Sparc血管生成结构域和使用方法

专利名称：Sparc 血管生成结构域和使用方法
SPARC血管生成结构域和使用方法相关申请的交叉参考本专利申请要求2010年3月11日提交的美国临时专利申请号61/313，050和2010年3月11日提交的61/313，047的权益，二者通过引用方式全文并入本文。
背景技术：
分泌的、酸性的、富含半胱氨酸的蛋白(SPARC)，也被称作骨结合素(osteonectin)，是286个氨基酸的糖蛋白。SPARC具有针对多种配体的亲和性，包括阳离子(例如Ca2+，Cu2+，Fe2+)，生长因子(例如血小板衍生的生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF))，细胞外基质(ECM)蛋白(例如胶原I-V和胶原IX，玻连蛋白和凝血酶敏感蛋白-1)，内皮细胞，血小板，白蛋白和羟磷灰石。SPARC的表达是发育调节的，并且主要在正常发育或响应于损伤而经历重塑的组织中表达(见，例如Laneet a I.，FASEBJ.，8，163-173(1994))。在发育中的骨和牙齿中有高水平的SPARC蛋白表达。SPARC在数种攻击性癌症中上调，但是在大多数正常组织中不存在(Porter etal. , J. Histochem. Cytochem. , 43, 791 (1995)以及见下文)。在多种肿瘤(例如，膀胱、肝、卵巢、肾、肠和乳腺)中SPARC的表达被诱导。例如，在膀胱癌中，已经表明SPARC的表达与晚期癌相关。已经表明T2阶段或更高阶段的侵袭性膀胱肿瘤表达比Tl阶段的膀胱肿瘤(或较低表面的肿瘤)更高水平的SPARC,并具有更差的预后(见,例如Yamanaka et al.，J.Urology, 166，2495-2499 (2001))。在脑膜瘤中，已经表明SPARC的表达仅与侵袭性肿瘤相关(见，例如 Rempel et al. , ClincalCancer Res.，5，237-241 (1999))。也已经在 74. 5% 的原位侵袭性乳腺癌损伤(见，例如 Bellahcene, et al. , Am. J. Pathol. , 146, 95-100 (1995))和54. 2% 的浸润性乳腺导管癌(见，例如Kim et al.，J. Korean Med. Sci.，13，652-657(1998))中检测到SPARC表达。也已经表明SPARC的表达与乳腺癌中的常见的微钙化相关(见，例如Bellahcene et al.，见上文)，这说明SPARC的表达可能对于乳腺转移酶对于骨的亲和性起作用 ο 还已知 SPARC 结合白蛋白(见，例如 Schnitzer, J. Biol. Chem.，269，6072 (1994))。因此，利用SPARC在疾病中的作用、例如SPARC在一些癌症中的作用的组合物和方法是需要的。特别地，利用SPARC的结构域特异性活性、例如SPARC羧基血管生成结构域的特异性活性的组合物和方法是需要的。

发明内容
本发明提供了分离的“SPARC血管生成结构域多肽”，所述多肽的用途，以及检测和定量所述多肽的方法。此外，本发明提供了 “SPARC血管生成结构域多肽”的用途和检测及定量包含该结构域的多肽的方法。本发明提供了使用治疗法治疗患有SPARC依赖性疾病的动物的方法，包括(a)定量所述动物的疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽的量，以及，任选地，定量包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量；(b)在一个或多个患有相同的SPARC依赖性病况或疾病的、已知响应于所述治疗法的其它动物的疾病位点处定量SPARC血管生成结构域多肽的量，以及，任选地，定量包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量；(c)计算(b)中测定的SPARC血管生成结构域多肽的量的平均值，如果包括的话，计算(b)中测定的包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量的平均值；(d)将(a)中测定的所述量与(c)中测定的所述平均值相比较；和(e)如果(a)中测定的所述量大于或等于(C)中测定的所述平均值，则施用所述治疗法。"SPARC依赖性疾病”意思是需要一定水平的SPARC以维持疾病或病况的疾病或病况。“一个或多个患有SPARC依赖性病况或疾病的、已知响应于所述治疗法的其它动物”意思是至少一个动物，但是也包括产生与(a)中的动物相比的统计上的显著性的任何数目。存在于疾病位点生物活组织检查材料中的SPARC血管生成结构域和SPARC血管生成结构域多肽可以通过本领域普通技术人员已知的任何适宜的方式来检测和定量，包括例如，用于常规免疫组织化学和基于溶液的测定法(例如ELISA)的针对SPARC血管生成结构域的抗体和质谱法。“疾病位点”意思是疾病为活性的解剖位置。本发明提供了分离的多肽，其包含缺失SEQ ID NO: I的连续氨基酸的全长SPARC 多肽，和分离的、羧基截短的SPARC多肽，其为全长SPARC多肽的羧基末端的酶消化产物并且其保留不超过5%的SEQID NO: I的血管生成活性。本发明提供了治疗动物中的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的本文公开的缺乏血管生成活性的任意一种或多种SPARC多肽，包括例如，分离的、羧基截短的SPARC多肽，其为全长SPARC多肽的羧基末端的酶消化产物并且其保留不超过5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性、特别是SEQ ID NO:2。本发明提供了预测患有SPARC依赖性疾病的动物对于治疗法的阳性应答的方法，包括Ca)定量疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽和包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC多肽的量；(b)将SPARC的所述量与患有SPARC依赖性疾病的、已知对该治疗法有应答的动物中存在的SPARC的量进行比较；和(0)如果包含SEQ ID NO: I的多肽的量高于或低于阈值水平，则预测对于该治疗法的阳性应答。本发明提供了治疗患有SPARC依赖性病况或疾病的动物的方法，包括使用免疫有效量的(即引发免疫应答的量的)包含SPARC血管生成结构域多肽的免疫原接种所述动物。本发明提供了治疗患有SPARC依赖性病况或疾病的动物的方法，包括向所述动物施用治疗有效量的多肽，所述多肽结合SPARC血管生成结构域、抑制SPARC血管生成结构域的活性并在疾病位点处聚集。合适的SPARC血管生成结构域结合性肽包括，例如，其中多肽缀合于化疗、放射或生物试剂。合适的SPARC血管生成结构域结合性多肽包括抗体和抗体片段。


图I是显示在PC3模型中与Abraxane和Sutent —起施用的外源SPARC的效果的数据的示意图。图2图示了 HUVEC 3-D管形成测定法的结果，其表征了 SPARC的血管生成活性。图3图示了 SDS-PAGE测定法的结果，其中野生型SPARC与SPARC_d (2种C末端截短的SPARC蛋白的混合物)并排跑胶。图4是获自HUVEC 3_D管形成测定法的数据的示意图，其表征了野生型SPARC和SPARC-d。
具体实施例方式人SPARC基因编码303个氨基酸的SPARC蛋白(SEQ ID NO: I)。其主要翻译产物是通过切割氨基末端信号序列而被加工的，产生SPARC的成熟形式即285个氨基酸的糖蛋白(统称“全长SPARC”形式)。切割氨基末端信号序列之后，产生了 32-kD的分泌形式，其在SDS-PAGE上在43kD处迁移，这是因为糖基化的原因。结晶学数据表明SPARC蛋白具有3个模块结构域。N末端结构域是酸性的并与钙结合。中间的“卵泡抑素样结构域”包含参与抑制血管生成和黏着斑形成的氨基酸以及(K)GHK血管生成肽。羧基末端“E-C结构域”包含参与高亲和性钙结合和抑制细胞扩展的氨基酸(Yan&Sage，J. Histochem.Cytochem. 7:1495—1505，1999)。令人惊奇的是，已经确定SPARC多肽的促血管生成活性位于成熟SPARC多肽的氨基酸233-286(SEQ ID NO: I)。以前，该活性被报道是位于SPARC的N末端区域(Sage H. AdvDent Res. 19959 (3Suppl) :5。由于SPARC的促细胞凋亡区域更靠近氨基末端,所以该发现提示缺失羧基末端血管生成结构域的SPARC多肽(例如SEQ ID NO: 2)对于SPARC依赖性疾病例如肿瘤可能比全长的成熟SPARC多肽更有活性。另外，虽然不希望被任何特定理论所限 制，但是，由于血管生成对于肿瘤生长是必需的，所以不含C末端血管生成结构域的SPARC(SEQ IDN0:2)可能与全长野生型SPARC竞争并在体内消除其促血管生成、促肿瘤活性。本发明提供了“SPARC血管生成结构域”的用途。如本文使用的该术语包括SEQ IDNO: I和相关的序列，例如这样的实施方式其中SEQID NO: I具有至多5个保守性氨基酸变化、优选至多4个保守性氨基酸变化、更优选至多3个保守性氨基酸变化、更优选至多2个保守性氨基酸变化、更优选I个保守性氨基酸变化，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。如本文使用的“SPARC血管生成结构域”也包括具有至多5个非保守性氨基酸变化、优选至多4个非保守性氨基酸变化、更优选至多3个非保守性氨基酸变化、更优选至多2个非保守性氨基酸变化、更优选I个非保守性氨基酸变化的SEQ ID NO: 1，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。如本文使用的“SPARC血管生成结构域”也包括这样的序列其与SEQ ID NO: I至少90%同一、优选与SEQ ID NO: I至少85%同一、更优选与SEQ ID NO: I至少80%同一、更优选与SEQ ID NO: I至少75%同一、更优选与SEQ ID NO: I至少70%同一，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。百分率同一性是基于通过本领域普通技术人员已知的任意合适的计算机程序进行的比对，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所讨论。本发明提供了 SEQ ID NO: I的分离的多肽(“SPARC血管生成结构域多肽”)或SEQID N0:2的分离的多肽，其羧基和/或氨基末端具有至多另外的15个氨基酸，优选至多另外的12个氨基酸，更优选至多另外的10个氨基酸，更优选至多另外的8个氨基酸，更优选至多另外的5个氨基酸，更优选至多另外的4个氨基酸，更优选至多另外的3个氨基酸，更优选至多另外的2个氨基酸，最优选另外的I个氨基酸。相应地，本发明限定了 “SPARC血管生成结构域多肽”的大小，如该术语如本文中所使用的。