hardman 和 Limbird 编辑，2001 的第 48 章中综述。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及以后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。适当地，根据本发明的多肽将仅由天然存在的氨基酸残基组成，尤其是由遗传密码编码的那些氨基酸。“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其以单链或双链形式的聚合物。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可以通过其通常公认的单字母编码提及。如本文使用的术语‘Rv3616c蛋白质序列’意指在SEQ ID No: I中提供的Rv3616c多肽序列或其来自结核复合物的分枝杆菌属物种的同系物，例如物种例如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或非洲分枝杆菌，或其为环境或机会性的且在免疫损害的宿主(例如具有aids的患者)中引起机会感染例如肺感染的分枝杆菌属物种的同系物，例如及^、鸟分枝杆菌、 胞内分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、猿分支杆菌、母牛分支杆菌、偶然分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌(参见例如，Harrison’ S Principles ofInternal Medicine,第 150 章，第 953-966 章，第 16 版，Braunwald,等人,编辑，2005)。为了确保在接种疫苗的宿主中的高功效率，疫苗的组分应是在具有临床意义的菌株中充分保守的。适当地，Rv3616c蛋白质衍生自结核分枝杆菌H37Rv(即在SEQ ID No: I中提供的多肽序列)或其来自另一种结核分枝杆菌菌株的同系物(例如⑶Cl551、Fl I、HaarlemA和C菌株)。与药物抗性(例如MDR或尤其是XDR)相关的结核分枝杆菌菌株是关于野生型Rv3616c蛋白质序列的特别有价值的基础。有利的菌株包括
⑶C1551 -可传播和有毒的菌株
HaarIem家族(例如Haarlem A)-在密集人群中发现的药物抗性菌株。结核分枝杆菌菌株的Haarlem家族的成员已在全世界的许多部分中发现。该家族的第一个代表在Haarlem,荷兰发现。KZN4207 -从在KwaZulu-Natal，南非的患者中分离的药物敏感的分离物。KZN1435 -从在KwaZulu-Natal，南非的患者中分离的多药抗性(MDR)分离物。KZN605 -从在KwaZulu-Natal,南非的患者中分离的广泛药物抗性(XDR)分离物。C -在纽约市高度传播的。在一项研究中，发现这种菌株在注射药物使用者中更常见且对活性氮中间体有抵抗力(Friedman等人7； Infect. Dis. 1997 176(2):478-84)。94_M4241A - 1994年在旧金山从在中国出生的患者中分离的。这种菌株先前通过基因组缺失分析进行分析(Gagneux等人，/WA 2006 103 (8) :2869-2873)。02_1987- 2002年在旧金山从在南朝鲜出生的患者中分离的。这种菌株先前通过基因组缺失分析进行分析(Gagneux等人，/WA 2006 103 (8) :2869-2873)。T92 - 1999年在旧金山从在菲律宾出生的患者中分离的。这种菌株在Hirsh等人PNAS 2004 101:4871 - 4876)中公开。T85 - 1998年在旧金山从在中国出生的患者中分离的。这种菌株在Hirsh等人PNAS 2004 101:4871 - 4876)中公开。EAS054 - 1993年在旧金山从在印度出生的患者中分离的。这种菌株先前通过基因组缺失分析进行分析(Gagneux等人，/WA 2006 103 (8) :2869-2873)。Gagneux 等k’PNAS 2006 103 (8) :2869-2873 和 Herbert 等人 Infect. Tmmun.2007 75 (12):5798-5805提供了关于已知存在的结核分枝杆菌菌株范围的有价值的背景。最适当地，Rv3616c蛋白质选自SEQ ID Nos: I和3-7，特别是SEQ ID Nos: I和3-6，例如SEQ ID No: I中提供的多肽序列。SEQ ID Nos: I和3_7的比对在图15中提供。特别有利的经修饰的Rv3616c蛋白质是包含(或由其组成)SEQ ID Nos: 161-169的那些。特别有利的多核苷酸是衍生自对应于上文讨论的结核分枝杆菌菌株的野生型序列的那些，例如衍生自SEQ ID No: 2或其相关大肠杆菌密码子最佳化SEQ ID No: 160的那 些。组合
含有本发明的经修饰的Rv3616c蛋白质(或相关多核苷酸)的序列可以进一步包含设计为增强其免疫原性或在其他方面改善这些抗原的其他组分。例如，多肽抗原的改善分离可以通过朝向抗原的一个末端加入一段组氨酸残基(通常称为his-标记)得到促进。术语“his-标记”指一串组氨酸残基，一般为六个残基，其插入参考序列内。为了使与参考序列相关的活性的破坏降到最低，一般将his-标记插入N末端处，通常紧在起始甲硫氨酸残基后，否则在C末端处。它们通常对于天然序列是异源的但是掺入的，因为它们通过改善与固定金属亲和层析树脂(IMAC)的蛋白质结合而促进分离。一般说来，his-标记的存在或不存在从诱发针对参考蛋白质的希望免疫应答的观点看来并不具有重要性。然而，为了避免针对his-标记自身的不良反应的危险，认为最好使his-标记的长度降到最低，例如至四个或更少的残基，特别是两个残基，或完全排除his-标记的使用。为了改善诱发的免疫应答组成的量级和/或宽度，可以制备多肽(和编码其的核酸)，其包含多重经修饰的Rv3616c序列和/或来自结核分枝杆菌物种(特别是结核分枝杆菌)的另外的异源多肽或编码其的多核苷酸。本领域技术人员将认识到当组合利用许多组分时，精确存在可以是不同的。例如，可以存在经修饰的Rv3616c序列组分和抗原的另外拷贝或另外的异源抗原组分
(1)作为两种个别的多肽组分；
(2)作为包含两种多肽组分的融合蛋白；
(3)作为一种多肽和一种多核苷酸组分；
(4)作为两种个别的多核苷酸组分；
(5)作为编码两种个别的多肽组分的单一多核苷酸；或
(6)作为编码包含两种多肽组分的融合蛋白的单一多核苷酸。这种灵活性同样应用于其中组合使用三种或更多种组分的情况。然而，为了方便起见，通常希望当存在许多组分时，它们包含在单一融合蛋白或编码单一融合蛋白的多核苷酸内。在本发明的一个实施方案中，所有抗原组分作为多肽提供(例如在单一融合蛋白内)。在本发明的一个可替代实施方案中，所有抗原组分作为多核苷酸(例如单一多核苷酸，例如编码单一融合蛋白的多核苷酸)提供。当就核酸的部分而言使用时，术语“异源的”指示该核酸包含未以在自然界中彼此相同的关系发现的两种或更多种序列。例如，核酸一般是重组产生的，具有来自排列为制备新功能核酸的无关基因的两种或更多种序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质指示蛋白质包含未以在自然界中彼此相同的关系发现的两种或更多种子序列(例如融合蛋白)。“融合多肽”或“融合蛋白”指具有直接或经由氨基酸接头共价连接的至少两种异源多肽(例如至少两种分枝杆菌属物种多肽)的蛋白质。构成融合蛋白的多肽一般是C末端连接至N末端的，尽管它们还可以是C末端连接至C末端、N末端连接至N末端、或N末端连接至C末端的。融合蛋白的多肽可以以任何次序。这个术语还指保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、免疫原性片段和构成融合蛋白的抗原的种间同系物。分枝杆菌属结核抗原在Cole mk, Nature 393:537 (1998)中描述，其公开了整个结核分枝杆菌基因组。例如使用如本文描述的序列比较算法，或本领域技术人员已知的其他方法，例如杂交测定和抗体结合测定，可以鉴定对应于结核分枝杆菌抗原的来自其他分枝杆菌属物种的抗原。术语“融合的”指在融合蛋白中的两种多肽之间的共价键。多肽一般是经由肽键彼此直接或经由氨基酸接头连接的。任选地，肽可以是经由本领域技术人员已知的非肽共 价键连接的。可以与经修饰的Rv3616c序列组合的示例性结核分枝杆菌抗原包括下述中的一种或多种(例如I - 5种,例如I - 3种,特别是I种)
(i)Mtb8.4 (也称为 DPV 和 Rvll74c)，其多肽序列在 W097/09428 的 SEQ ID No: 102(SEQ ID No: 10 中的 cDNA)和 Coler 等人/otfraaJ of Immunology 1998 161:2356-2364中描述。特别有利的是不存在引导信号肽(即来自W097/09428的SEQ ID No: 102的氨基酸残基15-96)的成熟Mtb8. 4序列。Mtb8. 4的全长多肽序列显示于SEQ ID No:8中；
(ii)Mtb9.8 (也称为 MSL 和 Rv0287)，其多肽序列在 W098/53075 的 SEQ ID No: 109(MSL 的片段公开于 W098/53075 的 SEQ ID Nos: 110-124 中，SEQ ID Nos: 119 和 120 是特别有利的)以及Coler等人2009 27:223-233 (特别是其中图2中所示的反应片段)中描述。关于Mtb9. 8的全长多肽序列显示于SEQ ID No:9中；
(iii)Mtb9.9(也称为 Mtb9. 9A、MTI、MTI_A和 Rvl793)，其多肽序列在 W098/53075 的 SEQID No: 19 和 Alderson 等人/otfraaJ of Experimental Medicine 2000 7:551-559 (MTI的片段公开于 W098/53075 的 SEQ ID Nos: 17 和 51-66 中，SEQ ID Nos: 17、51、52、53、56和62-65是特别有利的)中描述。MTI的许多多肽变体在W098/53075的SEQ ID Nos: 21、23、25、27、29和31和六1(^^011等人/0 /77<37 of Experimental Medicine 2000 7:551-559中描述。关于Mtb9. 9的全长多肽序列显不于SEQ ID No: 10中；
(iv)Ral2(也称为Mtb32A C末端抗原)，其多肽序列在W001/98460的SEQ ID No: 10和 Skeiky 等人/otfraaJ of Immunology 2004 172:7618-7682 中描述。关于 Ral2 的全长多肽序列显示于SEQ ID No: 11中；
(v)Ra35(也称为Mtb32A N末端抗原)，其多肽序列在W001/98460的SEQ ID No: 8和Skeiky 等人/otfraaJ of Immunology 2004 172:7618-7682 中描述。关于 Ra35 的全长多妝序列显示于SEQ ID No: 12中；
(vi)TbH9 (也称为 Mtb39、Mtb39A、TbH9FL 和 Rvll96)，其多肽序列在 W097/09428 的SEQ ID No: 107 以及 Dillon 等人and Immunity 1999 67 (6) :2941-2950 和Skeiky 等人/otfraaJ of Immunology 2004 172:7618-7682 中描述。关于 TbH9 的全长多妝序列显示于SEQ ID No: 13中；
(vii)Mtb41(也称为MTCC2 和 Rv0915c)，其多肽序列在 W098/53075 的 SEQ ID No: 142(SEQ ID No: 140 中的 cDNA)和 Skeiky 等人/otfraaJ of Immunology 2000 165:7140-7149中描述。关于Mtb41的全长多肽序列显不于SEQ ID No: 14中；
(viii)ESAT-6 (也称为 esxA 和 Rv3875)，其多肽序列在 W097/09428 的 SEQ ID No:103 (SEQ ID No: 104 中的 cDNA)和 Sorensen 等人and Immunity 1995 63
(5):1710-1717中描述。关于ESAT-6的全长多肽序列显示于SEQ ID No: 15中；
(ix)Ag85复合抗原(例如Ag85A，也称为fbpA和Rv3804c ;*Ag85B，也称为fbpB和Rvl886c),其例如在 Content 等人and Iimunity 1991 59:3205-3212 和 Huygen等kNature Medicine 1996 2 (8) :893-898中讨论。关于Ag85A的全长多妝序列显不于SEQ ID No: 16中(残基43-338即缺乏信号肽的成熟蛋白质是特别有利的)。关于Ag85B的 全长多肽序列显示于SEQ ID No: 17中(残基41-325即缺乏信号肽的成熟蛋白质是特别有利的);
(X) α -晶体蛋白(也称为 hspX 和 Rv2031c),其在 Verbon 等 k Journal ofBacteriology 1992174:1352-1359 和 Friscia 等人 Clinical and ExperimentalImmunology 1995 102:53-57 (特别有利的是对应于残基 71-91、21-40、91_110 和 111-130的片段))中描述。关于α -晶体蛋白的全长多肽序列显示于SEQ ID No: 18中；
(xi)Mpt64(也称为Rvl980c),其在 Roche 等人Journal of Immunology1996 43:662-670中描述。关于MPT64的全长多肽序列显示于SEQ ID No: 19中(残基24-228即缺乏信号肽的成熟蛋白质是特别有利的)
(xii)Mtb32A，其多肽序列在W001/98460 的 SEQ ID No: 2 (全长)和 SEQ ID No: 4的残基8-330 (成熟)中描述，尤其是具有突变的催化三分子中的至少一个的变体(例如催化丝氨酸残基，其可以例如突变为丙氨酸)。关于Mtb32A的全长多肽序列显示于SEQ ID No:20中。具有Ser/Ala突变的Mtb32A的成熟形式显示于SEQ ID No: 21中；
(xiii)TBlO.4，关于TB10. 4的全长多肽序列显示于SEQ ID No: 22中；
(xiv)Rvl753c，关于来自结核分枝杆菌H37Rv的Rvl753c的全长多肽序列显示于SEQID No: 157 中；
(xv)Rv2386c，关于来自结核分枝杆菌H37Rv的Rv2386c的全长多肽序列显示于SEQIDNo: 158中；和/或
(xvi ) Rv2707c,关于来自结核分枝杆菌H37Rv的Rv2707c的全长多肽序列显示于SEQID No: 159 中。或其组合，例如
Ca)例如以融合蛋白例如Mtb72f形式的Ral2、TbH9和Ra35组分的组合。Mtb72f的多肽序列在 W02006/117240 的 SEQ ID No: 6 (SEQ ID No: 5 中的 cDNA)和 Skeiky 等人Journal of Immunology 2004 172:7618-7682 (在其中它掺入任选的His-标记以帮助纯化，当在本发明中利用时，适当地Mtb72f不存在任选的组氨酸残基)中描述。关于Mtb72f的多肽序列显示于SEQ ID No: 23中；
(b)例如以融合蛋白例如M72形式的Ral2、TbH9和Ser/Ala突变的Ra35 (即其中催化丝氨酸残基已用丙氨酸替换)组分的组合。M72的多肽序列在W02006/117240的SEQ IDNo: 4 (SEQ ID No: 3中的cDNA)中描述，在其中它掺入任选的双重组氨酸以帮助制造，当在本发明中利用时，M72也可以掺入双重组氨酸，尽管适当地M72不存在任选的双重组氨酸(即来自W02006/117240的SEQ ID No: 4的残基4-725是特别有利的)。关于M72的多肽序列显示于SEQ ID No: 24中；
(c)例如以融合蛋白例如Mtb71f形式的Mtb8.4、Mtb9. 8、Mtb9. 9和Mtb41组分的组合。Mtb71f 的多肽序列在 TO2006/117240 的 SEQ ID No: 16 (SEQ ID No: 15 中的 cDNA)中描述，在其中它掺入任选的Hi S-标记以帮助纯化，当在本发明中利用时，适当地Mtb71f对应于来自W099/051748的SEQ ID No: 16的残基9-710。关于Mtb71f的多肽序列显示于SEQID No: 25 中；
(d)例如在融合蛋白中Mtb72f或M72(适当地不具有任选的组氨酸残基以帮助表达)与Mtb9. 8和Mtb9. 9的组合。关于M72_Mtb9. 9_Mtb9. 8融合物的多肽序列显示于SEQ IDNo: 26中(M92融合物)，当在本发明中利用时，M72-Mtb9. 9_Mtb9. 8融合物可以任选在起始甲硫氨酸残基后掺入双重组氨酸以帮助制造；
(e)例如在融合蛋白例如Mtbl03f中Mtb72f或M72(适当地不具有任选的组氨酸残基以帮助表达)与Ag85B的组合。Mtbl03f的多肽序列在W003/070187的SEQ ID No: 18CSEQID No: 10中的cDNA)中描述，在其中它掺入任选的His-标记以帮助纯化，当在本发明中利用时,适当地Mtbl03f对应于来自W003/070187的SEQ ID No: 18的氨基酸残基8-1016。还特别有利的是M103，即在Ra35组分中掺入Ser/Ala突变的Mtbl03f，当在本发明中利用时，适当地M103对应于来自W003/070187的SEQ ID No: 18的氨基酸残基8-1016，其中在位置710上的Ser残基已用Ala替换。关于M103的多肽序列显示于SEQ ID No: 27中，当在本发明中利用时，M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合物可以任选在起始甲硫氨酸残基后掺入双重组氨酸以帮助制造；
(f)例如在融合蛋白例如Mtbl14f中Mtb72f或M72 (适当地不具有任选的组氨酸残基以帮助表达)与Mtb41的组合。MtblHf的多肽序列在W003/070187的SEQ ID No: 16CSEQID No: 9中的cDNA)中描述，在其中它掺入任选的His-标记以帮助纯化，当在本发明中利用时,适当地MtblHf对应于来自W003/070187的SEQ ID No: 16的氨基酸残基8-1154。还特别有利的是Ml 14，即在Ra35组分中掺入Ser/Ala突变的Mtbl 14f，当在本发明中利用时，适当地M114对应于来自W003/070187的SEQ ID No: 16的氨基酸残基8-1154，其中在位置710上的Ser残基已用Ala替换。关于M114的多肽序列显示于SEQ ID No: 28中，当在本发明中利用时，M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合物可以任选在起始甲硫氨酸残基后掺入双重组氨酸以帮助制造；
(g)例如在Doherty 等人/oaraa/ of Infectious Diseases 2004 190:2146 - 2153 中描述的融合物中Ag85B和ESAT-6组分的组合；和/或