本发明提供了分离的“SPARC血管生成结构域多肽”，包括例如，不具有或具有至多5个保守性氨基酸变化，优选至多4个保守性氨基酸变化、更优选至多3个保守性氨基酸变化、更优选至多2个保守性氨基酸变化、更优选I个保守性氨基酸变化的SEQ ID NO: I的多肽，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本发明还提供了分离的“SPARC血管生成结构域多肽”，包括例如，不具有或具有至多5个非保守性氨基酸变化、优选至多4个非保守性氨基酸变化、更优选至多3个非保守性氨基酸变化、更优选至多2个非保守性氨基酸变化、更优选I个非保守性氨基酸变化的SEQID NO: I的多肽，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本发明提供了分离的SPARC血管生成结构域多肽，包括例如这样的多肽其与SEQID NO: I至少90%同一、优选与SEQ ID NO: I至少85%同一、更优选与SEQ ID NO: I至少80%同一、更优选与SEQ IDN0:1至少75%同一、更优选与SEQ ID NO: I至少70%同一，并且其保留至少60%、优选至少50%、更优选至少40%、最优选至少30%的SEQ ID NO: I的血管生成活 性。百分率同一性是基于通过本领域普通技术人员已知的任意合适的计算机程序进行的比对，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所讨论。本发明包括分离的多核苷酸，其包含编码如本文描述的本发明的任一 SPARC多肽、包括SEQ ID NO: I和2和本文公开的它们的突变体的核酸序列，表达此类核酸序列的表达载体和包含此类多核苷酸的转化的细胞。本发明提供了用于在需要血管生成的动物中刺激血管生成的方法，包括施用治疗有效量的分离的SPARC血管生成结构域多肽，包括例如，编码包含SEQ ID N0:1的序列的多肽的多核苷酸。本发明提供了用于治疗和预防动物中的SPARC依赖性疾病的方法，包括施用治疗有效量的编码包含SEQ ID N0:2的序列的多肽的分离的多核苷酸。本发明提供了用于在需要血管生成的动物中刺激血管生成的方法，包括施用治疗有效量的纯化的分离的SPARC血管生成结构域多肽，包括例如，包含SEQ ID NO: I的序列的多肽或根据本发明和/或如本文描述的其突变体。相应地，本发明提供了治疗病理性灌注不足、例如再狭窄、动脉硬化症和边缘低灌注以及治疗缺血包括例如其中所述缺血是心肌缺血和中风的方法。本发明提供了缺失血管生成结构域的分离的SPARC多肽，包括例如，包含SEQ IDNO: 2的SPARC多肽，即缺失SEQ ID NO: I的连续氨基酸的成熟的SPARC多肽。本发明提供了分离的SPARC多肽，包括表位标签化多肽，其为羧基截短的，即这样的SPARC多肽，其为全长SPARC多肽的羧基末端的酶消化产物，并且保留不超过5%的SEQID NO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。羧基消化可通过任何适当的方法进行，包括酶促和化学消化。例如，本领域普通技术人员能常规地采用丝氨酸羧基肽酶、溶酶体Pro-X羧基肽酶、羧基肽酶C、羧基肽酶D、半胱氨酸型羧基肽酶、金属外肽酶等用于该目的。见例如，Nakazawa T et al. Terminalproteomics:N—andC—terminal analyses for high-fidelity identification ofproteins using MS.，Proteomics. 2008Feb; 8 (4) : 673-85，该文献通过引用方式并入本文。本发明提供了 SEQ ID NO:2的分离的多肽，其具有至多5个保守性氨基酸变化、优选至多4个保守性氨基酸变化、更优选至多3个保守性氨基酸变化、更优选至多2个保守性氨基酸变化、更优选I个保守性氨基酸变化，并且其保留不超过5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本发明还提供了 SEQ ID NO:2的分离的多肽，其具有至多5个非保守性氨基酸变化、优选至多4个非保守性氨基酸变化、更优选至多3个非保守性氨基 酸变化、更优选至多2个非保守性氨基酸变化、更优选I个非保守性氨基酸变化，并且其保留不超过5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。本发明提供了分离的多肽，其与SEQ ID NO:2至少90%同一、优选与SEQ ID NO:2至少85%同一、更优选与SEQ ID NO: 2至少80%同一、更优选与SEQ ID NO: 2至少75%同一、更优选与SEQ ID NO: 2至少70%同一，并且其保留不超过5%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性。百分率同一性是基于通过本领域普通技术人员已知的任意合适的计算机程序进行的比对，包括例如ClustalW, MAFFT或mAlign或如下文所讨论。本发明提供了治疗动物中的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的具有至多5个保守性氨基酸变化、优选至多4个保守性氨基酸变化、更优选至多3个保守性氨基酸变化、更优选至多2个保守性氨基酸变化、更优选I个保守性氨基酸变化、并且保留不超过5%的SEQID NO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一种或多种SEQ ID N0:2的分离的多肽。本发明提供了治疗动物中的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的具有至多5个非保守性氨基酸变化、优选至多4个非保守性氨基酸变化、更优选至多3个非保守性氨基酸变化、更优选至多2个非保守性氨基酸变化、更优选I个非保守性氨基酸变化、并且保留不超过5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一种或多种SEQ ID NO:2的分离的多肽。本发明提供了致敏动物中的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的具有至多5个保守性氨基酸变化、优选至多4个保守性氨基酸变化、更优选至多3个保守性氨基酸变化、更优选至多2个保守性氨基酸变化、更优选I个保守性氨基酸变化、并且保留不超过5%的SEQID NO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一种或多种SEQ ID NO:2的分离的多肽和非SPARC治疗法。本发明提供了致敏动物中的肿瘤的方法，包括施用治疗有效量的具有至多5个非保守性氨基酸变化、优选至多4个非保守性氨基酸变化、更优选至多3个非保守性氨基酸变化、更优选至多2个非保守性氨基酸变化、更优选I个非保守性氨基酸变化、并且保留不超过5%的SEQ IDNO: I的血管生成活性，优选不超过3%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，更优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性，最优选不超过1%的SEQ ID NO: I的血管生成活性的任一种或多种SEQ ID NO:2的分离的多肽和非SPARC治疗法。如本文使用的“SPARC依赖性”疾病是指这样的疾病或病况，例如，需要足够量的野生型SPARC以维持其病理过程的疾病。如本文使用的“抗-SPARC治疗法”是指包括减小SPARC的活性或靶向SPARC以灭活它的分子的治疗法。例如，抗SPARC治疗法可以是结合SPARC的分子，其将活性试剂递送至肿瘤或其它疾病的位点，可以是针对SPARC的抗体。SPARC依赖性疾病和病况包括例如，肿瘤、关节病、肾小球肾炎、胆管炎、逾常型伤Π愈合、重塑或血管生成。本发明还提供了使用治疗有效量的如本文描述的任一种或多种SEQ ID N0:2的分离的多肽或其突变体来治疗或致敏除了肿瘤或癌症以外的增殖性疾病的方法。适合治疗的增殖性疾病包括肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩、增殖性糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、延迟的伤口愈合、出血性关节、骨折不愈合、OsIer-Weber综合征、牛皮癣、脓性肉芽肿、硬皮病、沙眼、月经过多、血管粘连和再狭窄。
本发明提供了治疗或致敏动物中的肿瘤中的方法，其中所述肿瘤选自口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤、生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眶瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、喉肿瘤、肺的肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫颈肿瘤、子宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾的肿瘤、肾盂的肿瘤、输尿管的肿瘤、头颈肿瘤、副甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病。本发明提供了致敏动物中的肿瘤的方法，其中非SPARC治疗法是下列一种或多种化疗、放射或生物学方案，包括例如，其中非SPARC治疗法包括下列一种或多种多西紫杉醇、紫杉醇、紫杉烷、钼化合物、抗叶酸剂、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、DNA损伤剂、促细胞调亡剂、分化诱导剂、抗血管生成剂、抗生素、激素、肽、抗体及其组合。本发明提供了鉴定血管生成抑制剂的方法，包括(a)向血管生成模型系统施用有效量的任一种SEQ ID NO: I或其突变体的组合物；(b)向血管生成模型系统单独同时施用候选血管生成抑制剂和权利要求1-4任一项的组合物；(C)定量(a)和(b)中产生的血管生成的量；和((1)如果(b)中相对于(a)中的血管生成减少，则鉴定所述候选血管生成抑制剂是真实的血管生成抑制剂。任何合适的血管生成模型系统都可用于本发明，包括例如，其中所述血管生成模型系统是HUVEC管形成测定法。如本文使用的“药物”是能够产生效应的、可以向患者或测试受试者施用的组合物。所述效应可以是化学的、生物的或物理的，所述患者或测试受试者可以是人、或非人动物，例如啮齿类或转基因小鼠。所述组合物可以包括具有不同的分子组成的、合成制备的、天然发现的、或部分合成来源的小的有机或无机分子。该类别中包括核苷酸、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白、肽核酸或包含至少一种这些物质的复合物。药物可以包含单独的有效成分或与药学上可接受的赋形剂组合的有效成分。如本文使用的“药学上可接受的赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂覆剂、抗细菌剂、抗微生物剂或抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。赋形剂可适用于静脉内、腹膜内、肌肉内、鞘内或经口施用。赋形剂可以包括无菌水溶液或分散液，用于无菌可注射溶液或分散液的即时制备。用于制备药物的此类介质的使用是本领域已知的。如本文使用的“药理学有效量”或“有效量”的药物是指使用以这样的浓度存在的药物的量所述浓度在所述药物被使用的期间产生治疗水平的药物递送。这可依赖于递送模式、剂量的时间阶段、接受药物的受试者的年龄、体重、一般健康、性别和食谱。确定何种剂量是“药理学有效量”需要常规优化，这是本领域普通技术人员能力内的。如本文使用的术语“癌症”或“肿瘤”是指由丧失了对于正常生长控制的敏感性的细胞的增殖引起或特征在于丧失了对于正常生长控制的敏感性的细胞的增殖的增殖性病症。如本申请中使用的术语“癌症”包括肿瘤和任何其它增殖性病症。相同组织类型的癌症通常起源于相同的组织，并且可基于它们的生物学特征被分为不同的亚型。癌症的4种一般类别为癌(上皮组织衍生的)、肉瘤(结缔组织或中胚层衍生的)、白血病(形成血液的组织衍生的)和淋巴瘤(淋巴组织衍生的)。已知有超过200种不同类型的癌症，可影响身体的每种器官和组织。不限定癌症的定义的癌症的具体类型包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性 白血病。可被多种癌症影响的器官和组织的实例包括胰腺、乳腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、甲状腺、垂体、肾上腺、肾、胃、食道、结肠或直肠、头和颈、骨、神经系统、皮肤、血液、鼻咽组织、肺、尿道、子宫颈、阴道、外分泌腺和内分泌腺。或者，癌症可以是多中心的或原发部位不明癌(CUPS)。如本文使用的“癌性细胞“是指已经经历了转化事件并且其生长调节程度不再如所述转化事件之前那样的细胞。肿瘤是指癌性细胞的集合，通常被发现为患者或测试受试者的组织中或组织上的固体或半固体团块。具有病理性灌注不足的疾病或病况可根据本发明来治疗，其中将有效量的一种或多种包含SEQ ID N0:1的多肽施用至动物，例如人。适合根据本发明来治疗的灌注不足疾病或病况包括心肌缺血、心肌梗塞、糖尿病、神经病、ALS、口腔溃疡、胃溃疡、再狭窄、中风、TIA、先兆子痫等(关于另外的合适的疾病和病况,也参见Carmeliet, Angiogenesis inhealth and disease, Nature Medicine 9，653-660 (2003),通过引用方式并入本文)。具有逾常型血管生成的疾病、特别是SPARC依赖性的疾病可根据本发明来治疗，其中将有效量的例如一种或多种靶向SPARC血管生成结构域的抗体或其它抗SPARC治疗法施用至动物，例如人。适合根据本发明治疗的具有逾常型血管生成的疾病包括癌症、肿瘤、血管瘤、子宫内膜异位症、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、牛皮癣、关节炎、脓性肉芽肿、血管免疫母细胞淋巴结病、牙周病等(关于另外的合适的疾病和病况，也参见Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9,653-660(2003),通过引用方式并入本文)。具有逾常型伤口愈合和重塑的疾病、特别是SPARC依赖性的疾病可根据本发明来治疗，其中将有效量的一种或多种靶向SPARC血管生成结构域的抗体或其它抗SPARC治疗法施用至动物，例如人。适合根据本发明治疗的具有逾常型伤口愈合和重塑的疾病包括疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、肺纤维化等(关于另外的合适的疾病和病况，也参见Carmeliet, Angiogenesis in health and disease, Nature Medicine 9,653-660(2003),通过引用方式并入本文)。
基于治疗方案杀死癌细胞或减小肿瘤体积、减小总体癌症生长(即通过减少血管生成)和/或抑制转移的能力，可将癌细胞或癌性细胞描述为对于给定的治疗方案或化疗剂“敏感”或“抗性”。对于治疗方案抗性的癌细胞可能不对该方案产生应答，并且可能持续增殖。对于治疗方案敏感的癌细胞对于该方案可产生应答，引起细胞死亡、肿瘤体积减小、减小的总体生长(肿瘤负荷)或转移的抑制。例如，这理想地表现为肿瘤尺寸、总体生长/肿瘤负荷或转移发生率减小大约10%或更高，例如大约30%、大约40%、大约50%、大约60%、大约70%、大约80%、或更高，至大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约10倍、大约15倍、大约20倍或更高。应答的监视可通过多种病理学、临床和成像方法进行，如本文所描述和本领域技术人员已知。化疗剂或试剂组合的共同主题是诱导癌性细胞的死亡。例如，DNA加合物例如亚硝基脲、白消安、噻替派、苯丁酸氮芥、顺钼、丝裂霉素、丙卡巴肼或达卡巴嗪通过迫使正在进行复制的细胞在细胞周期的M期之前修复受损的DNA来减缓癌细胞的生长，或者其本身可引起足够的损伤以激发癌细胞的细胞调亡。也可通过临床医生可获得的化疗剂的多种集合来干扰其它事件，例如基因表达或转录，蛋白质翻译，或复制的DNA的甲基化，并辅助激发癌细胞内的细胞调亡过程。或者，化疗剂可使癌性细胞通过患者或测试受试者的体液或 获得性免疫系统例如补体级联或淋巴细胞攻击而被杀死。不希望被任何特定理论限定，对于化疗剂或试剂组合有抗性的癌性细胞可通过主动将药物运输出细胞之外而为其生存斗争，例如通过过表达ABC转运子MDRl P-糖蛋白(FORD et al 1993. Cytotechnol. 12:171-212)或获得“相反突变”以对抗药物。例如，影响检测对于细胞DNA的损伤的能力的DNA修复酶中的突变可使受损伤的DNA复制并允许癌性细胞持续复制，使肿瘤扩大。随着突变的累积，其它的将在正常细胞周期中发挥作用的调节点将停止发挥功能，非调控生长周期启动级联。化疗抗性的另一个方面涉及肿瘤细胞避开细胞调亡。宿主生物对于失调的细胞生长的正常应答是在进入不受控复制的级联开始之前启动细胞调亡和消除缺陷细胞。然而，这可被癌性细胞破坏，例如，通过癌性细胞中破坏信号转导事件，丧失黏附依赖性或接触抑制，或丧失通常被认为是“肿瘤抑制剂”的促调亡因子,例如，p53、BRCAl或RB。对于细胞调亡的这种敏感性在癌症治疗中的重要性得到最近的证据的支持，其表明对于过去仅通过药物被治愈的相对少数肿瘤的化疗的选择性很大程度上依赖于它们对于进行细胞调亡的容易的易感性(Johnstoneet al.，2002.Cell. 108(2) : 153-64)。如本文使用的“治疗方案”或“治疗法”是指施用对于癌性细胞有害的至少一种试齐U。用于本发明的合适的治疗方案包括但不限于“化疗方案”、“放疗方案”、“另类治疗方案(alternative therapeutic regimen)，，及其组合。如本文使用的“化疗方案”或“化疗法”是指施用有害的至少一种化疗剂以破坏癌性细胞。对于临床医生而言有多种此类化疗试剂。可向受试者施用单一大剂量的化疗试剂或可以以较小剂量在一段时间内施用。可使用单一的化疗剂(单试剂治疗)或多种试剂可组合使用(组合治疗)。可单独使用化疗以治疗一些类型的癌症。或者，化疗可以与其它类型的治疗例如放疗或另类治疗(例如免疫治疗)组合，如本文所描述。另外，可以施用化学致敏剂，作为与化疗剂的组合治疗。如本文使用的“化疗剂”是指可用于治疗癌症的药物，一般具有直接杀死癌性细胞的能力。化疗剂的实例包括烷基化试剂、抗代谢剂、天然产物、激素和拮抗剂和杂类试齐U。在括号中标注了别名的例子。烷基化试剂的实例包括氮芥类例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-沙可来新)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺例如六甲基三聚氰胺和噻替派；烷基磺酸盐类，例如白消安；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和链脲菌素(streptozotocin) ;DNA合成拮抗剂，例如磷酸雌二醇氮芥；和三嗪，例如达卡巴嗪(DTIC、二甲基-三氮烯咪唑甲酰胺)和替莫唑胺。抗代谢剂的实例包括叶酸类似物例如甲氨蝶呤(amethopterin);喃唳类似物,例如flu0r0uracin(5-氟尿苷、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿糖核苷)和吉西他滨；嘌呤类似物例如巯基嘌呤(6-巯嘌呤、6-MP)、硫代鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤、TG)和喷司他丁(2’ -脱氧助间型霉素、脱氧助间型霉素)、克拉屈滨和氟达拉滨；和拓扑异构酶抑制剂，例如安吖啶。天然产物的实例包括长春花生物碱例如长春花碱(VLB)和长春新碱；紫杉烷例如紫杉醇和多西紫杉醇(Taxotere);表鬼白毒素，例如依托泊甙和替尼泊甙；喜树碱例如托泊替坎和伊立替康；抗生素例如更生霉素(放线菌素D)、红比霉素(道诺霉素、红比霉素)、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊 达比星、表柔比星；酶类，例如L-天冬酰胺酶；和生物学反应调节剂，例如干扰素α和白细胞介素2。激素和拮抗剂的实例包括黄体释放激素激动剂，例如布舍瑞林；肾上腺皮质类固醇例如泼尼松和相关制剂；孕激素类例如羟基孕酮己酸酯、甲羟孕酮乙酸酯和甲地孕酮乙酸酯；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相关制剂；雌激素拮抗剂例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睾酮和氟甲睾酮和相关制剂；雄激素拮抗剂例如氟他胺和比卡鲁胺；和促性腺激素释放激素类似物例如亮丙瑞林。杂类试剂的实例包括沙立度胺；钼络合物例如顺钼(cis-DDP)、奥沙利钼和卡钼；蒽二酮类例如米托蒽醌；取代的脲例如羟基脲；甲基肼衍生物例如甲基苄肼(N-甲基肼、MIH);肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(o，p’_DDD)和氨鲁米特；RXR激动剂例如贝沙罗汀和酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼。化疗剂的这些和另外的实例的别名和商品名和它们的使用方法包括剂量和施用方案是本领域技术人员已知的，可见于本领域普通技术人员已知的任何合适的参考文献。特别地，用于本发明的合适的化疗试剂包括但不限于纳米颗粒白蛋白结合性紫杉醇。如本文使用的术语“放疗方案”或“放疗”是指施用放射以杀死癌性细胞。放射与细胞内的多种分子相互作用，但是引起细胞死亡的主要靶标是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放疗通常也导致对于细胞和核膜和其它细胞器的损伤。DNA损伤通常涉及糖-磷酸酯骨架中的单链和双链的断裂。此外，会有DNA和蛋白质的交联，这会破坏细胞功能。取决于放射的类型，DNA损伤的机制可以变化，相对生物有效性也可变化。例如，重粒子(例如质子、中子)直接损伤DNA，并具有较大的相对生物有效性。电磁放射引起间接离子化，其通过主要由细胞水分的离子化产生的短寿的、羟基自由基而作用。临床应用放射由外线束辐射(来自外部来源)和近距离放射疗法(使用植入或插入患者中的放射源)组成。外线束辐射由X射线和/或Y射线组成，而近距离放射疗法应用放射活性细胞核，其衰变并发射α粒子，或与Y射线一起的β粒子。放疗还可用于组合化疗，其中化疗剂用作放射致敏剂。适合于个体患者的放疗的特定选择可由技术人员在即时看护时确定，其中考虑到癌症的组织和阶段。