(h)例如在Dietrich 等 k Journal of Immunology 2005 174 (10) : 6332-6339190:2146 - 2153中描述的融合物中Ag85B和TB10. 4组分的组合。经修饰的Rv3616c序列组分和Rvl753c组分的组合是特别有利的。明显地,此类组合可以任选含有其他另外的抗原组分(例如M72组分)。 另一种有利的组合包含经修饰的Rv3616c序列组分和M72组分。
进一步有利的组合包含经修饰的Rv3616c序列组分和Rv2386c组分。其他有利的组合包括包含经修饰的Rv3616c序列组分和Rv2707c组分的那些。另外有利的组合包含经修饰的Rv3616c序列组分和α-晶体蛋白组分。技术人员将认识到组合无需依赖于上文(i)_ (xvi)和(a)_ (h)中描述的具体序列，并且所述序列的保守修饰的变体(例如具有至少70%同一性，例如至少80%同一性，特别是至少90%同一性且尤其是至少95%同一性)或免疫原性片段(例如至少20%的全长抗原，例如至少50%的抗原，特别是至少70%且尤其是至少80%)可以用于实现相同实际效应。上述个别抗原序列各自也公开于Cole等人Tfeiare 1998 393:537-544和CamusMicrobiology 2002 148:2967-2973中。结核分枝杆菌H37Rv的基因组是可公开获得的，例如在 Welcome Trust Sanger Institute 网站(www. sanger. ac. uk/Projects/M_tuberculosis/)和其他地方。·上述抗原中的许多也公开于美国专利申请号08/523，435、08/523，436、08/658，800,08/659, 683,08/818, 111,08/818,112,08/942,341,08/942, 578,08/858,998、08/859，381,09/056, 556,09/072, 596,09/072, 967,09/073, 009,09/073, 010,09/223, 040、09/287，849 以及 PCT 专利申请 PCT/US98/10407、PCT/US98/10514、PCT/US99/03265、PCT/US99/03268、PCT/US99/07717、TO97/09428 和 TO97/09429、W098/16645, W098/16646 中，其各自引入本文作为参考。本发明的组合物、多肽和核酸还可以包含来自其他来源的另外多肽。例如，本发明的组合物和融合蛋白可以包括多肽或编码多肽的核酸，其中所述多肽增强抗原例如NS1，流感病毒蛋白质的表达(参见例如W099/40188和W093/04175)。本发明的核酸可以基于在选择的物种例如人(在体内表达的情况下)或特定细菌(在多肽生产的情况下)中的密码子优先性进行改造。SEQ ID No: 160例如提供用于在大肠杆菌中表达来自H37Rv的Rv3616c的密码子最佳化多核苷酸。经修饰的Rv3616c序列组分还可以与针对结核(例如结核分枝杆菌感染)有效的一种或多种化学治疗剂一起施用。此类化学治疗剂的例子包括但不限于阿米卡星、氨基水杨酸、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟肼、异烟肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素(即利福平、利福喷汀和利福布汀)、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素和荧光喹诺酮。此类化学疗法通过治疗医生的判断使用优选的药物组合来决定。用于治疗并非药物抗性的结核(例如结核分枝杆菌感染)的“第一线”化学治疗剂包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺。用于治疗已证实对于一种或多种“第一线”药物的药物抗性的结核(例如结核分枝杆菌感染)的“第二线”化学治疗剂包括氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟肼、氨基水杨酸、环丝氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。常规化学治疗剂一般经过相对长时间段(约9个月)施用。常规化学治疗剂与根据本发明的经修饰的Rv3616c序列组分的施用的组合可以使得化学治疗剂时期减少(例如至8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月或更少),而无功效中的减少。特别有利的是与卡介苗(BCG)结合的经修饰的Rv3616c序列组分的使用。例如以重组表达经修饰的Rv3616c蛋白质的经修饰的BCG的形式。可替代地，通过共施用或通过加强先前的BCG疫苗接种，经修饰的Rv3616c序列组分可以用于增强受试者对BCG疫苗接种的应答。当用于增强受试者对BCG疫苗接种的应答时，经修饰的Rv3616c序列组分可以明显以多肽或多核苷酸(任选与如上所述的另外抗原组分结合)的形式提供。技术人员将认识到组分的组合无需一起施用且可以这样应用分开或组合；同时、序贯或在短时期内；通过相同或通过不同途径。然而，为了方便起见，一般希望(其中施用方案是相容的)将组分的组合作为单一组合物施用。本发明的多肽、多核苷酸和组合物通常施用于人，但可以预期在其他哺乳动物包括驯养哺乳动物(例如犬、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、栗鼠)和农业哺乳动物(例如牛、猪、绵羊、山羊、马)中是有效的。变体
T细胞表位是由T细胞(例如⑶4+或⑶8+ T细胞)识别的氨基酸的短邻接段。T细胞表位的鉴定可以通过表位作图实验来实现，其是本领域技术人员众所周知的(参见例如，PauI,Fundamental Immunology,第 3 版，243-247( 1993)；Bei β barth ^kBioinformatics 2005 21 (Suppl. I):i29_i37)。可替代地，表位可以使用实施例中讨论的方法进行预测或作图。在不同的远交群体例如人中，不同HLA类型意指特定表位可以不由群体的所有成员识别。由于T细胞应答在结核中的关键牵涉，为了使识别水平和免疫应答标度达到最大，最佳修饰的Rv3616c蛋白质是含有完整的大多数(或适当地所有)T细胞表位的那种。“变体”或“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指其编码等同或基本上等同的氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不编码氨基酸序列至基本上等同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上等同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每一个位置上，密码子可以改变为所述的任何相应密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异导致“沉默”或“简并”变体，其是保守修饰变异的一个种类。编码多肽的本文的每一个核酸序列还描述核酸的每一个可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除通常是用于甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是用于色氨酸的唯一密码子的TGG外)可以进行修饰，以获得功能上等同的分子。相应地，编码多肽的核酸的每个沉默变异牵涉每个所述序列。非沉默变异是导致编码的氨基酸序列中的变化的那些(例如通过氨基酸残基的置换、缺失或添加)。本领域技术人员将认识到特定多核苷酸序列可以含有沉默和非沉默保守变异。关于蛋白质序列的变体，技术人员将认识到改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸对于多肽的个别置换、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中一种或多种改变导致氨基酸由功能上相似的氨基酸的置换或基本上不影响变体的生物学功能的残基的置换/缺失/添加。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体加上且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。—般而言，此类保守置换将落入下文指定的氨基酸分组之一内，尽管在某些情况下，其他置换可以是可能的，而基本上不影响抗原的免疫原性性质。下述八个组各自含有一般是关于彼此的保守置换的氨基酸O 丙氨酸(A)，甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M) (参见例如，Cre i ghton, Pro teins 1984)。适当地，此类置换不在表位区域中发生，并且因此对抗原的免疫原性性质没有显著影响。蛋白质变体还可以包括其中与参考序列相比较插入另外的氨基酸的那些。适当地，此类插入不在表位区域中发生，并且因此对抗原的免疫原性性质没有显著影响。插入的一个例子包括组氨酸残基的短段(例如2-6个残基)，以帮助表达和/或纯化所讨论的抗原。蛋白质变体包括其中与参考序列相比较氨基酸已缺失的那些。适当地，此类缺失不在表位区域中发生，并且因此对抗原的免疫原性性质没有显著影响。技术人员将认识到特定蛋白质变体可以包含置换、缺失和添加(或其任何组合)。在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“等同的”或“同一性”百分比，指如使用下述序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量的，当在比较窗或指定区域上就最大对应性相比较且比对时，两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有指定百分比的其为相同的(即指定区域上70%同一性，任选地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性)氨基酸残基或核苷酸。此类序列随后被说成是“基本上等同的”。这个定义还指测试序列的互补体(compliment)。任选地，同一性存在于长度至少约25 -约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或任选在长度75-100个氨基酸或核苷酸的区域上。适当地，比较在对应于参考序列(与变体序列相对比)的整个长度的窗口上执行。对于序列比较，一般地一个序列充当参考序列，测试序列与之相比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机内，需要时，指定子序列配对物，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定可替代的参数。序列比较算法随后基于程序参数，计算相对于参考序列关于测试序列的序列同一性百分比。如本文使用的，“比较窗”提及在两个序列最佳比对后，其中序列可以与相同数目的邻接位置的参考序列相比较的区段。用于比较的序列比对法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过下述进行Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman & WunschJ Mol. Biol. 48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson & Lipman,Nat’I. Acad. ScL USA 85:2444 (1988)的搜索相似性法，这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group, 575 Science Dr.，Madison, WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)，或手动比对和目视检查(参见例如,Ci/rrefli Pro toco Is in Molecular Biology (Ausube I 等人，编辑1995增刊))。有用算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进配对比对，产生来自一组相关序列的多重序列比对，以显示关系和序列同一性百分比。它还标绘显示用于产生比对的聚类关系的树或树状图。PILEUP 使用 Feng & Doolittle，7； Mol. Evol. 35:351-360 (1987)的渐进比对法的简化。使用的方法类似于由Higgins &CABIOS 5:151-153 (1989)
描述的方法。该程序可以比对高达300个序列，其各自具有5，000个核苷酸或氨基酸的最大限度长度。多重比对程序从两个最相似序列的配对比对开始，产生两个比对序列的聚类。这个聚类随后与下一个最相关的序列或比对序列的聚类进行比对。序列的两个聚类通过两个个别序列的配对比对的简单延伸进行比对。最终比对通过一系列渐进配对比对来实现。该程序通过指定具体序列及其用于序列比较区域的氨基酸或核苷酸配对物且通过指定程序参数来运行。使用PILEUP，将参考序列与其他测试序列相比较，以使用下述参数测定序列同一性百分比关系缺省缺口权(3. 00)、缺省缺口长度权(O. 10)、和加权末端缺口。PILEUP可以得自GCG序列分析软件包,例如版本7. O (Devereaux等人，M/c. Acids Res.12:387-395 (1984)。适合于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一个例子是BLAST和BLAST 2. O 算法，其分别在 Altschul 等人，M/c. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul 等人，7； Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中描述。用于执行 BLAST 分析的软件可通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(在www. ncbi. nlm. nih. gov/处的网站)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足某一正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些起始邻域字命中充当用于起始搜索的种子，以找到含有其的更长HSPs。字命中沿着每个序列在两个方向延伸，到累积比对得分可以增加的程度。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(关于一对匹配残基的奖励得分；总是〉0)和N (关于错配残基的处罚得分；总是〈0)进行计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积得分。当下述情况发生时，在每个方向的字命中延伸停止累积比对得分距离其最大达到的值减少数量X ;由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积得分变为零或以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W) 11、期望值(E)或10、M=5、N=-4和两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E) 10、和 BL0SUM62 评分矩阵(参见 Henikoff & Henikoff，/￥oc. Natl. Acad. Sci.USA 89:10915 (1989))比对(B) 50、期望值(E) 10、M=5、N=_4和两条链的比较作为缺省值。BLAST算法还执行在两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin &Altschul，/￥oc. Nat’I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由 BLAST 算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，其提供通过其在两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0. 2，更优选小于约0. 01，且最优选小于约0. 001，那么核酸视为与参考序列相似。在任何情况下，多肽序列的变体将具有与参考序列基本上相同的活性(在多核苷酸的情况下，变体多核苷酸序列将编码与参考序列具有基本上相同的活性的多肽)。基本上相同的活性意指在具有特异性抗原的PBMC或全血的体外再刺激测定中(例如再刺激数小时-高达两周的时间段，例如高达一天，I天-I周或I - 2周)，参考序列的至少50%，适当地至少75%且尤其是至少90%活性，所述测定测量经由淋巴组织增生的细胞活化，在培养物的上清液中细胞因子的产生(通过ELISA、CBA等测量的)，或通过细胞内和外染色(例如使用对于免疫标记特异性的抗体，例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69等)的T和B细胞应答表征，随后用流式细胞仪的分析。适当地，基本上相同的活性意指在T细胞增殖和/或IFN- Y产生测定中，参考序列的至少50%，适当地至少75%且尤其是至少90%活性。如本领域技术人员应理解的，在本发明中有用的多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列和更小的改造基因区段，其表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、肽等。此类区段可以是天然分离的，或通过人工合成修饰的。如技术人员应理解的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA (基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子，和不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但无需存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但无需连接至其他分子和/或支持材 料。多核苷酸可以包含天然序列(即编码分枝杆菌属抗原的内源序列或其部分)，或可以包含变体、或此类序列的生物学或功能变体。多核苷酸变体可以含有一个或多个置换、添力口、缺失和/或插入，从而使得编码的多肽的免疫原性相对于参考蛋白质并未减少。多核苷酸鉴定和表征