如本文使用的术语“另类治疗方案”或“另类治疗”可包括例如，生物反应调节剂(包括多肽、碳水化合物和脂质生物反应调节剂)、毒素、凝集素、抗血管生成剂、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如Iressa (吉非替尼)、Tareeva (埃罗替尼)、Erbitiix (西妥昔单抗)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec )、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、万珂)；vegfr2抑制剂例如PTK787 (ZK222584)，Aurora激酶抑制剂(例如ZM447439);哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂、环加氧酶-2(C0X-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司、Rapamune.TM.);法尼基转移酶抑制剂(例如替匹法尼，Zarnestra);基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY 12-9566 ;硫酸化多糖替可加兰)；血管生成抑制剂(例如Avastin. TM.(贝伐单抗)；夫马洁林类似物，例如TNP-4 ;羧基氨基三唑；BB-94和BB-2516 ;沙立度胺；白细胞介素_12 ；利诺胺；肽片段；和针对血管生长因子和血管生长因子受体的抗体)；血小板衍生的生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、有丝分裂原激活的激酶抑制剂、有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶抑制剂、劳斯肉瘤病毒转化癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、小的低氧可诱导因子抑制剂、hedgehog抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂。此外，免疫治疗试剂也将被认为是另类治疗方案。实例包括趋化因子、化学趋向素、白细胞介素或组织因子。合适的免疫治疗剂还包括包含预成抗体的血清或Y球蛋白；非特异性免疫刺激佐剂；主动特异性免疫治疗；和过继免疫疗法。另外，另类治疗可包括其它基于生物的化学物质，例 如多核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因治疗载体等。此类另类治疗可以单独施用或与本文描述的其它治疗方案组合。另类治疗方案中使用的这些试剂的别名和商品名以及另类治疗方案中使用的试剂的另外的例子以及它们的使用方法包括剂量和施用方案是本领域技术人员已知的。此外，组合治疗中的另类治疗方案中使用的化疗剂和其它试剂的使用方法也是本领域技术人员已知的。具体地，合适的另类治疗方案包括但不限于针对癌细胞表面上的分子的抗体，例如针对下列的抗体Her2 (例如曲妥珠单抗)、EGF或EGF受体、VEGF (例如贝伐单抗)或VEGF受体、CD20等。治疗剂还可包括调节一种或多种补体激活、细胞介导的细胞毒性、诱导细胞调亡、诱导细胞死亡和调理素作用的任何抗体或抗体片段。例如，此类抗体片段可以是完整或部分Fe结构域。“抗体”意思是但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合或源自其它物种。抗体是由免疫系统产生的、能够识别和结合特异性抗原的蛋白。靶抗原一般具有多个结合位点，也称作表位，其被多个抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上的对应抗体。抗体包括全长免疫免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合目标靶抗原或其部分的抗原结合位点的分子。靶标包括癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的其它细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG, IgE, IgM, IgD 和 IgA)或亚类(例如 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 和 IgA2)。免疫球蛋白可以源自任何物种。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，其保留期望的生物活性。“抗体片段”一般是抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括Fab, Fab’，F(ab’ )2和Fv片段；diabody ;线性抗体；由Fab表达文库产生的片段；抗-独特型(抗-Id)抗体，⑶R (互补决定区)，和任意上述的表位结合片段，其免疫特异性地结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。本文所述的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种的抗体或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出期望的生物活性(U.S. Pat. No. 4，816，567)。本文的感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类源化”的抗体，其包含源自非人灵长类(例如旧世界猴或猿)的可变域抗原结合序列和人的恒定区序列。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的相互作用，其中表达Fe受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y RI、Fc Y RII和Fe Y RIII。为了测定目标分子的 ADCC 活性，可以进行体外 ADCC 测定法(U. S. Pat. No. 5，003，621; U. S. Pat. No. 5，821，337)。用于此类测定法的有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，目标分子的ADCC活性可以在体内测定，例如，在动物模型中，例如在Clyneset al PNAS (USA), 95:652-656 (1998)中公开的那样。“诱导细胞死亡”的抗体是引起活细胞变为死亡的抗体。细胞死亡可以在体外在不存在补体和免疫效应子细胞的情况下测定以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。因此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清进行(即在不存在补体的情况下)和在不存在免疫效应子细胞的情况下进行。为了测定抗体是否能够诱导细胞死亡，可以测定相对于未经处理的细胞的膜完整性的丧失，如通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD的摄取来测定。诱导细胞死亡的抗体是在BT474细胞中的PI摄取测定法中诱导PI摄取的那些抗体。“诱导细胞调亡”的抗体是诱导程序化细胞死亡的抗体，如通过annexin V的结合、DNA的片段化、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞片段化和/或膜囊泡(称作细胞凋亡小体)的形成所测定。如本文使用的“化学致敏剂”或“致敏剂”是可增强化疗剂、放疗治疗或另类治疗方案的治疗效应、并因此改善此类治疗或试剂的功效的药物。肿瘤或癌性细胞对于治疗的敏感性或抗性也可在动物中测定，例如人或啮齿类，通过例如测定肿瘤体积，肿瘤负荷或一段时间内的转移发生率。例如，对于人为大约2、大约3、大约4或大约6个月，对于小鼠为大约2-4、大约3-5或大约4-6周。如果相对于不存在组合物或方法的情况下的治疗敏感性或抗性，治疗敏感性的增加或抗性的减小是大约10%或更高，例如大约30%、大约40%、大约50%、大约60%、大约70%、大约80%或更高，至大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约10倍、大约15倍、大约20倍或更高，则此类组合物或治疗方法可以使肿瘤或癌细胞对于治疗性处理的应答敏感化。对于治疗性处理的敏感性或抗性的测定是本领域常规的，是本领域技术人员的技能范围内的。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可相互替换地使用，是指包含至少2个通过肽键或修饰的肽键例如可向肽提供另外的期望的性质(例如延长的半衰期)的肽等排物(修饰的肽键)共价连接的氨基酸残基的化合物。肽可包含至少2个氨基酸。本文描述的包含氨基酸的肽或蛋白也可通过天然过程被修饰，例如翻译后加工，或通过化学修饰技术，这是本领域熟知的。修饰可发生于肽中的任意地方，包括肽骨架，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应该理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度在给定肽的数个位点存在。对于肽的修饰的实例可包括PEG化，乙酰化，酰基化，ADP核糖基化，酰胺化，共价连接黄素，共价连接血红素部分，共价连接核苷酸或核苷酸衍生物，共价连接脂质或脂质衍生物，共价连接磷脂酰肌醇，交联，环化，形成二硫键，去甲基化，形成共价交联，形成胱氨酸，形成焦谷氨酸盐，甲酰化，Y-羧基化，糖基化，GPI锚定形成，羟基化，碘化，甲基化，豆蘧酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，硒化，硫酸化，转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，例如精氨酰化和泛素化。见，例如，Proteins-Structure andMolecularProperties, 2. sup. nd ed. , T. E. Creighton, W H. Freeman and Company, NewYork,1993 和 Wold F, Posttranslational Protein Modifications!Perspectives andProspects, pgs. l_12in Posttranslational CovalentModification of Proteins, B.C.Johnson, ed. , Academic Press, New York, 1983;Seifter et al. , Analysis for proteinmodifications and nonproteincofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 和 Rattanet al. (1992), Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging, "Ann NYAcad Sci 663:48-62。