多核苷酸可以使用多种充分确定的技术中的任何进行鉴定、制备和/或操作。例如，如下文更详细地描述的，多核苷酸可以通过筛选cDNAs微阵列进行鉴定。此类筛选可以例如使用Synteni微阵列(Palo Alto, CA)执行,根据制造商的说明书(且基本上如通过Schena等人,/7TOC. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619 (1996)和 Heller 等人Natl.Acad. Sci. CM 94:2150-2155 (1997)描述的)。可替代地，多核苷酸可以由从细胞制备的cDNA进行扩增，所述细胞表达本文描述的蛋白质，例如结核分枝杆菌细胞。此类多核苷酸可以经由聚合酶链反应(PCR)进行扩增。对于这种方法，序列特异性引物可以基于本文提供的序列进行设计，并且可以是购买或合成的。多核苷酸的扩增部分可以用于从合适的文库(例如结核分枝杆菌cDNA文库)中分离全长基因，使用众所周知的技术。在此类技术内，文库(cDNA或基因组的)使用一种或多种多核苷酸探针或适合于扩增的引物进行筛选。优选地，文库进行大小选择，以包括更大的分子。随机引发的文库还可以优选用于鉴定基因的5’和上游区。基因组文库优选用于获得内含子和延伸5’序列。对于杂交技术，部分序列可以是使用众所周知的技术标记的(例如通过切口平移或用32P末端标记)。细菌或噬菌体文库随后一般通过使含有变性细菌菌落(或含有噬菌斑的菌苔)的滤器与标记的探针杂交进行筛选(参见Sambrook等k,Molecular Cloning: ALaboratory Manual Γ2000))。将杂交菌落或斑块选择且扩展,并且将DNA分离用于进一步分析。通过例如PCR使用来自部分序列的引物和来自载体的引物，可以分析cDNA克隆以测定另外序列的量。可以生成限制性图谱和部分序列，以鉴定一个或多个重叠克隆。全序列随后可以使用标准技术进行测定，其可以涉及生成一系列缺失克隆。所得到的重叠序列随后可以装配成单一邻接序列。全长cDNA分子随后通过使用众所周知的技术连接合适片段来生成。可替代地，存在用于从部分cDNA序列获得全长编码序列的众多扩增技术。在此类技术内，扩增一般经由PCR执行。多种商购可得的试剂盒中的任何可以用于执行扩增步骤。引物可以使用例如本领域众所周知的软件进行设计。引物优选是长度22-30个核苷酸，具有至少50%的GC含量且在约68°C - 72°C对靶序列退火。扩增区域可以如上所述进行测序，并且将重叠序列装配成邻接序列。一种此类扩增技术是反向 PCR (参见 Triglia 等K，Nucl. Acids Res. 16:8186(1988))，其使用限制性酶以生成在基因的已知区域中的片段。随后通过分子内连接将片段环化，并且用作模板用于使用衍生自已知区域的趋异引物的PCR。在可替代方法内，与部分序列相邻的序列可以通过用对于连接序列的引物和对于已知区域特异性的引物的扩增重新得到。一般对扩增序列实施用相同接头引物和对于已知区域的第二种引物的第二轮扩增。关于这种程序的变动在WO 96/38591中描述，其采用来自已知序列以相反方向起始延伸的两种引物。另一种此类技术称为“cDNA末端快速扩增”或RACE。这种技术涉及内部引物和外部引物的使用，其与多聚腺苷酸区域或载体序列杂交，以鉴定其为已知序列的5’和3’的序列。另外的技术包括捕获PCR (Lagerstrom等人,/OP ifeiAoofe1:111-19(1991))和步移 PCR (Parker 等人，M/c7. Acids. Res. 19:3055-60 (1991))。采用扩增 的其他方法也可以用于获得全长cDNA序列。在特定情况下，通过在表达序列标记(EST)数据库中提供的序列分析，例如可从GenBank获得的那种，可以获得全长cDNA序列。搜索重叠ESTs —般可以使用众所周知的程序(例如NCBI BLAST搜索)执行，并且此类ESTs可以用于生成邻接的全长序列。全长DNA序列还可以通过基因组片段的分析来获得。在宿主细胞中的多核苷酸表达
编码多肽或其融合蛋白或功能等价物的多核苷酸序列或其片段可以用于重组DNA分子中，以指导多肽在合适宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以产生编码基本上相同或功能上等价的氨基酸序列的其他DNA序列，并且这些序列可以用于克隆且表达给定多肽。如本领域技术人员应理解的，在某些情况下，产生具有非天然存在的密码子的多肽编码核苷酸序列可以是有利的。例如，可以选择由特定原核或真核宿主优选的密码子，以增加蛋白质表达率或产生具有所需性质的重组RNA转录物，所述性质例如长于由天然存在的序列生成的转录物那种的半衰期。此外，多核苷酸序列可以使用本领域一般已知的方法进行改造，以便由于多种原因而改变多肽编码序列，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，通过基因片段和合成寡核苷酸的随机片段化和PCR再装配的DNA改组可以用于改造核苷酸序列。此外，定点诱变可以用于插入新限制位点，改变糖基化模式，改变密码子优先性，产生剪接变体，或引入突变等等。天然、修饰或重组核酸序列可以连接至异源序列，以编码融合蛋白。例如，为了在肽文库中筛选多肽活性的抑制剂，编码可以通过商购可得的抗体识别的嵌合蛋白质可以是有用的。融合蛋白还可以改造为含有位于多肽编码序列和异源蛋白质序列之间的切割位点，从而使得多肽可以从异源部分中切割且纯化掉。编码所需多肽的序列可以是使用本领域众所周知的化学方法完整或部分合成的(参见 Caruthers,i￡ H.等人Acids Res. Symp· Ser.第 215-223 页(1980),Horn等)K，Nucl. Acids Res. Symp · Ser.第225-232页(1980))。可替代地，蛋白质自身可以使用化学法产生，以合成多肽的氨基酸序列或其部分。例如，肽合成可以使用多种固相技术执行(Roberge等)K，Science 269:202-204 (1995))，并且自动化合成可以例如使用ABI431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Palo Alto, CA)来实现。新近合成的肽可以通过制备型高效液相层析(例如Cre i ghton, Pro teins,Structures and Molecular Principles (1983))或本领域可获得的其他可比较技术基本上纯化。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解程序)加以证实。另夕卜，多肽的氨基酸序列或其任何部分可以在直接合成过程中改变和/或使用化学方法与来自其他蛋白质的序列或其任何部分组合，以产生变体多肽。为了表达所需多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等价物插入合适的表达载体内，即含有用于所插入编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。本领域技术人 员众所周知的方法可以用于构建含有编码目的多肽的序列以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。此类技术在 Sambrook 等k, Molecular Cloning, A Laboratory Manual Γ2000),和 Ausube7 等人，Current Pro toco Is in Molecular Biology Γ每年更新)中描述。多种表达载体/宿主系统可以用于含有且表达多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV ;烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非翻译区一增强子、启动子、5’和3’非翻译区一其与宿主细胞蛋白质相互作用，以进行转录和翻译。此类元件可以在其强度和特异性方面不同。取决于利用的载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适转录和翻译元件，包括组成性和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以利用诱导型启动子例如 PBLUESCRIPT 噬菌粒(Stratagene，La Jolla, Calif.)或 PSP0RT1 质粒(Gibco BRL, Gaithersburg,MD)的杂交IacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子一般是优选的。如果需要生成含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，基于SV40或EBV的载体可以有利地与合适的可选标记一起使用。在细菌系统中，取决于预期用于所表达多肽的用途，可以选择许多表达载体。例如，当需要大数量时，例如用于诱导抗体，可以使用指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene),其中编码目的多肽的序列可以连接到载体内在具有关于氨基末端Met和β -半乳糖苷酶的以后7个残基的序列的框内，从而使得产生杂交蛋白质；ρΙΝ载体(VanHeeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989));等。pGEX 载体(Promega,Madison, ffis.)还可以用于表达作为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般而言，此类融合蛋白是可溶的，并且通过吸附至谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后为在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，可以容易地从裂解的细胞中纯化。在此类系统中制备的蛋白质可以设计为包括发夹、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，从而使得克隆的目的多肽可以随意从GST部分中释放。
在酵母酿酒酵母cerevisiae)中，可以使用含有组成性或诱导型启动子例如α因子、醇氧化酶和PGH的许多载体。含有组成性或诱导型启动子的其他载体包括GAP、PGK、GAL和ADH。关于综述，参见Ausubel等人(同上)和Grant等k，MethodsEnzymol. 153:516-544 (1987)和 Romas 等人 lfeasi 8 423-88 (1992)。在其中使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可以通过许多启动子中的任何驱动。例如，病毒启动子例如CaMV的35S和19S启动子可以单独或与来自TMV的Ω引导序列组合使用(Takamatsu，J. 6:307-311 (1987))。可替代地，可以使用植物启动子例如RUBISC0的小亚基或热休克启动子(Coruzzi等k，EMBO J. 3:1671-1680(1984) ；Broglie 等)\，Science 224:838-843 (1984);和 Winter 等k, Results Probl.Cell Differ. 17:85-105 (1991))。这些构建体可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染引入植物细胞内。此类技术在许多可普遍获得的综述中描述(参见例如Hobbs in McGrawHill Yearbook of Science and Technology 第 191-196 页(1992))。昆虫系统也可以用于表达目的多肽。例如，在一个此类系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica )核型多角体病毒(AcNPV)用作载体，以在草地贪夜蛾 {Spodoptera frugiperda )细胞或粉纹夜蛾幼虫(TrichopIusia larvae )中表达外源基因。编码多肽的序列可以克隆到病毒的非必需区例如多角体蛋白基因内，且置于多角体蛋白启动子的控制下。多肽编码序列的成功插入将致使多角体蛋白基因失活且产生缺乏外壳蛋白质的重组病毒。重组病毒随后可以用于感染例如草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中可以表达目的多肽(Engelhard 等人，Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 :3224-3227(1994))。在哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统是一般可用的。例如，在其中腺病毒用作表达载体的情况下，编码目的多肽的序列可以连接到由晚期启动子和三联引导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物内。在病毒基因组的非必需El或E3区中的插入可以用于获得活病毒，其能够在受感染的宿主细胞中表达多肽(Logan & Shenk, Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 81:3655-3659(1984))。此外，转录增强子例如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子可以用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。关于与腺病毒载体合作的方法和方案在WoI ,Adenovirus Methods and Protocols，1998中综述。关于腺病毒载体使用的另外参考文献可以在JofefloFirw1SV A Medical Dictionary，Bibliography，and Annotated ResearchGuide to Internet Tfe/kreflces, 2004 中找到。特异性起始信号也可以用于实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。此类信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在其中编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体内的情况下，可以不需要另外的转录或翻译控制信号。然而，在其中仅插入编码序列或其部分的情况下，应提供外源翻译控制信号包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应在正确读码框中，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以具有天然和合成的多种起源。表达效率可以通过包括对于使用的特定细胞系统合适的增强子来增强，所述增强子例如在文献中描述的那些(Scharf.等)\，Results Probl. CellDiffer. 20:125-162 (1994))。此外，宿主细胞株可以就其调节所插入序列的表达或以所需方式加工所表达蛋白质的能力进行选择。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前原”形式的蛋白质的翻译后加工也可以用于促进正确插入、折叠和/或功能。可以选择具有用于此类翻译后活性的特异性细胞机制和特征机制的不同宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，以确保外源蛋白质的正确修饰和加工。对于重组蛋白质的长期、高得率生产，稳定表达一般是优选的。例如，稳定表达目的多核苷酸的细胞系可以使用表达载体进行转化，所述表达载体可以含有在相同或分开载体上的病毒复制起点和/或内源表达元件和可选标记基因。在载体引入后，在将它们转到选择培养基前，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。可选标记的目的是赋予对于选择的抗性，并且它的存在允许成功表达所引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可以使用对于细胞类型合适的组织培养技术进行增殖。任何数目的选择系统可以用于回收经转化的细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等:K，Cell 11:223-32 (1977))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，22:817-23 (1990))基因，其可以分别用于tk. sup.-或aprt. sup.-细胞中。此外，抗代谢物质、抗生素或除草剂抗性可以用作基础用于选择；例如，赋予对于氨甲蝶呤的抗性的 dhfr (Wigler 等人，Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:3567-70 (1980));赋 予对于氨基糖苷、新霉素和G-418的抗性的npt (Colbere-Garapin等人，J Mol. Biol.150:1-14 (1981));和分别赋予对于氯磺隆和草胺膦(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry，同上)。另外的可选基因已得到描述，例如允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB,或允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD (Hartman & Mulligan,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:8047-51 (1988))。近来，可见标记的使用已获得普及，其中此类标记如花青苷、β -葡糖醛酸酶及其底物GUS，和萤光素酶及其底物萤光素，不仅广泛用于鉴定转化体，还用于定量可归于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达的量(Rhodes 等k，Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995))。尽管标记基因表达的存在/不存在暗示目的基因也是存在的，但其存在和表达可能需要加以证实。例如，如果将编码多肽的序列插入标记基因序列内，那么含有序列的重组细胞可以通过标记基因功能的不存在加以鉴定。可替代地，标记基因可以与多肽编码序列串联置于单一启动子的控制下。响应诱导或选择的标记基因的表达通常也指示串联基因的表达。可替代地，含有且表达所需多核苷酸序列的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的多种程序加以鉴定。这些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，其包括基于膜、溶液或芯片的技术用于核酸或蛋白质的检测和/或定量。使用对于产物特异性的多克隆或单克隆抗体，用于检测且测量多核苷酸编码产物的表达的多种方案是本领域已知的。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。利用与给定多肽上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点、基于单克隆的免疫测定可以优选用于某些应用，但也可以采用竞争性结合测定。这些及其他测定在 Hampton 等人，Serological Methods, a Laboratory Manual(1990)和 Maddox 等人，7； Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)连同其他地方中描述。广泛多样的标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于多种核酸和氨基酸测定中。用于产生标记的杂交或PCR探针用于检测与多核苷酸相关的序列的方法包括寡核苷酸标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。可替代地，序列或其任何部分可以克隆到载体内用于产生mRNA探针。此类载体是本领域已知的，商购可得的，且可以通过加入合适的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和标记核苷酸用于在体外合成RNA探针。这些程序可以使用多种商购可得的试剂盒进行。可以使用的合适报道分子或标记包括放射性核素、酶、荧光、化学发光或生色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合于从细胞培养中表达和回收蛋白质的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白质可以是分泌或细胞内含有的，取决于使用的序列和/或载体。如本领域技术人员应理解的，含有多核苷酸的表达载体可以设计为含有信号序列，其指导编码的多肽通过原核或真核细胞膜的分泌。其他重组构建体可以用于将编码目的多肽的序列连接至编码多肽结构域的核苷酸序列，所述结构域促进可溶蛋白质的纯化。此类纯化促进结构域包括但不限于允许在固定金属上的纯化的金属螯合肽例如组氨酸-色氨酸分子，允许在固定的免疫球蛋白上的纯化的蛋白A结构域，和在FLAGS延伸/亲·和纯化系统(Immunex Corp. , Seattle, Wash.)中利用的结构域。在纯化结构域和编码的多肽之间包括可切割的接头序列，例如对于因子XA或肠激酶特异性的那些(InvitiOgen.San Diego，Calif.)，可以用于促进纯化。一种此类表达载体提供用于表达含有目的多肽和核酸(其编码在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前的6个组氨酸残基)的融合蛋白的表达。如Porath等人Exp. Purif. 3:263-281 (1992)中所述的,组氨酸残基促进在IMIAC (固定金属离子亲和层析)上的纯化，而肠激酶切割位点提供用于从融合蛋白中纯化所需多肽的工具。含有融合蛋白的载体的讨论在Kroll等X，DNA Cell Biol. 12:441-453(1993))中提供。体内多核苷酸递送技术
在另外的实施方案中，将包含本发明的一种或多种多核苷酸的遗传构建体在体内引入细胞内。这可以使用多种或众所周知的方法中的任何来实现，所述方法中的几种在下文概述用于举例说明的目的。I.腺病毒
用于一种或多种核酸序列的体内递送的优选方法之一涉及腺病毒表达载体的使用。“腺病毒表达载体”意欲包括含有腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)表达已以有义或反义方向在其中克隆的多核苷酸。当然，在反义构建体的背景下，表达不要求合成基因产物。表达载体包含遗传改造形式的腺病毒。腺病毒一 36 kb、线性双链DNA病毒的遗传组织的了解允许用高达7 kb的外源序列代替大片腺病毒DNA(Grunhaus & Horwitz, 1992)。与逆转录病毒形成对比，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体方式复制，而无潜在遗传毒性。此外，腺病毒是结构稳定的，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒事实上可以感染所有上皮细胞，与其细胞周期阶段无关。到目前为止，腺病毒感染看起来仅与轻度疾病例如人中的急性呼吸疾病关联。由于其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、宽靶细胞范围和高传染性，腺病毒特别适合于用作基因转移载体。病毒基因组的两个末端含有100-200碱基对反向重复(ITRs)，其是病毒DNA复制和包装所需的顺式元件。基因组的早(E)和晚期(L)区域含有通过病毒DNA复制的发作分开的不同转录单位。El区(ElA和ElB)编码负责病毒基因组和少数细胞基因的转录调节的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质合成。这些蛋白质涉及DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因的产物，包括大多数病毒衣壳蛋白质，仅在由主要晚期启动子(MLP)产生的单一初级转录物的显著加工后表达。MLP (位于16. 8 m.u.)在感染晚期是特别有效的，并且由这种启动子产生的所有mRNA都具有5’三联前导(TPL)序列，这使得其成为用于翻译的优选mRNA。在目前系统中，重组腺病毒由穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组生成。由于在两个原病毒载体之间的可能重组，野生型腺病毒可以由这个过程生成。因此，关键的是从个别噬斑中分离病毒的单个克隆且检查其基因组结构。其为复制缺陷的目前腺病毒载体的生成和增殖取决于独特的辅助细胞系，指定为293，其通过Ad5 DNA片段由人胚胎肾细胞转化，并且组成性表达El蛋白质(Graham等人，1977)。因为E3区对于腺病毒基因组是可有可无的(Jones & Shenk，1978)，所以在293细 胞的帮助下，目前腺病毒载体携带在El、D3或两个区域中的外源DNA (Graham & Prevec,1991)。在自然界中，腺病毒可以包装约105%的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等人，1987)，提供关于额外约2 kB DNA的容量。与在El和E3区中可替换的约5. 5 kB DNA组合，目前腺病毒载体的最大容量在7. 5 kB以下,或载体总长的约15%。超过80%的腺病毒病毒基因组保留在病毒主链中，并且是载体传播的(vector-borne)细胞毒性的来源。此外，El缺失的病毒的复制效率是不完全的。例如，对于目前可用载体在高感染复数(MOI)下已观察到病毒基因表达的渗漏(Mulligan，1993)。辅助细胞系可以衍生自人细胞例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质或上皮细胞。可替代地，辅助细胞可以衍生自其他哺乳动物物种的细胞，其对于人腺病毒是许可的。此类细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，目前优选的辅助细胞系是293。Racher等人(1995)已公开了用于培养293细胞且增殖腺病毒的改良方法。在一种形式中，天然细胞团块通过将个别细胞接种到含有100-200 ml培养基的I升硅化处理的旋转烧瓶(Techne, Cambridge, UK)内生长。在40 rpm下搅拌后,用台盼蓝估计细胞生存。在另一种形式中，如下采用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/1)。将重悬浮于5 ml培养基中的细胞接种物加入250 ml锥形瓶中的载体(50 ml)且静置，伴随偶然搅动，共I - 4小时。随后将培养基替换为50 ml新鲜培养基且起始震荡。对于病毒生产，允许细胞生长至约80%汇合，在这个时间后替换培养基(至25%的最终体积)，并且将腺病毒以MOI O. 05加入。将培养物静置过夜，这之后将体积增至100%且开始震荡另外72小时。除腺病毒载体是复制缺陷或至少有条件缺陷的要求外，腺病毒载体的性质被认为对于本发明的成功实践是关键的。腺病毒可以是42种不同已知血清型或亚组A-F中的任何。亚组C的腺病毒类型5是优选原材料，以便获得用于在本发明中使用的条件复制缺陷的腺病毒载体，因为腺病毒5型是人腺病毒,关于其的大量生物化学和遗传信息是已知的，并且它已在历史上用于采用腺病毒作为载体的大多数构建。如上所述，根据本发明的一般载体是复制缺陷的并且没有腺病毒El区。因此，在从其中已去除El编码序列的位置上引入编码目的基因的多核苷酸将是最方便的。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本发明不是关键的。编码目的基因的多核苷酸也可以插入代替如由Karlsson等人(1986)描述的El替换载体中缺失的E3区，或其中辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区。
腺病毒易于生长和操作并且显示出在体外和体内广泛的宿主范围。这组病毒可以以高滴度获得，例如IO9-IO11噬斑形成单位/ml，并且它们是高度传染性的。腺病毒的生活周期不要求整合到宿主细胞基因组内。由腺病毒载体递送的外源基因是附加型的，并且因此对于宿主细胞具有低遗传毒性。在用野生型腺病毒接种疫苗的研究中未报道副作用(Couch等人，1963 ;Top等人，1971 )，证实其作为体内基因转移载体的安全和治疗潜力。腺病毒载体已用于原核基因表达(Levrero等人，1991 ;Gomez_Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus & Horwitz, 1992 ；Graham & Prevec, 1992)中。近来，动物研究暗不重组腺病毒可以用于基因治疗(Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991 ；Stratford-Perricaudet等人，1990 ;Rich等人，1993)。在对不同组织施用重组腺病毒中的研究包括气管滴注(Rosenfeld等人，1991 ；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、夕卜周静脉内注射(Herz & Gerard, 1993)和立体定向输注到脑内(Le Gal LaSalle 等人，1993)。腺病毒载体可以源于人腺病毒。可替代地，它们可以源于其他物种例如黑猩猩的腺病毒，其可以具有病毒载体不被抗体中和的优点，所述抗体针对在许多人受试者中循环的人腺病毒(参见例如Tatsis N 等人 Gene Therapy 2006 13:421-429)。其是相对罕见的且因此存在对于载体自身的低水平预存免疫的腺病毒类型35，已用作正在开发的特定结核疫苗中的递送系统(参见例如，Radosevic等人andImmunity 2007 75 (8):4105_4115)。腺病毒类型35还可以作为递送载体在本发明中具有特定价值。2.逆转录病毒
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于在受感染细胞中通过逆转录过程将其RNA转化为双链DNA的能力(Coffin，1990)。所得到的DNA随后作为原病毒稳定整合到细胞染色体内，并且指导病毒蛋白质的合成。整合导致病毒基因序列在受体细胞及其后代中的保留。逆转录病毒基因组含有3种基因，gag、pol和env，其分别编码衣壳蛋白质、聚合酶和包膜组分。由gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装成病毒的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5’和3’末端。这些含有强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组内所需的(Coffin，1990)。为了构建逆转录病毒载体，将编码一种或多种目的寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸插入病毒基因组内，代替特定病毒序列，以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建含有gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当含有cDNA的重组质粒连同逆转录病毒LTR和包装序列一起引入这种细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，其随后分泌到培养基内(Nicolas & Rubenstein, 1988 ；Temin, 1986 ；Mann 等人，1983)。随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩且用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多样的细胞类型。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。基于通过乳糖残基对于病毒包膜的化学添加的逆转录病毒化学修饰，近期开发了设计为允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新方法。这种修饰可以允许肝细胞经由唾液酸糖蛋白受体的特异性感染。设计重组逆转录病毒的靶向的不同方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特异性细胞受体的生物素化抗体。抗体通过使用链霉抗生物素蛋白经由生物素组分偶联(Roux等人，1989)。使用针对主要组织相容性复合物I和II类抗原的抗体，他们证实具有其表面抗原的多种人细胞在体外由同向性病毒的感染(Roux等人，1989)。3.腺伴随病毒
AAVCRidgeway, 1988 ；Hermonat & Muzycska, 1984)是作为腺病毒原种的污染发现的微小病毒(parovirus)。它是未与任何疾病关联的遍在病毒(抗体存在于85%的美国人口中)。它也分类为依赖病毒，因为它的复制依赖于辅助病毒例如腺病毒的存在。五个血清型已得到分离，其中AAV-2是最佳表征的。AAV具有单链线性DNA，其壳体化为衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3,以形成直径20 - 24 nm的二十面体病毒粒子(Muzyczka & McLaughlin, 1988)。
AAV DNA长约4. 7千碱基。它含有两个开放读码框且侧面为两个ITRs。存在AAV基因组中的两种主要基因-.r印和cap。r印基因编码负责病毒复制的蛋白质，而ca/7编码衣壳蛋白质VP1-3。每个ITR构成T形发夹结构。这些末端重复是用于染色体整合的AAV的唯一必需顺式组分。因此，AAV可以用作载体，其中所有病毒编码序列被去除且替换为用于递送的基因盒。已鉴定了三种病毒启动子且根据其图位命名为P5、pl9和p40。来自p5和pl9的转录导致rep蛋白质的产生,并且来自p40的转录产生衣壳蛋白质(Hermonat &Muzyczka,1984)。存在促使研究者研究使用rAAV作为表达载体的可能性的几个因素。一个是递送基因以整合到宿主染色体内的要求令人惊讶地少。它必须具有145-bp ITRs，其为仅6%的AAV基因组。这留下载体装配4.5-kb DNA插入片段的余地。虽然这个携带容量可能阻止AAV递送大基因，但它充分适合于递送反义构建体。由于其安全性，AAV也是用于递送媒介物的良好选择。存在相对复杂的援救机制不仅需要野生型腺病毒还需要AAV基因以动员rAAV。同样地，AAV不是病原性的且与任何疾病无关。病毒编码序列的去除使针对病毒基因表达的免疫反应降到最低，并且因此rAAV不诱发炎症应答。4.作为表达构建体的其他病毒载体
其他病毒载体可以用作本发明中的表达构建体用于将寡核苷酸或多核苷酸序列递送至宿主细胞。可以采用衍生自病毒例如痘苗病毒(Ridgeway, 1988 ;Coupar等人，1988)、慢病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒的载体。其他痘病毒衍生的载体例如禽痘衍生的载体也可以预期是有用的。它们提供用于不同哺乳动物细胞的几个有吸引力的特征(Friedmann，1989 ；Ridgeway, 1988 ；Coupar 等人，1988 ;Horwich 等人，1990)。伴随缺陷型乙型肝炎病毒的近期识别，获得不同病毒序列的结构功能关系的新了解。体外研究显示病毒可以保留辅助者依赖性包装和逆转录的能力，尽管高达80%其基因组的缺失(Horwich等人，1990)。这暗示大部分基因组可以替换为外源遗传材料。嗜肝性和持续性(整合)是关于肝导向基因转移的特别有吸引力的性质。Chang等人(1991)将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因引入鸭乙型肝炎病毒基因组内，代替聚合酶、表面和前表面(pre-surface)编码序列。它与野生型病毒共转染到禽肝瘤细胞系内。含有高滴度重组病毒的培养基用于感染原代小鸭肝细胞。在转染后至少24小时检测到稳定CAT基因表达(Chang 等人，1991)。另外的‘病毒’载体包括病毒样颗粒(VLPs)和噬菌体。5.非病毒载体
为了实现本发明的寡核苷酸或多核苷酸序列的表达，必须将表达构建体递送到细胞内。这种递送可以在体外如在用于转化细胞系的实验室程序中，或在体内或离体如在特定疾病状态的治疗中完成。如上所述，用于递送的一种优选机制是经由病毒感染，其中将表达构建体封入感染性病毒颗粒中。表达构建体一递送到细胞内，编码所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸就可以在不同位点放置且表达。在特定实施方案中，编码构建体的核酸可以稳定整合到细胞的基因 组内。这种整合可以经由同源重组在特定位置和方向中(基因替换)，或它可以在随机、非特异性位置中整合(基因增强)。在再进一步的实施方案中，核酸可以在细胞中作为DNA的分开的附加型区段稳定维持。此类核酸区段或“附加体”编码足以允许维持和复制的序列，不依赖于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步。表达构建体如何递送至细胞并且核酸保留在细胞中何处取决于采用的表达构建体的类型。在本发明的特定实施方案中，包含一种或多种寡核苷酸或多核苷酸序列的表达构建体可以简单地由裸露重组DNA或质粒组成。构建体的转移可以例如通过物理或化学上渗透化处理细胞膜的任何方法执行。这可特别应用于体外转移，但它也可以应用于体内用途。Dubensky等人(1984)将以磷酸钙沉淀物形式的多瘤病毒DNA成功注射到成年和新生儿小鼠的肝和脾内，证实活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty & Reshef (1986)也证实磷酸钙沉淀的质粒的直接腹膜内注射导致转染基因的表达。设想编码目的基因的DNA也可以以相似方式在体内转移且表达基因产物。用于将裸露DNA表达构建体转移到细胞内的本发明的另一个实施方案可以涉及粒子轰击。这种方法取决于将DNA包被的微粒加速至高速的能力，允许它们刺穿细胞膜且进入细胞内而不杀死细胞(Klein等人，1987)。用于加速小粒子的几种装置已得到开发。一种此类装置依赖高压放电以生成电流，这又提供了原动力(Yang等人，1990)。使用的微粒已由生物学惰性的物质例如钨或金珠组成。所选器官包括大鼠和小鼠的肝、皮肤和肌肉组织已在体内轰击(Yang等人，1990 ；Zelenin等人，1991)。这可能要求组织或细胞的手术暴露，以消除在枪和靶器官之间的任何介入组织，即离体处理。再次，编码特定基因的DNA可以经由这种方法递送且仍是掺入的。细菌也可以用作递送方法(例如李斯特菌，参见W02004/11048)且特别是BCG。多肽组合物