实质上相似的序列是与参考序列相差仅一个或多个如本文讨论的保守性替代的氨基酸序列。此类序列可以例如与另一实质上相似的序列在功能上是同源的。本领域技术人员将认识到，可被替代的本发明的肽中的单个氨基酸的方面。氨基酸序列相似性或同一性可通过例如使用BLASTP和TBLASTN程序来计算，其使用BLAST (基本局部比对搜索工具)2. O算法。用于计算氨基酸序列相似性或同一性的技术是本领域技术人员熟知的，BLAST算法的使用描述于Altschul et al. 1990，J Mol.Biol. 215:403-410and Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402。在其上进行比对的序列可以从多个数据库收集。蛋白质数据库的实例包括SWISS-PROT，其也提供与蛋白质的功能、其结构域结构、翻译后修饰、变体相关的高水平注释(Bairoch A. and Apweiler R. (2000)Nucleic Acids Res. 28(1):45-48;Bairoch A. andApweiler R. (1997) J. Mol. Med. 75 (5) : 312-316; Junker V. L. et al. (1999) Bioinformaticsl5(12) :1066-1007), TrEMBL a computer-annotated supplement ofSffISS-PROT thatcontains all the translations of EMBL nucleotidesequence entries(Bairoch A. andApweiler R. (2000) Nucleic Acids Res. 28 (I) : 45-48) ;nr 数据库比较所有的非冗余GenBank Q)S翻译和来自其它数据库例如FOB、SwissProt、PIR和PRF的蛋白质序列。蛋白质序列的比对可以这样进行使用已有的算法搜索数据库中与查询序列相似的序列。一种比对方法是 Smith-Waterman 算法(Smith, T. F. and Waterman, M. S. 1981.Journal of Molecular Biologyl47 (I) : 195-197),其用于确定如何产生查询序列与数据库序列之间的优化比对。此比对这样获得确定查询序列需要经历怎样的转化以匹配数据库序列。转化包括以一个字符替换另一个，和插入或删除一串字符。对于每个字符-字符比较分配得分一对于精确匹配和某些替代为正分，对于其它替代和插入/删除为负分。从统计上衍生的评分矩阵获得得分。产生最高得分的转化的组合用于产生查询序列与数据库序列之间的比对。Needleman-Wunsch(Needleman, S. B. and ffunsch, C. D. 1970. Journal ofMolecular Biology 48 (3) : 443-453)算法类似于 Smith-Waterman 算法,但是序列比较是全局的而非局部的。全局比较迫使整个查询序列针对整个数据库序列进行比对。虽然局部比对总是起始并终止于匹配，但是全局比对可以起始或终止于插入或删除(indel)。对于给定的查询序列和数据库序列，全局得分将小于或等于局部得分，这是由于末尾有插入删除。作为上述算法的备选，Hidden Markov Model (HMM)搜索(Eddy, S. R. 1996. CurrentOpinion in Structural Biology6 (3) : 361-365)可用于产生蛋白质序列比对。HMM评分加权了匹配后跟插入/删除或反之的概率。另外，HMM允许插入至删除的转变(反之亦可)和起始和终止状态的评分，以控制全局地还是局部地运行搜索。—种或多种上述算法可用于比对程序以产生蛋白质序列比对。本领域技术人员具有多种序列比对程序以从中挑选，其中引入了多种不同算法。比对程序的一个实例是BLASTP (Altschul, S. F. , et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402)。其它比对程序有CLUSTAL W和PILEUP。来自BLASTP运行的标准输出包含足够的信息以进行进一步 的插入删除分析，如下文描述。氨基酸可被描述为例如极性、非极性、酸性、碱性、芳香族或中性。极性氨基酸是可与水通过氢键合在生物或接近中性的pH相互作用的氨基酸。氨基酸的极性是在生物或接近中性的pH时的氢键合的程度的指示。极性氨基酸的实例包括丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸。非极性氨基酸的实例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。酸性氨基酸在中性PH时具有净负电荷。酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸在中性PH时具有净正电荷。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。芳香族氨基酸一般是非极性的，并且可以参与疏水相互作用。芳香族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸也可通过芳香侧链上的羟基参与氢键合。中性、脂肪族氨基酸一般是非极性的和疏水性的。中性氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。氨基酸可通过不止一种描述类别来描述。具有共同的描述类别的氨基酸可在肽中彼此替代。用于描述本发明的肽化合物的命名法沿用常规实践，其中氨基在每个氨基酸残基的左侧，羧基在右侧。在代表本发明的所选的具体实施方式
的序列中，虽然不具体显示，但氨基和羧基末端基团理解为在生理PH值时假定的形式，除非另有指明。在氨基酸结构式中，每个残基一般由单字符或三字符表示，对应于该氨基酸的通用名。氨基酸的亲水指数(hydropathy index)是表示氨基酸找出水性环境(负值)或疏水环境(正值)的倾向的一个度量(Kyte&Doolittle 1982. JMol Biol 157:105-132)。标准氨基酸的亲水指数包括丙氨酸(I. 8)、精氨酸(-4. 5)、天冬酰胺(-3. 5)、天冬氨酸(-3. 5)、半胱氨酸(2. 5)、谷氨酰胺(-3. 5)、谷氨酸(-3. 5)、甘氨酸(-0. 4)、组氨酸(-3. 2)、异亮氨酸(4. 5)、亮氨酸(3. 8)、赖氨酸(-3. 9)、甲硫氨酸(I. 9)、苯丙氨酸(2. 8)、脯氨酸(-1. 6)、丝氨酸(-0. 8)、苏氨酸(-0. 7)、色氨酸(-0. 9)、酪氨酸(-1. 3)和缬氨酸(4. 2)。具有相似亲水指数的氨基酸可在肽中相互替代。包含氨基酸的本文描述的肽应被理解为L或D构型。在本发明的肽和拟态中，D氨基酸可替代L氨基酸。本发明的肽中包含的氨基酸尤其是羧基或氨基末端的氨基酸可通过甲基化、酰胺化、乙酰化或以其它化学基团进行取代来进行修饰，这可改变肽的循环半衰期而不对它们的生物学活性造成不利影响。另外，在本发明的肽中可存在或不存在二硫键。自然界中可存在非标准氨基酸，其可以是遗传编码的或不是遗传编码的。遗传编码的非标准氨基酸的实例包括硒代半胱氨酸，有时被掺入一些蛋白质中的UGA密码子处，其通常可以是终止密码子；或吡咯赖氨酸，有时被插入一些蛋白质中的UAG密码子处，其通常可以是终止密码子。不是遗传编码的一些非天然氨基酸可形成于已经掺入肽中的标准氨基酸的修饰，或者可以是例如代谢中间体或前体。非标准氨基酸的实例 包括4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、Y-羧基谷氨酸、锁链素、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、羊毛硫氨酸、I-氨基环丙烷-I-羧酸、Y -氨基丁酸、肉碱、肌氨酸或N-甲酰基甲硫氨酸。标准和非标准氨基酸的合成变体也是已知的，并且可包括化学衍生的氨基酸，被标记以进行鉴定或追踪的氨基酸，或在α碳上具有多种侧链的氨基酸。此类侧链的实例是本领域已知的，并且可以包括脂肪族、单一芳香族、多环芳香族、杂环、异核、氨基、烷基氨基、羧基、甲酸胺、竣基酷、狐、脉、轻基、烧氧基、疏基、烧基疏基或其它含杂原子的侧链。其它合成氨基酸可包括α-亚氨基酸、非α氨基酸，例如β氨基酸，脱羧基或脱氨基酸。氨基酸的合成变体可以使用本领域已知的一般方法来合成，或者可以从商业供应者购买，例如RSPAmino Acids LLC(Shirley, Mass.)。为了进一步说明保守性氨基酸替代的含义，以下列出了 A-F组。下列组中的一个成员被同组中的另一成员替代被认为是保守性替代。A组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有下列侧链的修饰的氨基酸乙基、异丁基、一CH2CH20H、一CH2CH2CH20H、--CH2CHoHCH3和 CH2SCH3OB组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有乙基侧链的修饰的氨基酸。C组包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、环己基甲基和具有取代的苄基或苯基侧链的修饰的氨基酸。D组包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代或非取代的脂肪族、芳香族或苄酯(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环己基、苄基或取代的苄基)、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH-烷基化谷氨酰胺或天冬酰胺(例如甲基、乙基、正丙基和异丙基)和具有侧链一(CH2) 3C00H的修饰的氨基酸，及其酯(取代或非取代的脂肪族、芳香族或苄酯)，其酰胺，和其取代或非取代的N烷基化酰胺。E组包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、P-环精氨酸、g-羟基精氨酸、N-脒基瓜氨酸、2-氨基胍基丁酸、赖氨酸的同源物、精氨酸的同源物和鸟氨酸。F组包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有被一OH或一SH取代的C1-C5直链或支链烷基侧链的修饰的氨基酸。A-F组是示例性的，不是意在限制本发明。拟肽是包含非肽结构元件的模拟母肽的生物作用的化合物。拟肽可以不具有经典的肽性质，例如酶可裂解的肽键。母肽可以最初被鉴定为目标蛋白质上的结合序列或磷酸化位点，或者可以是天然产生的肽，例如肽激素。当筛选文库例如拟肽文库时，用于鉴定拟肽的测定法可包括母肽作为阳性对照用于比较目的。拟肽文库是可具有类似于母肽的生物活性的化合物的文库。如本文使用的术语“多核苷酸”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物，正义和反义链，可以是化学或生物化学修饰的，或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员容易地理解。