多肽可以使用多种众所周知技术中的任何进行制备。使用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任何，可以容易地由DNA序列制备由如上所述的DNA序列编码的重组多肽。表达可以在任何合适的宿主细胞中达到，所述宿主细胞已用含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞，例如哺乳动物细胞和植物细胞。优选地，采用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系例如COS或CH0。来自将重组蛋白质或多肽分泌到培养基内的合适宿主/载体系统的上清液可以首先使用商购可得的滤器浓缩。在浓缩后，可以将浓缩物应用于合适的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂。最后，可以采用一个或多个反相HPLC步骤，以进一步纯化重组多肽。较短的多肽也可以通过合成方法生成，使用本领域普通技术人员众所周知的技术。例如，此类多肽可以使用商购可得的固相技术中的任何合成，例如Merrifield固相合成法，其中将氨基酸序贯加入生长中的氨基酸链。参见Merrifield, J Am. Chem. Soc.85:2149-2146 (1963)。用于多肽的自动化合成的设备是从供应商例如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City,CA)商购可得的，并且可以根据制造商的说明书进行操作。在特定特异性实施方案内，多肽可以是融合蛋白，其包含如本文描述的多重经修饰的Rv3616c蛋白质，或包含如本文描述的至少一种经修饰的Rv3616c蛋白质和无关序列例如上文(i)_ (xvi)和(a) - (g)中所述的那些。
融合配偶体可以例如帮助提供T辅助表位(免疫学融合配偶体)，优选由人识别的T辅助表位，或可以帮助以比天然重组蛋白质更高的得率表达蛋白质(表达增强物)。特定优选融合配偶体是免疫学和表达增强融合配偶体。其他融合配偶体可以这样加以选择，以便增加蛋白质的可溶性或使得蛋白质能够靶向所需细胞内区室。再进一步的融合配偶体包括亲和标记物，其促进蛋白质的纯化。融合蛋白一般可以使用标准技术包括化学缀合进行制备。优选地，融合蛋白在表达系统中作为重组蛋白质表达，允许相对于非融合蛋白增加水平的产生。简言之，编码多肽组分的DNA序列可以分开装配，且连接到合适的表达载体内。编码一种多肽组分的DNA序列的3’末端连同或不连同肽接头连接至编码第二种多肽组分的DNA序列的5’末端，从而使得序列的读码框是同相的。这允许翻译成保留两种组分多肽的生物学活性的单一融合蛋白。肽接头序列可以用于将融合配偶体分离足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构的距离。使用本领域众所周知的标准技术，将此类肽接头序列掺入融合蛋白内。合适的肽接头序列可以基于下述因素进行选择(1)其采取弹性延伸构象的能力；(2)其不能采取可以与在第一种和第二种多肽上的功能表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与多妝功能表位反应的疏水或荷电残基。优选的妝接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其他附近的中性氨基酸例如Thr和Ala也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括公开于 Maratea 等)\，Gene 40:39-46 (1985) ；Murphy 等人，Natl. AcacI.Sci. USA 83:8258-8262 (1986);美国专利号 4，935，233 和美国专利号 4，751，180 中的那些。接头序列一般可以是长度I -约50个氨基酸。当第一种和第二种多肽具有非必需N末端氨基酸区域时，其可以用于分离功能结构域且阻止立体阻碍，接头序列是不需要的。在优选实施方案内，免疫学融合配偶体衍生自蛋白D，革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌{Haemophilus influenza )B的表面蛋白质(WO 91/18926)。优选地,蛋白D衍生物包含该蛋白质的约前三分之一(例如N末端前100-110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以是脂化的。在特定优选实施方案内，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包括在N末端上，以提供具有另外的外源T细胞表位的多肽且增加在大肠杆菌中的表达水平(从而充当表达增强物)。月旨质尾部确保抗原对于抗原呈递细胞的最佳呈递。其他融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白质，NSl (血凝素)。一般地，使用N末端81个氨基酸，尽管可以使用包括T辅助表位的不同片段。在另一个实施方案中，免疫学融合配偶体是称为LYTA的蛋白质或其部分(优选C末端部分)。LYTA衍生自肺炎链球菌{Streptococcus pneumoniae"),其合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；43:265-292 (1986))。LYTA是特异性降解肽聚糖主链中的特定键的自溶素。LYTA蛋白质的C末端结构域负责对于胆碱或某些胆碱类似物例如DEAE的亲和力。这种性质已用于开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基末端含有C-LYTA片段杂交蛋白质的纯化已得到描述(参见Biotechnology 10:795-798 (1992))。在一个优选实施方案内，LYTA的重复部分可以掺入融合蛋白内。重复部分在从残基178处开始的C末端区域中发现。特别优选的重复部分掺入残基188-305。药物组合物 在另外的实施方案中，本文公开的多核苷酸或多肽组合物可以单独或与一种或多种治疗模式组合，在药学可接受或生理学可接受的溶液中配制用于施用于细胞或动物。组合物可以以粉末形式(例如冷冻干燥的)存在用于在使用前不久重构，此类干燥组合物一般在贮存过程中是更稳定的。药物组合物可以包含与药学可接受的载体或赋形剂组合的融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸。还应理解需要时，表达如本文公开的多肽的核酸区段(例如RNA或DNA)也可以与其他试剂组合施用，例如其他蛋白质或多肽或多种药学活性剂，包括针对结核分枝杆菌感染有效的化学治疗剂。事实上，基本上不存在关于还可以包括的其他组分的限制，只要另外的试剂在与靶细胞或宿主组织接触后不引起显著的不良反应。组合物因此可以连同如特定情况下需要的多种其他试剂一起递送。此类组合物可以从宿主细胞或其他生物学来源纯化，或可替代地可以是如本文描述的化学合成的。同样地，此类组合物可以进一步包含取代或衍生的RNA或DNA组合物。药学可接受的赋形剂或载体溶液的配制是本领域技术人员众所周知的，如关于在多种治疗方案中使用本文描述的特定组合物的合适给药和治疗方案的发展一样，所述治疗方案包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内和肌内施用和制剂。其他施用途径包括经由粘膜表面。一般地，包含治疗有效量的制剂递送约O. 01 Ug -约1000 Ug经修饰的Rv3616c多肽/施用，更一般地约O. I Ug -约100 Ug多肽/施用(约O. 5 - 50 ug)。在多核苷酸组合物的方面，它们一般递送约10 ug -约20 ug本发明的多核苷酸/施用，更一般地O. Img -约10 mg本发明的多核苷酸/施用。天然地，在每种治疗上有用的组合物中一种或多种活性化合物的量可以以这样的方式制备，从而使得合适剂量将在化合物的任何给定单位剂量中获得。因素例如可溶性、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产物贮存期限以及其他药理学考虑将由制备此类药物制剂领域的技术人员加以考虑，并且像这样，多种剂量和治疗方案可以是希望的。I. 口服递送
在特定应用中，本文公开的药物组合物可以经由口服施用递送至动物。像这样，这些组合物可以用惰性稀释剂或可同化(assimilable)的食用载体配制，或它们可以封入硬或软壳明胶胶囊中，或它们可以压缩成片剂，或它们可以直接与饮食的食物一起掺入。活性化合物甚至可以与赋形剂一起掺入，且以可摄取的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖衆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用(Mathiowitz等人，1997 ;Hwang等人，1998 ;美国专利号5，641，515 ;美国专利号5，580，579和美国专利号5，792，451，其各自特别整体引入本文作为参考)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下述粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味料。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，它还可以含有液体载体。多种其他材料可以作为包衣存在或在其他方面修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫草茸、糖或两者包被。酏剂的糖浆剂可以含有活性组分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味料，例如樱桃或橙调味料。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应是药学纯的且以采用的量是基本上无毒的。此外，活性组分可以掺入持续释放制备物和制剂内。对于口服施用，本发明的组合物可以可替代地与一种或多种赋形剂一起掺入，其 形式为漱口水、牙粉、颊含片、口腔喷雾剂或舌下口服施用制剂。例如，在合适溶剂例如硼酸钠溶液(Dobell’ s Solution)中掺入以所需量的活性成分可以制备漱口水。可替代地，活性成分可以掺入口服溶液例如含有硼酸钠、丙三醇和碳酸氢钾的那种内，或分散在牙粉中，或以治疗有效量加入组合物中，所述组合物可以包括水、粘合剂、磨料、调味剂、发泡剂和湿润剂。可替代地，组合物可以塑造成片剂或溶液形式，其可以置于舌下或以其他方式溶解于口中。Σ注射递送
一般而言，如美国专利号5，543，158 ;美国专利号5，641，515和美国专利号5，399，363中所述的(各自特别整体引入本文作为参考)，可以希望肠胃外、静脉内、肌内、皮内或甚至腹膜内递送本文公开的药物组合物。作为游离碱或药理学可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合的水中进行制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通贮存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂，以阻止微生物的生长。适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备(美国专利号5，466，468，特别整体引入本文作为参考)。在所有情况下，形式必须是无菌是且必须流动至存在容易注射性的程度。它在制造和贮存条件下必须是稳定的，且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染动作进行保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和/或植物油。合适流动性可以例如通过下述得到维持包衣例如卵磷脂的使用、在分散体的情况下所需粒子大小的维持和表面活性剂的使用。微生物动作的预防可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂得到促进，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，可以优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液应在需要时适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖致使等渗。这些特定水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此而论，根据本公开内容，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，一个剂量可以溶解于I ml等渗NaCl溶液中，并且或者加入1000 ml皮下输注液或者在提议的输注部位注射(参见例如，Remington，s Pharmaceutical Sciences, 15thEdition，第1035-1038和1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的状况，剂量中的某些变动将必然发生。在任何情况下，负责施用的个人决定用于个别受试者的合适剂量。此外，对于人施用，制备物应符合无菌性、致热原性以及如由FDA Office of Biologies标准要求的一般安全和纯度标准。需要时，通过将活性化合物以所需量与多种上文列举的其他成分一起掺入合适溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般地，通过将多种已灭菌的活性成分掺入无菌媒介物内制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和 冷冻干燥技术，其获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。本文公开的组合物可以以中性或盐形式配制。药学可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，其由无机酸例如盐酸或磷酸，或此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，和此类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和以如治疗上有效的此类量施用。制剂以多种剂型例如可注射溶液、药物释放胶囊等容易地施用。如本文使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物(vehicle)、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬液、胶体等。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物内。短语“药学可接受的”指分子实体和组合物，当施用于人时，其不产生变应性或类似不利反应。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域充分了解的。一般地，此类组合物制备为注射物，作为液体溶液或悬液；还可以制备适合于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制备物还可以是乳化的。3.鼻和颊递送
在特定实施方案中，药物组合物可以通过鼻内喷雾剂、颊喷雾剂、吸入剂和/或其他气溶胶递送媒介物进行递送。例如经由鼻和颊气溶胶喷雾剂用于将基因、核酸和肽组合物直接递送至肺的方法已例如在美国专利号5，756，353和美国专利号5，804，212 (各自特别整体引入本文作为参考)中描述。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利号5，725，871，特别整体引入本文作为参考)的药物递送也是药学领域众所周知的。同样地，以聚四氟乙烯支持基质形式的经粘膜药物递送在美国专利号5，780, 045中描述(特别整体引入本文作为参考)。4.脂质体、纳米胶囊和微粒介导的递送
在特定实施方案中，本发明人考虑了使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球体、脂质颗粒、媒介物等用于将本发明的组合物引入合适宿主细胞内。特别地，本发明的组合物可以配制用于递送脂质封装颗粒、脂质体、媒介物、纳米球或纳米颗粒等中。此类制剂可以优选用于引入本文公开的核酸或构建体的药学可接受的制剂。脂质体的形成和使用是本领域技术人员一般已知的(参见例如，Couvreur等人,1977 ；Couvreur, 1988 ；Lasic, 1998 ;其描述了脂质体和纳米胶囊在用于细胞内细菌感染和疾病的靶向抗生素治疗中的用途)。近来，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(Gabizon & Papahadjopoulos, 1988 ;Allen 和 Choun, 1987 ;美国专利号 5，741，516,特别整体引入本文作为参考)。进一步地，脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的多种方法已得到综述(Takakura，1998 ；Chandran 等人，1997 ；Margalit, 1995 ;美国专利号 5，567，434 ；美国专利号5，552，157 ;美国专利号5，565，213 ;美国专利号5，738, 868和美国专利号5，795，587，各自特别整体引入本文作为参考)。脂质体已对于许多细胞类型成功使用，所述细胞类型通常对通过其他程序的转染是有抵抗力的，包括T细胞悬液、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等人，1990 ；Muller等人，1990)。此外，脂质体不含基于病毒的递送系统一般的DNA长度约束。脂质 体已有效用于将基因、药物(Heath & Martin, 1986 ；Heath等人，1986 ;Balazsovits等人，1989 ;Fresta & Puglisi, 1996)、放射治疗剂(Pikul 等人，1987)、酶(Imaizumi 等人，1990a ；Imaizumi 等人，1990b)、病毒(Faller & Baltimore, 1984)、转录因子和变构效应物(Nicolau & Gersonde，1979)引入多种培养的细胞系和动物内。此外，检查脂质体介导的药物递送的有效性的几个成功的临床试验已完成(Lopez-Berestein等人，1985a ； 1985b ；Coune, 1988 ；Sculier等人，1988)。此外,几个研究暗示脂质体的使用与在全身递送后的自身免疫应答、毒性或性腺局限性无关(Mori & Fukatsu, 1992)ο脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成且自发形成多室同心双层囊泡(也称为多室囊泡(MLVs)。MLVs —般具有25 nm - 4 μ m的直径。MLVs的超声处理导致形成在核心中含有水溶液，具有在200 - 500 A范围中的直径的小单室囊泡(SUVs)。脂质体具有与细胞膜的相似性并且考虑用于与本发明结合作为用于肽组合物的载体使用。它们是广泛适合的，因为可以诱陷水和脂溶性物质，即分别在水间隙中和在双层自身内。具有药物的脂质体甚至可以通过选择性修饰脂质体制剂用于活性剂的位点特异性递送是可能的。除Couvreur等人(1977 ；1988)的教导外，下述信息也可以用于生成脂质体制剂。当在水中分散时，取决于脂质与水的摩尔比，磷脂可以形成除脂质体外的多种结构。在低比率时，脂质体是优选结构。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体可以显示对于离子和极性物质的低渗透性，但在升高温度经历相变，这显著改变其渗透性。相变涉及从称为凝胶状态的紧密包装的有序结构到称为流体状态的松散包装的较不有序结构的变化。这在特征性相变温度发生且导致对于离子、糖和药物的渗透性中的增加。除温度外，暴露于蛋白质可以改变脂质体的渗透性。特定可溶蛋白质例如细胞色素c结合，变形且渗透双层，从而引起渗透性中的变化。胆固醇表面上通过更紧密地包装磷脂来抑制蛋白质的这种渗透。考虑用于抗生素和抑制剂递送的最有用的脂质体制剂将含有胆固醇。捕获溶质的能力在不同类型的脂质体之间变化。例如，MLVs在捕获溶质方面是中等有效的，但SUVs是极度无效的。然而，SUVs提供在大小分布中的同质性和重现性的优点，并且在大小和捕获效率之间的折衷通过大单室囊泡(LUVs)提供。这些通过乙醚蒸发制备并且在溶质诱陷方面比MLVs更有效三到四倍。除脂质体特征外，在诱陷化合物中的重要决定因素是化合物自身的物理化学性质。极性化合物被捕获到水间隙中，并且非极性化合物结合囊泡的脂质双层。极性化合物通过渗透或当双层破坏时释放，但非极性化合物保持附着至双层，除非它通过温度或暴露于脂蛋白被破坏。两个类型都显示在相变温度的最大限度流出率。脂质体经由四种不同机制与细胞相互作用通过网状内皮系统的吞噬细胞例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的胞吞作用；通过非特异性弱疏水或静电力，或通过与细胞表面组分的特异性相互作用吸附至细胞表面；通过脂质体的脂质双层插入质膜内与浆细胞膜融合，伴随脂质体内容物同时释放到细胞质内；和通过脂质体脂质转移至细胞或亚细胞膜，或反之亦然，而无脂质体内容物的任何结合。通常难以确定哪种机制是有效的并且超过一种可以是同时有效的。