此类修饰包括例如，标记、甲基化、使用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸，核苷酸间修饰，例如，不带电的连接(例如膦酸酯甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)，带电的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如多肽)和修饰的连接(例如α异头多核苷酸等)。还包括模拟多核苷酸的结合指定序列(通过氢键合和其它化学相互作用)的能力的合成的分子。如本文使用的“肽核酸”(PNA)是指修饰的核酸，其中核酸的糖磷酸酯骨架已被转化为N-(2-氨基乙基)_甘氨酸骨架。虽然DNA/RNA的糖-磷酸酯骨架在中性条件下经历负电荷，会产生互补链之间的静电排斥，但是PNA的骨架结构内在地不具有电荷。因此，没有静电排斥。因此，与常规核酸相比，PNA具有较高的稳定性以形成双键， 并具有识别碱性序列的高能力。此外，PNA—般比核酸更强健。PNA也可用于阵列中和如上文就寡核苷酸描述的其它杂交或其它反应。如本文使用的术语“载体”是指用于将外源或内源多核苷酸导入宿主细胞的多核苷酸化合物。载体包含核苷酸序列，其可编码一个或多个多肽分子。天然状态或已经历重组工程化的质粒、粘粒、病毒和噬菌体是通常使用的用于提供包含至少一个希望的分离的多核苷酸分子的重组载体的非限制性实例。如本文使用的“肿瘤抑制剂”是具有限制细胞的不受调控的生长的正常生物作用的基因或基因产物。如果肿瘤抑制剂的功能丧失，则发生不受调控的细胞生长。肿瘤抑制剂的功能对应物是癌基因——促进正常细胞生长的基因可被称作“原癌基因”。激活此类基因或基因产物的突变进一步将其转化为“癌基因”，其使细胞生长活性持续，但是为非调节控模式。肿瘤抑制剂基因和基因产物的实例是文献中熟知的，可包括PTC，BRCA1, BRCA2, pi6，APC, RB, WTl, EXT I, p53, NFl, TSC2, NF2, VHL 或 SPARC。本发明还提供了核酸构建体，其包含控制元件和可操作地连接于控制元件(例如适当的启动子)以表达本文描述的多肽的本文描述的核酸分子。蛋白表达依赖于RNA转录的水平，其继而又受到DNA信号的调节。类似地，mRNA的翻译至少需要AUG起始密码子，其通常位于信使的5’末端的大约10至大约100个核苷酸内。已表明AUG起始密码子侧翼的序列影响其被真核核糖体的识别，与完美的Kozak共有序列一致，产生优化翻译(见，例如Kozak, J. Molec. Biol. 196:947-950 (1987))。同样，外源核酸在细胞中的成功表达可能需要所得到的蛋白的翻译后修饰。因此，本发明提供了编码多肽的质粒，其中载体是例如P⑶NA3. I或其衍生物。本文描述的核酸分子优选包含可操作地连接于合适的启动子的编码区，所述启动子优选在真核细胞中有功能。病毒启动子，例如但不限于，RSV启动子和腺病毒主要晚期启动子可用于本发明。合适的非病毒启动子包括但不限于磷酸甘油激酶(PGK)启动子和延伸因子I α。非病毒启动子理想地是人启动子。另外的合适的遗传元件(其中很多是本领域已知的)也可连接于、附着于或插入本发明的核酸和构建体以提供另外的功能、表达水平或表达模式。也可使用用于表达SPARC家族基因的天然启动子，在这种情况下它们优选不用于天然编码它们的染色体中，除非被实质上改变该染色体的过程修饰。此类实质上改变的染色体可包括被逆转录病毒载体或相似的过程转染和改变的染色体。或者，此类实质上改变的染色体可包含人工染色体例如HAC、YAC或BAC。另外，本文描述的核酸分子可以可操作地连接于增强子以促进转录。增强子是DNA的顺式作用元件，其刺激邻近基因的转录。赋予来自很多物种的多种不同细胞类型中的所连接的基因的高水平转录的增强子的实例包括但不限于来自SV40的增强子和RSV-LTR。此类增强子可以与具有细胞类型特异性效应的其它增强子组合，或者任何增强子可以单独使用。为了优化多肽的产生，本发明的核酸分子可以进一步包含多腺苷酸化位点(在核酸分子的编码区之后)。同样，优选的是所有的正确转录信号(和翻译信号，如果适当)将被正确的排列，使得外源核酸将在其所被导入的细胞中正确表达。如果需要，外源核酸也可引入剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)以促进mRNA产生，同时维持框内、全长转录物。此外，本发明的核酸分子还可包含合适的序列用于加工、分泌、细胞内定位等。核酸分子可被插入任何合适的载体。合适的载体包括但不限于病毒载体。合适 的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、α病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体。载体优选具有天然或工程化的转化真核细胞例如CHO-Kl细胞的能力。另外，用于本发明中的载体可以是“裸的”核酸载体(即，具有极少或不具有封装它们的蛋白质、糖和/或脂质的载体)，例如质粒或游离体，或者载体可以与其它分子复合。可与本发明的核酸适当组合的其它分子包括但不限于病毒被膜、阳离子脂质、脂质体、聚胺、金颗粒和靶向部分，例如配体、受体或靶向细胞分子的抗体。根据本发明的SPARC多肽可以从重组宿主细胞表达并纯化。重组宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于细菌例如大肠杆菌，真菌细胞例如酵母，昆虫细胞包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞系，和哺乳动物细胞和细胞系。当根据本发明在细胞例如人类细胞中表达SPARC多肽时(无论在体外或在体内)，选择的用于编码Q3SPARC的多核苷酸的密码子可以针对给定的细胞类型(即物种)进行优化。用于密码子优化的很多技术是本领域已知的(见，例如 Jayaraj et al, Nucleic AcidsRes. 33 (9) : 3011-6 (2005) ; Fuglsang et al. , Protein Expr. Purif. 31(2):247-9(2003);ffu et al.，"The Synthetic GeneDesigner:a FlexibleWeb Platform to Explore Sequence Space of Synthetic GenesforHeterologous Expression, 〃csbw，2005IEEE Computational SystemsBioinformaticsConference—Workshops (CSBWi 05)，pp. 258-259 (2005))。在一些实施方式中，当表达和纯化SPARC多肽时，使用用于改善蛋白质稳定性的技术以防止形成包涵体(其为不可溶级份)，因此获得大量的多肽。积累于包涵体内的SPARC通常是无活性类型的SPARC，不保留其生理活性。纯化的SPARC多肽的溶解性可通过本领域已知的方法来改进。例如，也可通过表达功能片段而非全长多肽来改善溶解性。另外，为了增大表达的蛋白的溶解性(例如在大肠杆菌中)，可以通过降低生长温度、使用较弱的启动子、使用较低拷贝数的质粒、降低诱导子浓度、改变生长培养基等来降低蛋白合成速率，如Georgiou&Valax (CurrentOpinionBiotechnol. 7:190-197(1996))中所描述。这降低了蛋白合成速率，通常会获得更可溶的蛋白。也可添加对于蛋白的正确折叠或稳定性必不可少的辅基或辅因子，或添加缓冲剂以控制生长过程中的培养基中的PH波动，或添加1%的葡萄糖以抑制乳糖(其存在于多数富集培养基例如LB、2xYT中)对Iac启动子的诱导。也可向培养基中添加多元醇(例如山梨醇)和蔗糖，因为这些添加物引起的渗透压的升高导致渗透保护剂在细胞中的积累，其使天然蛋白结构稳定化。可以添加乙醇、低分子量的三元醇和二硫化物和NaCl。另外，分子伴侣和/或折叠酶可以与所需的多肽一起表达。分子伴侣通过与折叠中间体的短暂相互作用促进正确的异构化和细胞靶向。大肠杆菌分子伴侣系统包括但不限于=Gr0ES-Gr0EUDnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。折叠酶加速速率限制步骤和折叠途径。有3种类型的折叠酶发挥重要作用肽基脯氨酰顺式/反式异构酶(ΡΡΓ S)、二硫化物氧化还原酶(DsbA)和二硫化物异构酶(DsbC)、蛋白质二硫化物异构酶(PDI)，其为催化蛋白质半胱氨酸氧化和二硫键异构化的真核蛋白。一种或多种这些蛋白与靶蛋白的共同表达可产生较高水平的可溶性靶蛋白。SPARC多肽可以以融合蛋白形式产生，以改善其溶解性和产量。融合蛋白包含SPARC多肽和与其框内融合的第二多肽。第二多肽可以是本领域已知的用于改善与其融合的多肽的溶解性的融合伴侣，例如，NusA，细菌铁蛋白(BFR)，GrpE，硫氧还蛋白(TRX)和谷 胱甘肽-S-转移酶(GST)。Novagen Inc. (Madison, Wis.)提供了 pET 43. I 系列载体，其允许形成NusA-靶标融合物。当用作融合伴侣时，DsbA和DsbC也显示出对于表达水平具有有利效应，因此可用于与SPARC多肽融合以实现更高的溶解性。在一个实施方式中，以包含Q3SPARC缺失突变体多肽和融合伴侣硫氧还蛋白的融合多肽的形式产生SPARC多肽，如U. S. Pat. No. 6，387，664所描述，该文献通过引用方式全文并入本文。可以在大肠杆菌中大量产生硫氧还蛋白-SPARC融合物，作为容易配制的可溶性蛋白，而不丧失生理活性。虽然U. S. Pat. No. 6，387，664提供了其中SPARC融合于硫氧还蛋白的C末端的SPARC融合蛋白，但是应理解，为了本发明的目的，SPARC多肽可融合于第二多肽的N末端或C末端，只要保持其致敏功能。本发明的多肽也可在体外合成，例如使用任何合适的体外翻译系统，例如TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega, Madison, WI)，兔网状细胞裂解物，麦胚抽提物等。或者，根据本发明制备的多肽可以通过任何合适的固相或液相程序化学合成，包括例如平版印刷、Fmoc固相和t-Boc固相肽合成方法。“分离的或纯化的”意思是构成至少75%、至少90%、至少95%、至少99%所存在的多肽或多核苷酸。根据本发明的多核苷酸可通过任何合适的方法纯化。本发明的多肽可通过本领域普通技术人员已知的任何适当的方式纯化，包括例如，Sage:Purification ofSPARC/osteonectin, Curr. Protocols Cell Biol. 2003Feb;Chapter 10:Unit 10. 11 中讨论的方法，该文献通过引用方式全文并入本文。或者，可以使用亲和色谱或沉淀，使用任何合适的抗体，表位标签，包括例如myc，gfp, V5, FITC, HA, S-tag, T7等或任何其它合适的亲和系统，包括例如生物素/亲和素，聚组氨酸/Nickel，GST等。就上述核酸和蛋白而言，用于本文的核酸、肽或蛋白的“对应性”的一个度量是序列之间的相对“同一性”。在肽或蛋白质的情况下，或在根据编码的肽或蛋白确定的核酸的情况下，对应性包括与指定的肽或蛋白具有至少大约50%同一性、或者至少大约70%同一性、或者至少大约90%同一性、或甚至大约95%并且也可以是至少大约98%-99%同一性。核酸之间的同一性的优选度量与上文就肽所指定的是相同的，至少大约90%或至少大约98-99%同一性为最优选。