静脉内注射的脂质体的命运和处置取决于其物理性质，例如大小、流动性和表面电荷。它们可以在组织中持续小时或数天，取决于其组成和在血液中范围从分钟到数小时的半衰期。更大的脂质体例如MLVs和LUVs由网状内皮系统的吞噬细胞快速吸收，但循环系统的生理学限制此类大种类在大多数部位的离开。它们仅可以存在于其中大开口或孔存在于毛细血管内皮的位置中，例如肝或脾的窦。因此，这些器官是占优势的摄取部位。另一方面，SUVs显示更广泛的组织分布但仍是在肝和脾中高度隔离的。一般而言，这种体内行为限制脂质体仅潜在靶向对其大尺寸可接近的那些器官和组织。这些包括血液、肝、脾、骨髓和淋巴样器官。依据本发明靶向一般不是限制。然而，如果需要特异性靶向，那么用于完成这点的方法是可获得的。抗体可以用于结合脂质体表面且将抗体及其药物内容物导向位于特定细胞类型表面上的特异性抗原受体。碳水化合物决定簇(在细胞-细胞识别、相互作用和粘附中起作用的糖蛋白或糖脂细胞表面组分)也可以用作识别位点，因为它们在将脂质体导向特定细胞类型中具有潜力。主要地，考虑会使用脂质体制备物的静脉内注射，但其他施用途径也是可以想到的。可替代地，本发明提供了本发明的组合物的药学可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊一般可以以稳定和重现性方式诱陷化合物(Henry-Michelland等人，1987 ；Quintanar-Guerrero等人，1998 ;Douglas等人，1987)。为了避免由于细胞内聚合过载的副作用，此类超微颗粒(大小约O. I μ m)应使用能够在体内降解的聚合物进行设计。符合这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷酯纳米颗粒考虑用于在本发明中使用。此类颗粒可以是容易制备的，如所述的(Couvreur等人，1980 ;1988 ;zur Muhlen等人，1998 ;Zambaux等人1998 ；Pinto-Alphandry等人，1995和美国专利号5，145，684，特别整体引入本文作为参考)。皮肤贴剂也可以用于经皮递送。免疫原性组合物
在本发明的特定实施方案中，提供了免疫原性组合物。免疫原性组合物将包含与免疫刺激剂组合的一种或多种经修饰的Rv3616c序列(多肽或多核苷酸)，如上文讨论的那些。免疫原性组合物还可以包含与药学可接受的载体或赋形剂组合的、融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸。免疫刺激剂可以是增强或加强对于外源性抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫刺激剂的例子包括佐剂。免疫原性组合物的制备一般在例如Powell & Newman,编辑，Kaccifle(亚基和佐剂法)(1995)中描述。在本发明的范围内的药物组合物和免疫原性组合物还可以含有其他化合物，其可以是生物学活性或失活的。例如，在药物或免疫原性组合物内可以存在掺入融合多肽内或作为分开组分的、其他结核分枝杆菌抗原的一个或多个免疫原性部分。举例说明性免疫原性组合物可以含有编码如上所述的一种或多种多肽的多核苷酸(例如DNA)，从而使得多肽原位生成(从而诱发免疫应答)。如上所述，DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统的任何内，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系
统。众多基因递送技术是本领域众所周知的，例如由Rolland, Crit. Rev. Therap. DrugCarrier Systems 15:143-198 (1998)和其中引用的参考文献描述的那些。合适的核酸表达系统含有用于在患者中表达的必需DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及表达多肽(例如在其细胞表面上或分泌多肽)的细菌宿主细胞(例如，分枝杆菌属、芽孢杆菌属QBaci I Ius)或乳杆菌属ilactobaci I Ills')菌株,包括卡介苗或乳酸乳杆菌iLactococcus Jacii1S))的施用(参见例如，Ferreira,等人，如 Acad Bras Cienc (2005)77:113-124 ;和 Raha,等人，為吵7 Microbiol Biotechnol (2005)PubMedID 15635459)。在一个优选实施方案中，DNA可以使用病毒表达系统(例如痘苗或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入，其可以涉及非致病性(缺陷的)、具有复制能力的病毒的使用。合适的系统公开于例如 Fisher-Hoch 等人Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321 (1989)；Flexner等人,Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103( 1989);Flexner 等人，8:17-21 (1990);美国专利号 4，603，112,4, 769，330 和 5，017，487 ；W0 89/01973 ;美国专利号 4，777，127 ；GB 2, 200, 651 ；EP O, 345, 242 ；W0 91/02805 -,^erkner,Biotechniques 6:616-627 (1988)；Rosenfeld 等k，Science 252:431-434( 1991)；Kolls 等人Natl. Acad. Sci. USA91:215-219 (1994) ；Kass-Eisler 等人，Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502(1993) ；Guzman 等Circulation 88:2838-2848 (1993);和 Guzman 等人，CYr. Res.73:1202-1207( 1993)中。用于将DNA掺入此类表达系统内的技术是本领域普通技术人员众所周知的。DNA还可以是“裸露的”，如例如在Ulmer等k，Science 259:1745-1749 (1993)中描述且由Cohen，259:1691-1692 (1993)综述的。裸露DNA的摄取可以通过将DNA包被到生物可降解的珠上得到增加，所述生物可降解的珠有效转运到细胞内。显而易见的是免疫原性组合物可以包含多核苷酸和多肽组分。此类免疫原性组合物可以提供增强的免疫应答。显而易见的是免疫原性组合物可以含有本文提供的多核苷酸和多肽的药学可接受的盐。此类盐可以由药学可接受的无毒碱制备，包括有机碱(例如伯、仲和叔胺以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。虽然本领域普通技术人员已知的任何合适载体可以用于本发明的免疫原性组合物中，但载体的类型将取决于施用模式而改变。本发明的组合物可以配制用于任何合适的施用方式，包括例如局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内施用。对于腹膜内施用，例如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可以采用上述载体或固体载体中的任何，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的微球体(例如聚乳酸酯聚羟乙酸酯)也可以用作用于本发明的药物组合物的载体。合适的生物可降解的微球体公开于例如美国专利号 4，897，268 ;5，075，109 ;5，928，647 ;5，811，128 ;5，820，883 ;5，853，763 ;5，814，344 和5，942，252中。还可以采用包含美国专利号5，928，647中所述的微粒-蛋白质复合物的载体，其能够在宿主中诱导I类限制性细胞毒性T淋巴细胞应答。此类组合物还可以包含缓冲剂(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)，碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白质，多肽或氨基酸例如甘氨酸，抗氧化剂，抑菌剂，螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽，佐剂(例如氢氧化铝)，致使制剂与接受者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质，悬浮剂，增稠剂和/或防腐剂。可替代地，本发明的组合物可以配制为冻干产物。化合物还可以使用众所周知的技术装入脂质体内。多种免疫刺激剂中的任何可以用于本发明的免疫原性组合物中。例如，可以包括 佐剂。佐剂指在疫苗或治疗组合物中增加对于抗原的特异性免疫应答的组分(参见例如，Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992))。佐剂包括 Thl 型和 Th_2型应答的免疫应答。Thl型细胞因子(例如、IFN-Y、IL-2和IL-12)趋于支持对于所施用抗原的细胞介导的免疫应答的诱导，而Th-2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、I1-6、IL-10)趋于支持体液免疫应答的诱导。在本文提供的免疫原性组合物内，佐剂组合物优选设计为诱导占优势地具有Thl型的免疫应答。合适的佐剂组合物包括水包油乳状液。特别地，水包油乳状液包含O. 5 - 10 mg可代谢的油(例如角鲨烯)、0. 5 - 11 mg生育酚(例如α-生育酚)和O. I - 4 mg乳化剂(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)/人剂量。参见例如，在此引入作为参考的W02008/043774。可替代的佐剂包含以脂质体和脂多糖(例如3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A)形式存在的衍生自奎拉雅属阜树(Quillaja Saponaria Molina)树皮的免疫学活性阜苷级分(例如如US5，057, 540中所述的，称为QS21的HPLC纯化的级分)。这些组合物可以进一步包含固醇(例如胆固醇),例如其中皂苷固醇的比是1:1至1:100 w/w (例如皂苷固醇的比是1:1至1:10 w/w)0特别合适的是这样的佐剂，其中所述QS21和所述3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A以1:1 w/w的QS21:3D-MPL比存在，并且两者都以低于30 ug水平存在于人剂量中。此类佐剂组合物例如在此引入作为参考的W02007/068907和US2008279926中描述。其他有利的佐剂系统包括与脂多糖3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A结合的基于铝盐的那些。抗原和3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A可以共吸附至相同金属性盐颗粒或可以吸附至不同的金属性盐颗粒。参见例如，在此引入作为参考的W000/23105，US7357936和US20080226672A1，其描述了包含结合第一种金属性盐颗粒(特别是磷酸铝或氢氧化铝)的抗原和结合第二种金属性盐颗粒(特别是磷酸铝或氢氧化铝)的3-脱-O-乙酰化单磷酰脂质A的免疫原性组合物。本文提供的任何免疫原性组合物可以使用众所周知的方法进行制备，所述方法导致抗原、免疫应答增强剂和合适载体或赋形剂(需要时)的组合。多种递送媒介物中的任何可以在药物组合物和免疫原性组合物内采用，以促进抗原特异性免疫应答的产生。
递送媒介物包括抗原呈递细胞(APCs)，例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可以改造为有效APCs的其他细胞。此类细胞可以但无需是遗传修饰的，以增加用于呈递抗原的能力，以改善T细胞应答的激活和/或维持和/或与接受者是免疫学相容的(即匹配的HLA单倍型)。APCs—般可以从多种生物学流体和器官中分离，并且可以是自体、异基因、同基因或异种基因细胞。本发明的特定实施方案使用树突细胞或其祖先作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的 APCs (Banchereau & Steinmanjaiare 392:245-251 (1998))，并且已显示作为用于诱发预防或治疗免疫的生理学佐剂是有效的(参见Timmerman & Leyy,Ann. Rev. Med.50:507-529(1999))。一般而言，树突细胞可以基于下述进行鉴定其一般形状(原位星形，具有在体外可见的显著胞质突(树突))，其以高效率吸收、加工且呈递抗原的能力，及其激活幼稚T细胞应答的能力。当然，树突细胞可以改造为表达特异性细胞表面受体或配体，其通常在体内或离体的树突细胞上未发现，并且此类经修饰的树突细胞由本发明加以考虑。作为树突细胞的替代物，分泌囊泡抗原装载的树突细胞(称为外来体)可以在免疫原性组合 物内使用(参见 Zitvogel 等k，Nature Med. 4:594-600 (1998))。树突细胞和祖先可以得自外周血、骨髓、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其他合适的组织或流体。例如，通过将细胞因子例如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNF α的组合加入从外周血中收获的单核细胞的培养物，树突细胞可以离体进行分化。可替代地，通过将GM-CSF, IL-3、TNF α、CD40配体、LPS、flt3配体和/或一种或多种其他化合物的组合加入培养基中，所述化合物诱导树突细胞的分化、成熟和增殖，从外周血、脐带血或骨髓中收获的CD34阳性细胞可以分化成树突细胞。树突细胞方便地分类为“未成熟”和“成熟”细胞，其允许区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，这种命名法不应解释为排除分化的所有可能的中间阶段。未成熟的树突细胞表征为对于抗原摄取和加工具有高能力的APC，这与Fe Y受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型一般特征在于这些标记的更低表达，但负责T细胞活化的细胞表面分子的高表达，例如I类和II类MHC、粘附分子(例如⑶54和⑶11)和共刺激分子(例如⑶40、CD80、CD86 和 4-1BB)。APCs —般用编码蛋白质的多核苷酸(或其部分或其他变体)转染，从而使得多肽在细胞表面上表达。此类转染可以离体发生，并且随后如本文描述的，可以使用包含此类转染细胞的药物组合物或免疫原性组合物。可替代地，靶向树突状或其他抗原呈递细胞的基因递送媒介物可以施用于患者，导致在体内发生的转染。使用本领域已知的任何方法，例如WO 97/24447 中所述的那些，或由Mahvi 等)\，Irmmnology and Cell Biology 75:456-460(1997)描述的基因枪方法，例如一般可以执行树突细胞的体内和离体转染。树突细胞的抗原装载可以通过使树突细胞或祖细胞与多肽、DNA (裸露的或在质粒载体内)或RNA —起；或与抗原表达重组细菌或病毒(例如痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒载体)一起温育来实现。在装载前，多肽可以共价缀合至提供T细胞帮助的免疫配偶体(例如载体分子)。可替代地，树突细胞可以分开或在多肽的存在下用非缀合的免疫配偶体进行脉冲。免疫原性组合物和药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿或小瓶中。此类容器优选是气密密封的，以保存制剂的无菌性直至使用时。一般而言，制剂可以作为在油或水性媒介物中的悬液、溶液或乳状液贮存。可替代地，免疫原性组合物或药物组合物可以贮存于冷冻干燥的条件中，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体。在某些实施方案中，经修饰的Rv3616c蛋白质(包括融合蛋白)或编码所述蛋白质的多核苷酸的“引发”或第一次施用随后为经修饰的Rv3616c蛋白质(包括融合蛋白)或编码所述蛋白质的多核苷酸的一次或多次“加强”或后续施用(“引发和加强”法)。例如，用经修饰的Rv3616c多肽(包括融合蛋白)或编码所述蛋白质的多核苷酸的第一次施用，随后为经修饰的Rv3616c多肽(包括融合蛋白)或编码所述多肽的多核苷酸的一次或多次后续施用。在一个实施方案中，用经修饰的Rv3616c蛋白质或多核苷酸的第一次施用随后为经修饰的Rv3616c蛋白质的一次或多次后续施用。在一个实施方案中，用经修饰的Rv3616c蛋白质或多核苷酸的第一次施用随后为经修饰的Rv3616c多核苷酸的一次或多次后续施用。通常，第一次或“引发”施用和第二次或“加强”施用相隔约2-12周或相隔高达4-6个月给予。后续“加强”施用相隔约6个月或相隔长达1、2、3、4或5年给予。常规加强治疗(例如蛋白质引发施用随后为蛋白质加强施用)也可以用于预防或治疗结核(例如预防或治疗潜伏性结核，特别是预防或延迟结核再活动)。 诊断学
在另一个方面，本发明提供了关于使用上文描述的一种或多种经修饰的Rv3616c蛋白质以诊断结核例如潜伏性结核的方法(例如使用常规形式的基于T细胞应答的测定或基于抗体的测定)。例如，提供了用于测定个体中的潜伏性结核分枝杆菌感染的方法，其包括
(a)从个体中获得样品；
(b)使所述样品与经修饰的Rv3616c蛋白质接触；
(c)定量样品应答。样品可以例如是全血或纯化细胞。适当地，样品将含有外周血单核细胞(PBMC)。在本发明的一个实施方案中，个体将是血清反应阳性的。在本发明的第二个实施方案中，个体将是血清反应阴性的。适当地，个体先前未针对结核分枝杆菌感染进行疫苗接种(例如适当地，个体先前未用BCG进行疫苗接种)。样品应答可以通过本领域技术人员已知的一系列方法进行定量，包括监控淋巴细胞增殖或特异性细胞因子或抗体的产生。例如，T细胞ELISP0T可以用于监控细胞因子例如干扰素Y (IFNY )、白细胞介素2 (IL2)和白细胞介素5 (IL5)。B细胞ELLISP0T可以用于监控结核分枝杆菌特异性抗原的刺激。细胞应答也可以通过使用细胞内或细胞外染色且通过流式细胞仪分析进行表征。定量样品增殖应答的方法包括
(i)用放射性标记(例如氘化胸苷)脉冲培养细胞且监控氘摄取(例如气体闪烁);
(ii)羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记和使用流式细胞术的细胞分裂的荧光监控。定量样品细胞因子应答特别包括监控干扰素Y生产。当使用此类定量法时，对于抗原的阳性应答可以通过至少2:1(例如至少3:1或至少5:1)的信噪比(S/N比)进行定义。
在本发明的一个进一步方面，提供了使用皮肤测试诊断潜伏性结核分枝杆菌感染的方法。如本文使用的，“皮肤测试”是直接对患者执行的任何测定，其中在如上所述的经修饰的Rv3616c蛋白质的皮内注射后测量迟发型超敏反应(DTH)反应(例如肿胀、红化或皮炎)。此类注射可以使用任何合适的装置来实现，所述装置足以使抗原组合与患者的皮肤细胞接触，例如结核菌素注射器或I mL注射器。反应在一段时间后进行测量，例如注射后至少48小时，尤其是48-72小时。DTH反应是细胞介导的免疫应答,其在先前已暴露于测试抗原的患者中更大。该应答可以使用尺子在视觉上进行测量。一般而言，直径大于约O. 5 cm尤其是直径大于约I. Ocm的应答是阳性应答，指示先前结核分枝杆菌感染，其可以表现为或不表现为活动性疾病。对于在皮肤测试中的使用，经修饰的Rv3616c蛋白质组分适当地配制为含有药学可接受的载体的药物组合物。适当地，在此类药物组合物中采用的载体是具有合适防腐剂例如苯酚和/或Tween 80 的盐水溶液。
本发明进一步提供了用于在上述诊断法中的任何内使用的试剂盒。此类试剂盒一般包含执行诊断测试所需的两种或更多种组分。组分可以是化合物、反应物、容器和/或设备。例如，在试剂盒内的一个容器可以含有经修饰的Rv3616c蛋白质。可以提供附着至载体材料的此类蛋白质。此类试剂盒还可以含有检测试剂，其含有适合于直接或间接检测抗体结合的报道基团。其他诊断试剂盒包括设计用于检测细胞介导的应答的那些(其可以例如在本发明的诊断法中使用)。此类试剂盒一般包含
(i)用于从受试者中获得合适细胞样品的仪器；
(ii)用于由Rv3616c多肽(或其变体、免疫原性片段或编码此类多肽的DNA)刺激所述细胞样品的装置；
(iii)用于检测或定量对于刺激的细胞应答的装置。用于定量细胞应答的合适装置包括B细胞ELISP0T试剂盒或可替代地T细胞ELISP0T试剂盒，其是本领域技术人员已知的。一种可能的试剂盒包含
(a)本发明的多肽；和
(b)适合于直接或间接检测抗体结合的检测试剂。特别有利的是适应于定量T细胞应答的诊断试剂盒
诊断试剂盒包含
(a)本发明的多肽；和
(b)足以使所述多肽与个体的皮肤细胞接触的仪器。诊断试剂盒包含
(a)本发明的多肽；
(b)足以使所述多肽与来自个体的样品(例如全血或更适当地PBMC)接触的仪器；和
(c)定量T细胞应答(例如增殖或IFN-Y生产)的装置。
实施例提供下述实施例仅为了举例说明而不是为了限制性。本领域技术人员容易认识到可以改变或修饰的多种非关键参数，以获得基本上相似结果。实施例I -作为潜伏性TB疫苗靶的Rv3616c的鉴定 基因Rv3616c编码保守的假定丙氨酸和甘氨酸富含蛋白质。如在Murphy 和 fcown BMC. Infect. Dis. 2007 7:84-99 中，基于与潜伏期维持和传染性结合的结核分枝杆菌基因的全基因组分析选择Rv3616c。通过在模拟的潜伏条件下细菌基因表达的公开全基因组DNA微阵列数据集的生物信息学后设分析(meta-analysis),将在结核分枝杆菌中的潜在潜伏期基因祀区分优先次序。随后对完全基因组进行由基因编码的结核分枝杆菌蛋白质的亚细胞定位，以鉴定疫苗靶。简言之，在潜伏模型中的实验条件是非常不同的，因此开发了零至五评分系统，以基于两个标准标准化这些数据1)实验条件与潜伏状态的关联性，和2)表达的等级次序。·关于特定实验数据集的最大限度得分基于与潜伏期结核分枝杆菌感染的临床发生的潜在关联性进行调整。表I显示了对于步骤I收集的数据集连同对于每个数据集调整的最大限度得分。关于生长的基因必要性的另外数据集得自使用基于转座子的敲除实验(TraSH)的公开研究。对生长没有作用的基因接受零的得分。表I -关于结核分枝杆菌DNA微阵列基因表达和全基因组基因敲除(生长期必要性)的来源、实验模型和评分标准。
权利要求
1.一种经修饰的Rv3616c蛋白质，其中对应于H37RV序列的残基134-183的氨基酸残基的疏水性已被破坏。
2.根据权利要求I的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作药物。
3.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于预防结核再活动的药物。
4.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于延迟结核再活动的药物。
5.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于治疗潜伏性TB的药物。
6.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于预防潜伏性TB的药物。
7.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于治疗TB的药物。
8.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于预防TB的药物。
9.根据权利要求I或2的经修饰的Rv3616c蛋白质，其用于用作用于改善TB的药物。
10.根据权利要求I- 9中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中对应于H37Rv序列的残基135-154的氨基酸残基的疏水性已被破坏。
11.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少I个氨基酸已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。
12.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少3个氨基酸的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。
13.根据权利要求11或12的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少110个氨基酸的邻接序列。
14.根据权利要求11- 13中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少200个氨基酸的邻接序列。
15.根据权利要求14的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQIDNo: I的残基155-392内的至少235个氨基酸的邻接序列。
16.根据权利要求11- 15中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
17.根据权利要求11- 15中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
18.根据权利要求17的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽对应于SEQIDNo: I中的残基135-154，其中至少4个氨基酸的至少邻接部分已缺失。
19.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和 (ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。
20.根据权利要求19的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-133具有至少95%同一性。
21.根据权利要求19的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-134具有至少90%同一性。
22.根据权利要求21的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-134具有至少95%同一性。
23.根据权利要求19- 21中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基184-392具有至少95%同一性。
24.根据权利要求19- 21中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少90%同一性。
25.根据权利要求19- 21中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少95%同一性。
26.根据权利要求19- 21中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少99%同一性。
27.根据权利要求19- 26中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
28.根据权利要求19- 26中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
29.根据权利要求19- 26中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述经修饰的Rv3616c蛋白质不包含与全长SEQ ID No: I具有至少90%同一性的序列。
30.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述经修饰的Rv3616c蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向经修饰的Rv3616c蛋白质的C末端,并且其中 (i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列；其中所述第一种和第二种多肽是直接或间接连接的。
31.根据权利要求30的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQIDNo: I的残基1-133内的至少110个氨基酸的邻接序列。
32.根据权利要求30的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQIDNo: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列。
33.根据权利要求30的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQIDNo: I的残基1-134内的至少110个氨基酸的邻接序列。
34.根据权利要求30- 33中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基184-392内的至少180个氨基酸的邻接序列。
35.根据权利要求30- 33中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列。
36.根据权利要求35的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQIDNo: I的残基155-392内的至少200个氨基酸的邻接序列。
37.根据权利要求36的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQIDNo: I的残基155-392内的至少235个氨基酸的邻接序列。
38.根据权利要求30- 37中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
39.根据权利要求30- 37中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
40.根据权利要求30- 39中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述经修饰的Rv3616c蛋白质不包含来自SEQ ID No: I的超过259个氨基酸的邻接序列。
41.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含其中至少一个氨基酸已从对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域中缺失的Rv3616c序列。
42.根据权利要求41的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含其中至少两个氨基酸已从对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域中缺失的Rv3616c序列。
43.根据权利要求41的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含其中至少一个氨基酸已从对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域中缺失的Rv3616c序列。
44.根据权利要求41的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含其中至少两个氨基酸已从对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域中缺失的Rv3616c序列。
45.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (iii)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1_133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (iv)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。
46.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (ii)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基184-392内的至少155个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽对应于其中至少3个氨基酸的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。
47.根据权利要求45或46的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-133内的至少110个氨基酸的邻接序列。
48.根据权利要求45- 47中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基184-392内的至少180个氨基酸的邻接序列。
49.根据权利要求45- 48中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
50.根据权利要求45- 48中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
51.根据权利要求50的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽对应于其中至少4个氨基酸的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基134-183。
52.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (iii)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (iv)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少一个氨基酸已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。
53.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (iii)所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少100个氨基酸的邻接序列；和 (iv)所述第二种多肽是在SEQID No: I的残基155-392内的至少175个氨基酸的邻接序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，其中所述第三种多肽对应于其中至少3个氨基酸的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基135-154。
54.根据权利要求52或53的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽是在SEQID No: I的残基1-134内的至少110个氨基酸的邻接序列。
55.根据权利要求52- 54中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQ ID No: I的残基155-392内的至少200个氨基酸的邻接序列。
56.根据权利要求55的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽是在SEQIDNo: I的残基155-392内的至少235个氨基酸的邻接序列。
57.根据权利要求52- 56中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
58.根据权利要求52- 56中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