如本文使用的术语“同一性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列同一性。同一性可通过比较每个序列中的位置来确定，其可以与为了比较的目的是一致的。如果两个氨基酸或核酸序列具有至少大约75%的序列同一性，优选至少大约90%的序列同一性，甚至更优选至少95%的序列同一'丨生，最优选至少大约98%-99%的同一'丨生,则它们被认为是实质上同一的。序列同一'丨生可通过目前使用的BLAST算法来确定，其最初描述于Altschul etal. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST算法可以根据公开的缺省设定来使用。当被比较的序列中的某位置被相同的碱基或氨基酸占据时，该分子被认为在该位置具有同一性。序列之间的同一性的程度是序列具有的匹配位置的数目的函数。 核酸序列的同一性的另外的度量是确定两个序列在低度严格条件下、优选在高度严格条件下是否彼此杂交。当此类序列在高度严格条件下杂交时，它们是实质上同一的。在低度严格条件下与滤器结合序列的杂交可以在例如下列条件下进行O. 5M NaHPO4, 7% 十二烷基硫酸钠(SDS)，ImM EDTA, 65。C ;在 O. 2 倍的 SSC/0. ISDS 中在 42 ° C 洗漆(见 Ausubel et al. (eds. ) 1989, Current Protocols in MolecularBiology,Vol. 1，Green Publishing Associates, Inc.，and John Wiley&sons, Inc.，NewYork, at p. 2. 10. 3)。或者，在高度严格条件下与滤器结合的序列的杂交可以在例如下列条件下进行0. 5M NaHPO4, 7% (SDS)，ImMEDTA, 65。C ;在 O. 2 倍的 SSC/0. 1%SDS 中在68° C洗漆(见Ausubel etal. (eds. ) 1989,见上文)。杂交条件可以根据已知的方法修改，这取决于目标序列(见 Ti jssen, 1993，Laboratory Techniques in BiochemistryandMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I，Chapter2〃0verview of Principles in Hybridization and the Strategy ofNucleic Acid ProbeAssays"，Elsevier, N. Y.)。一般地，选择严格条件为比特定序列在确定的离子强度和pH时的热熔解点低大约5° C。本领域技术人员将理解序列内的突变位置的数值名称是相对于特定序列。同样，同一个位置可以被分配不同的数值名称，这取决于序列编号的方式和所选的序列。此外，序列变化例如插入或删除可改变相对位置，随之改变特定核苷酸和突变位点处或突变位点周围的数值名称。基因治疗是涉及改变活细胞的遗传材料以对抗疾病的医疗干预。对于很多不同类型的癌症和其它疾病在临床试验(以人进行的研究)中正在研究基因治疗。因此，本发明还提供了编码适合用于“基因治疗”的SPARC多肽(见例如Patil et al.，AAPSJ. 7(1) :E61-77(2005))的分离的核酸分子。一般地，使用载体例如如本文公开的那些来将基因递送至细胞。用于基因治疗的多数常见类型的载体是病毒。在基因治疗中用作载体的病毒是遗传失能的它们不能复制自身。多数基因治疗临床试验依赖于鼠逆转录病毒以递送需要的基因。用作载体的其它病毒包括腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒。合适的病毒基因治疗载体和它们在体内和离体的施用模式是本领域已知的。基因治疗可在离体和体内进行。通常而言，在离体基因治疗临床试验中，来自患者血液或骨髓的细胞被取出并在实验室中生长。将细胞暴露于携带所需基因的病毒。病毒进入细胞，所需基因成为细胞DNA的一部分。细胞在实验室中生长，然后通过注射进入静脉而返回至患者。使用体内基因治疗，可使用载体例如病毒或脂质体将所需基因递送至患者体内的细胞。本领域普通技术人员将认识到，由于遗传密码的通用性，任何给定氨基酸序列的知识允许本领域普通技术人员容易地想到可编码所述氨基酸序列的多肽的特定多核苷酸序列的有限数目。此外，本领域普通技术人员可容易地通过“密码子优化”过程来确定编码用于在任何给定物种中表达所述氨基酸序列的多肽的最佳的多核苷酸序列，密码子优化是本领域熟知的(见例如，Villalobos et al. :Gene Designer:a syntheticbiology toolfor constructing artificial DNA segments. BMCBioinformatics. 2006Jun. 6;7:285)。如本文使用的“载体”是指用作介质用于将活性药物成分(API)递送至合适的体外或体内作用位点的任何物质。因此，载体可作为包含API的治疗性或实验性试剂的制剂的赋形剂。优选的载体能够维持API为能够与T细胞相互作用的形式。此类载体的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank溶液和其它含水生理平衡溶液或细胞培养基。含水载体也可包含接近受体的生理条件所需的适 当的辅助物质，例如，增强化学稳定性和等渗性。合适的辅助物质包括例如，乙酸钠，氯化钠，乳酸钠，氯化钾，氯化钙，脱水山梨醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯和用于产生磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。如本文使用的“抗癌疫苗”意思是包含肿瘤相关抗原或表位(可引发针对它们的免疫应答)的组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了包含具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的肽抗原或具有相对于SEQ ID NO: I所示氨基酸序列替代、删除、插入和/或添加了一个或多个氨基酸并仍然具有免疫刺激活性的氨基酸序列的肽抗原的抗癌疫苗。在另一个方面，本发明提供了包含SEQID NO: I的肽的前述部分并具有免疫刺激活性的肽抗原。在另一个方面，本发明提供了具有相对于SEQ ID NO: I的肽抗原的前述部分替代、删除、插入和/或添加了一个或多个氨基酸并仍然具有免疫刺激活性的氨基酸序列的肽抗原。上述肽抗原优选可激活识别癌抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞。在另一个方面，本发明提供了辅助T细胞，细胞毒性T淋巴细胞，包含这些细胞的免疫细胞群体，其使用上述肽抗原或其混合物被体外刺激诱导。在另一个方面，本发明提供了辅助T细胞，细胞毒性T淋巴细胞，包含这些细胞的免疫细胞群体，其使用上述肽抗原或其混合物被体外刺激诱导，和免疫激活剂。免疫激活剂优选为细胞生长因子或细胞因子。疫苗优选可进一步包含佐剂，例如完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂，明矾，卡介苗，粘附分子的激动剂和改性剂，破伤风类毒素，咪喹莫特，montanide, MPL和QS21。在另一个方面，本发明提供了用于抑制肿瘤的方法，其包括将上述辅助T细胞、细胞毒性T淋巴细胞或包含这些细胞的免疫细胞群体导入体内。上述方法优选用于预防和/或治疗癌症。在另一个方面，本发明提供了用于产生本发明的辅助T细胞或细胞毒性T淋巴细胞或包含这些细胞的免疫细胞群体的细胞培养溶液，其包含上述肽抗原或其混合物。在另一个方面，本发明提供了用于产生本发明的辅助T细胞或细胞毒性T淋巴细胞或包含这些细胞的免疫细胞群体的细胞培养试剂盒，其包含上述细胞培养溶液和细胞培养容器。在另一个方面，本发明提供了编码上述肽抗原的DNA。在另一个方面，本发明提供了癌症疫苗，其包含本发明的上述DNA，或包含上述DNA的重组病毒或重组细菌。上述癌症疫苗优选还包含佐剂。疫苗可包含多种肽，多种肽可依赖于待治疗的肿瘤。疫苗还可包含抗原呈递细胞，例如树突细胞，更具体地，以肽脉冲化或载入了肽的树突细胞，并用作细胞疫苗以刺激针对该肽并因此针对肿瘤的T细胞免疫力。本发明的药物组合物的施用可通过任何合适的途径进行，包括但不限于静脉内、皮下、肌内、腹膜内、肿瘤内、口、直肠、阴道、膀胱内和吸入施用，其中静脉内和肿瘤内施用是最优选的。组合物还可包含任何其它合适成分，特别是用于增强组合物的稳定性和/或其终端用途。因此，存在本发明的组合物的多种合适的制剂。以下制剂和方法仅是示例性的，无意限制。
如果需要，药物组合物还可包括另外的治疗性或生物活性试剂。例如，可存在用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子，例如布洛芬或类固醇可以是组合物的一部分，以减少与体内施用药物组合物相关的肿胀和炎症，以及生理疼痛。载体通常可以是液体，但也可以是固体，或液体与固体的组合。载体理想地是生理上可接受的(例如，药学上或药理学上可接受的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。生理上可接受的载体是本领域熟知的和容易获得的。载体的选择至少部分地可通过靶组织和/或细胞的定位和用于施用组合物的特定方法来确定。通常而言，此类组合物可以配制为可注射的液体溶液或悬浮液；也可制备适合用于制备溶液或悬浮液(在注射前添加液体)的固体形式；制剂也可被乳化。适合注射使用的药物制剂包括无菌水溶液或分散液；包含已知蛋白稳定剂和冻干保护剂的制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情形下，制剂必须是无菌的，并且必须到达容易脱离注射器的流动性程度。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂例如羟基纤维素适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。本发明的肽可以以中性或盐的形式配制于组合物中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)并且是与无机酸例如盐酸或磷酸形成的，或与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。适合于胃肠外施用的制剂包括含水和非含水的、等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抗菌剂和使制剂与期望受体的血液等渗的溶质，以及含水和非含水的无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以单元剂量或多剂密封容器的形式呈现，例如安瓿和小瓶，并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在临使用前添加用于注射的无菌液体赋形剂例如水。即时注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和之前描述的种类的片剂制备而来。在本发明的优选实施方式中，配制含有肽配体结构域的缀合物用于注射(例如胃肠外施用)。在这个方面，制剂理想地适合于肿瘤内施用，但也可配制用于静脉内注射，腹膜内注射，皮下注射等。