59.根据权利要求58的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽对应于其中至少4个氨基酸的至少邻接部分已缺失的SEQ ID No: I中的残基133-154。
60.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是与SEQID No: I的残基1-133具有至少90%同一性的序列；和 (ii)所述第二种多肽是与SEQID No: I的残基184-392具有至少90%同一性的序列； 其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽与这样的序列具有至少90%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基134-183，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
61.根据权利要求60的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-133具有至少95%同一性。
62.根据权利要求61的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-133具有至少98%同一性。
63.根据权利要求60- 62中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基184-392具有至少95%同一性。
64.根据权利要求63的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQID No:I的残基184-392具有至少98%同一性。
65.根据权利要求60- 64中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
66.根据权利要求60- 64中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
67.根据权利要求66的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是与对应于SEQID No: I中的残基134-183的序列具有至少95%同一性的序列，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
68.根据权利要求67或68的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是与对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的序列具有至少98%同一性的序列，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
69.根据权利要求60- 68中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中从对应于SEQID No: I中的134-183的残基中缺失的所述邻接部分是至少4个氨基酸。
70.根据权利要求66- 69中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是长度48个氨基酸或更少。
71.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含第一种多肽和第二种多肽，所述第一种多肽相对于所述第二种多肽定位朝向N末端，并且其中 (i)所述第一种多肽是与SEQ ID No: I的残基1-134具有至少90%同一性的序列；和(ii)所述第二种多肽是与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少90%同一性的序列；其中所述第一种和第二种多肽是直接连接的或经由第三种多肽间接连接的，所述第三种多肽与这样的序列具有至少80%同一性，所述序列对应于SEQ ID No: I中的残基135-154，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
72.根据权利要求71的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-134具有至少95%同一性。
73.根据权利要求72的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第一种多肽与SEQID No:I的残基1-134具有至少98%同一性。
74.根据权利要求71- 73中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中 所述第二种多肽与SEQ ID No: I的残基155-392具有至少95%同一性。
75.根据权利要求74的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQID No:I的残基155-392具有至少98%同一性。
76.根据权利要求74的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第二种多肽与SEQID No:I的残基155-392具有至少99%同一性。
77.根据权利要求71- 76中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是直接的。
78.根据权利要求71- 76中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述肽连接是间接的。
79.根据权利要求78的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是与对应于SEQID No: I中的残基135-154的序列具有至少90%同一性的序列，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
80.根据权利要求78或79的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是与对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的序列具有至少95%同一性的序列，其中至少3个氨基酸的邻接部分已缺失。
81.根据权利要求71- 80中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中从对应于SEQID No: I中的134-183的残基中缺失的所述邻接部分是至少4个氨基酸。
82.根据权利要求81的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中从对应于SEQID No: I中的134-183的残基中缺失的所述邻接部分是至少5个氨基酸。
83.根据权利要求78- 82中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述第三种多肽是长度20个氨基酸或更少。
84.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域的至少I个氨基酸已由亲水残基置换。
85.根据权利要求84经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含Rv3616c序列,其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基134-183的区域的至少3个氨基酸的邻接部分已由亲水残基置换。
86.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域的至少I个氨基酸已由亲水残基置换。
87.根据权利要求86经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含Rv3616c序列,其中来自对应于SEQ ID No: I中的残基135-154的区域的至少3个氨基酸的邻接部分已由亲水残基置换。
88.根据权利要求I- 10中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中至少一个亲水性氨基酸残基已加入对应于SEQ ID No: I中的133-184的那些残基之间的位置上。
89.根据权利要求88的经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含Rv3616c序列,其中至少一个亲水性氨基酸残基已加入对应于SEQ ID No: I中的134-183的那些残基之间的位置上。
90.根据权利要求89的经修饰的Rv3616c蛋白质,所述蛋白质包含Rv3616c序列,其中至少一个亲水性氨基酸残基已加入对应于SEQ ID No: I中的134-155的那些残基之间的位置上。
91.根据权利要求90的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质包含Rv3616c序列，其中至少一个亲水性氨基酸残基已加入对应于SEQ ID No: I中的134-154的那些残基之间的位置上。
92.根据权利要求88- 91中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中至少两个亲水性氨基酸残基已加入所述指定区域内。
93.根据权利要求I- 92中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质是长度小于500个氨基酸残基。
94.根据权利要求93的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质是长度小于450个氨基酸残基。
95.根据权利要求94的经修饰的Rv3616c蛋白质，所述蛋白质是长度小于400个氨基酸残基。
96.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:161的氨基酸序列。
97.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:162的氨基酸序列。
98.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:163的氨基酸序列。
99.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:164的氨基酸序列。
100.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:165的氨基酸序列。
101.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:166的氨基酸序列。
102.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:167的氨基酸序列。
103.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:168的氨基酸序列。
104.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:169的氨基酸序列。
105.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:179的氨基酸序列。
106.根据权利要求I- 95中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其包含SEQ ID No:180的氨基酸序列。
107.根据权利要求I- 106中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述结核与结核分枝杆菌(IcoAacteritt tuberculosis)感染相关。
108.根据权利要求I- 107中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述经修饰的Rv3616c 蛋白质不包含 SEQ ID No: 162。
109.一种用于治疗、改善或预防TB的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质，其中所述多肽诱导免疫应答。
110.根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质在制造用于治疗、预防或改善TB的药物中的用途。
111.一种包含核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质。
112.根据权利要求111的多核苷酸，其由编码根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质的核酸序列组成。
113.根据权利要求111或112的多核苷酸，其包含编码根据SEQID Nos: 161 - 169、179或180中任何一个的多肽的序列。
114.根据权利要求113的多核苷酸，其包含根据SEQID Nos: 170-178中任何一个的序列。
115.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸,用于用作药物。
116.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸,用于用作用于治疗TB的药物。
117.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于预防TB的药物。
118.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于改善TB的药物。
119.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于治疗潜伏性TB的药物。
120.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于预防潜伏性TB的药物。
121.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于预防结核再活动的药物。
122.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸，用于用作用于延迟结核再活动的药物。
123.根据权利要求111- 122中任一项的多核苷酸,其中所述结核与结核分枝杆菌感染相关。
124.—种用于治疗、改善或预防TB的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求111 - 114中任一项的多核苷酸，其中所述多肽诱导免疫应答。
125.根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸在制造用于治疗、改善或预防TB的药物中的用途。
126.—种药物组合物，其包含 (a)根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质；和 (b)药学可接受的载体或赋形剂。
127.—种药物组合物，其包含 (a)根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸；和 (b)药学可接受的载体或赋形剂。
128.—种免疫原性组合物，其包含 (a)根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质；和 (b)非特异性免疫应答增强物。
129.—种免疫原性组合物，其包含 (a)根据权利要求111- 114中任一项的多核苷酸；和 (b)非特异性免疫应答增强物。
130.根据权利要求128或129的免疫原性组合物，其中所述非特异性免疫应答增强物是佐剂。
131.一种包含核酸序列的表达载体,所述核酸序列编码根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质。
132.—种宿主细胞，其用权利要求131的表达载体转化。
133.—种宿主细胞，其重组表达根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质。
134.—种用于产生根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质的方法，所述方法包括在宿主细胞内重组表达所述多肽的步骤。
135.—种用于产生根据权利要求134的经修饰的Rv3616c蛋白质的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(万.coli)。
136.—种诊断试剂盒，其包含 (a)根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质； (b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与来自个体的样品(例如全血或更适当地PBMC)接触的仪器；和 (c)定量所述样品的T细胞应答的装置。
137.—种诊断试剂盒，其包含 (a)根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质；和 (b)足以使所述经修饰的Rv3616c蛋白质与患者的表皮细胞接触的仪器。
138.—种用于检测受试者中的结核分枝杆菌感染的方法，其包括 (a)使来自所述受试者的样品与根据权利要求I- 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质接触；和 (b)在生物学样品中检测结合所述经修饰的Rv3616c蛋白质的抗体的存在。
139.权利要求138的方法，其中所述经修饰的Rv3616c蛋白质固定在固体载体上。
140.一种融合蛋白，其包含根据权利要求I - 108中任一项的经修饰的Rv3616c蛋白质和另外的异源多肽。
141.一种多核苷酸，其编码根据权利要求140的融合蛋白。
142.根据权利要求126或127的药物组合物，其包含以多肽形式的另外的异源抗原组分。
143.根据权利要求126或127的药物组合物，其包含以多核苷酸形式的另外的异源抗原组分。
144.根据权利要求128或129的免疫原性组合物，其包含以多肽形式的另外的异源抗原组分。
145.根据权利要求128或129的免疫原性组合物，其包含以多核苷酸形式的另外的异源抗原组分。
146.根据权利要求I- 108中任一项的多肽，用于与化学治疗剂组合使用。
147.根据权利要求111- 123中任一项的多核苷酸，用于与化学治疗剂组合使用。
全文摘要
经修饰的Rv3616c蛋白质及其作为药物特别是用于预防结核再活动的用途。
文档编号A61K39/04GK102869372SQ201180014803
公开日2013年1月9日 申请日期2011年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者N.布莱斯, J.布朗, A-M.格利纳斯, P.梅滕斯, D.墨菲 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司, 葛兰素集团有限公司