如果需要，本发明还提供这样的实施方式其中本发明的肽进一步缀合于聚乙二醇(PEG)。PEG缀合能够延长这些多肽的半衰期，减小多肽的免疫原性和抗原性，并改善它们的生物活性。如果使用的话，可使用任何合适的PEG缀合方法，包括但不限于使甲氧基-PEG与肽的可利用的氨基或其它活性位点例如组氨酸或半胱 氨酸反应。另外，重组DNA技术可用于将具有PEG活性基团的氨基酸添加至含有肽配体结构域的缀合物。此外，可释放的和杂交PEG化策略可用于本发明的方面，例如多肽的PEG化，其中添加至包含肽配体结构域的缀合物分子中的某些位点的PEG分子在体内被释放。PEG缀合方法的实例是本领域已知的。见例如 Greenwald et al. , Adv. Drug Delivery Rev. 55:217-250 (2003)。适合通过吸入施用的制剂包括气雾剂制剂。气雾剂制剂可被置于加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。它们也可被配制为非加压制剂，用于从喷雾器或雾化器递送。适合于肛门施用的制剂可以配制为栓剂，其是通过将活性成分与多种基底例如乳化基底或水溶性基底混合来制备的。适合阴道施用的制剂可呈现为子宫托、塞、霜、凝胶、糊、泡沫或喷雾，其包含活性成分和载体，例如本领域技术已知的适当载体。另外，本发明的组合物可包含另外的治疗性或生物活性试剂。例如，可以存在用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子，例如布洛芬或类固醇可以是组合物的一部分，以减少与体内施用药物组合物相关的肿胀和炎症，以及生理疼痛。在吸入治疗的情况下，本发明的药物组合物理想地是气雾剂的形式。用于施用试齐IJ(如果是固体形式)的气雾剂和喷雾发生器是可获得的。这些发生器提供可被呼吸或可吸入的颗粒，并以适合人类施用的速率产生一定体积的包含预先确定的定量剂量的药物的气雾剂。此类气雾剂和喷雾发生器的实例包括本领域已知的定量剂量吸入器和吹入器。如果是液体形式，则本发明的药物组合物可通过任何合适的装置被气雾化。当用于静脉内、腹膜内或肿瘤内施用时，本发明的药物组合物可包含活性化合物的无菌水性和非水性注射溶液、悬浮液或乳液，其制剂优选为与期望的受体的血液是等渗的。这些制剂可包含下列一种或多种抗氧化剂、缓冲剂、表面活性剂、共溶剂、抑菌剂和使组合物与期望受体的血液等渗的溶质，和本领域已知的其它制剂成分。水性和非水性无菌悬浮液可包含悬浮剂和增稠剂。组合物可以以单元剂量或多剂容器的形式呈现，例如密封的安瓶和小瓶。本发明的方法也可以是组合治疗的一部分。词语“组合治疗”是指与另一种治疗性组合物按照依次或同时的方式施用本发明的治疗剂，从而在经历治疗的哺乳动物中实现该组合的有益效应。本发明的任意组合物的优化剂量可通过本领域普通技术人员已知的常规方法来确定。用于将合适的诊断剂、治疗剂、化疗剂、放射性核素、多肽等与抗体或其片段缀合的方法在本领域中有完善的描述。例如，本发明提供了结合SPARC的多肽，SPARC多肽或抗-SPARC多肽抗体缀合物，例如SPARC-放射性核素、SPARC-药物、SPARC免疫调节剂或SPARC毒素缀合物。任意合适的方法可用于本发明以形成多肽缀合物。例如但不限于SPARC蛋白中的游离氨基，例如赖氨酸的ε氨基，可与反应剂例如碳二亚胺或异双官能试剂缀合。或者，例如多肽的巯基可用于缀合。另外，结合于糖蛋白或抗SPARC抗体例如抗-SPARC多肽抗体的糖部分可被氧化以形成醛基，醛基可用于本领域已知的多种偶联程序。根据本发明形成的缀合物可以在体内是稳定的或不稳定的，例如酶可降解的四肽键，或酸不稳定的顺式乌头酰基或腙连接。另外，编码合适的融合蛋白的合适可用于产生偶联的多肽，例如GFP或毒素融合蛋白。实施例I本实施例证明了 Sparc和Abraxane 与抗血管生成试剂Sutent 在PC3模型中的相互作用。测定了以单独的Abraxane (15mg/kg,每日施用，持续5日)，Abraxane与Sutent (Sutent 以 30mg/kg 每日施用，持续 8 周)，Abraxane 和外源 SPARC (SPARC 以 O. 2mg/ms每周施用2次,施用8周)，Abraxane、Sutent和SPARC —起进行了处理的小鼠中的肿瘤体积。图I显示了这些测试条件下肿瘤体积(mm3)相对于时间(天数)的作图。如图所 示，施用Abraxane .在整个实验过程中引起相对于对照而言显著减小的肿瘤体积。当Abraxane 与sparc —起施用时,肿瘤体积稍微增大,这表明(如实施例I所示)外源施用的sparc在该系统中使Abraxane 失敏。当抗血管生成试剂Sutent 与sparc和Abraxane 一起施用时,SP ARC/Abraxane 组合的效果显著改善。图I还证明了 Abraxane 与抗血管生成试剂Sutent —起施用时产生比单独施用Abraxane 大得多的肿瘤体积的减小。令人惊奇的是，施用外源sparc与Abraxane +Sutent 消除了一些 Abraxane +Sutent 的协同效应。这说明sparc拮抗Sutent 的抗血管生成活性。这些数据说明SPARC使这些特定的抗肿瘤试剂失敏的机制是通过血管生成活性。实施例2该实施例显示了 SPARC的血管生成行为的表征。使用维持于中空纤维生物反应器中的HEK 293细胞表达和纯化重组人SPARC和遗传工程化的变体。使用HUVEC管形成测定法和HUVEC芽形成珠测定法测定rhSPARC及其变体的血管生成活性。在HUVEC管形成测定法中，rhSPARC在10 μ g/mL是促血管生成的，在100 μ g/mL是抗血管生成的。管形成测定法的结果可以见图2。在芽形成测定法中，添加rhSPARC引起更多的被周细胞支持的成熟血管壁的形成，这说明了 SPARC除了最初的刺激血管生成本身之外的作用。在这些测定法中测试的具有删除和单/双氨基酸置换的另外的rhSPARC变体包括Q3删除(BI02)、推定的血管生成结构域的倒位(BI05)、推测的血管生成结构域中的双K>Q置换(BIOll)、推定的cat印hsin K识别位点的遗传消除(BI08)和rhSPARC的蛋白水解裂解产物。末端氨基酸分析表明血管生成活性位于SEQ ID NO: I。实施例3该实施例显示了 SPARC的血管生成结构域的鉴定。制备了 SPARC的蛋白水解降解产物并命名为SPARC-d。SPARC_d是由两种形式的C末端截短的SPARC组成的混合物。图3显示了 SDSPAGE测定，其中SPARC d与野生型SPARC并排跑胶。SPARC-d的主要形式(在图3中的凝胶中标记为B)是氨基酸233-286 (SEQ IDNO: 2)组成的C末端序列的缺失部分。
图4显示了以野生型SPARC和SPARC-D进行的HUVEC 3-D管形成测定法的结果。图中可见野生型SPARC的血管生成行为，如之前的实施例中所描述；血管生成行为随着浓度接近10ug/ml而升高,随着浓度接近100ug/ml而降低。然而，SPARC_d的结果表明截短蛋白的C末端消除了 SPARC血管生成活性。基于该测定法的结果，可以鉴定SPARC的血管生成结构域的位置是C末端的54个氨基酸序列(SEQ ID NO: I)内。在描述本发明的上下文中特别是下列权利要求的语境中，术语“a”和“an”和“the”以及类似指称的使用被理解为涵盖了单数和复数，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。术语“包含” “具有” “包括”和“含有”被理解为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)，除非另有指明。本文记载的数值范围仅仅意在作为个别指称落在该范围内的每个单独数值的简便方法，除非本文另有指明，并且每个单独数值皆包括在本说明书中，如同它个别地在本文中被记载一样。本文描述的所有方法可通过任何合适的顺序进行，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“例如” )的使用仅是为了更好地例示本发明，不对本发明的范围具有限制作用，除非另外要求。本说明书中的语言不应被理解为表明任何不要求保护的元件对于实施本发明是必不可少的。在本文中描述了优选实施方式，包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。这些优选实施方式的变体对于阅读了上述说明书的本领域普通技术人员将变得明显。本发明人预期技术人员会视需要利用此类变体，本发明人期望本发明以除了本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括本文随附的权利要求中提及的主题的所有修饰和等同物，如适用法律所允许。此外，上述描述的元件的所有可能变体的任何组合包括在本发明内，除非本文另有指明或上下文明显矛盾。
权利要求
1.使用治疗法治疗患有SPARC依赖性疾病的动物的方法，包括 Ca)定量所述动物的疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽和包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量； (b)定量一个或多个患有相同的SPARC依赖性疾病的、已知响应于所述治疗法的其它动物的疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽和包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量； (c)计算(b)中测定的SPARC血管生成结构域多肽和包含SPARC血管生成结构域的全长SPARC的量的平均值； Cd)将(a)中测定的所述量与(c)中测定的所述平均值相比较；和 (e)如果(a)中测定的所述量大于或等于(c)中测定的所述平均值，则施用所述治疗法。
2.使用治疗法治疗患有SPARC依赖性疾病的动物的方法，包括 Ca)定量所述动物的疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽的量； (b)定量一个或多个患有与(a)中所述动物相同的SPARC依赖性疾病的、已知响应于所述治疗法的其它动物的疾病位点处的SPARC血管生成结构域多肽的量； (c)计算(b)中测定的SPARC血管生成结构域多肽量的平均值； (d)将(a)中测定的所述量与(c)中测定的SPARC血管生成结构域多肽的量的平均值相比较；和 (e)如果(a)中测定的所述量大于或等于(C)中测定的所述量的平均值，则施用所述治疗法。
3.权利要求I或2的方法，其中SPARC依赖性疾病是肿瘤、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩或子宫内膜异位症或糖尿病性视网膜病。
4.权利要求I或2的方法，其中所述治疗法是下列一种或多种化疗、放射或生物学方案。
5.治疗患有SPARC依赖性病况或疾病的动物的方法，包括向动物施用治疗有效量的与包含SPARC血管生成结构域的多肽结合并在疾病位点处聚集的多肽。
6.权利要求5的方法，其中所述多肽缀合于化疗、放射或生物试剂。
7.权利要求5或6的方法，其中所述多肽是抗体。
8.治疗患有SPARC依赖性病况或疾病的动物的方法，包括向动物接种免疫有效量的包含SPARC血管生成结构域的免疫原。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述动物是人。
全文摘要
本发明提供了组合物和方法，其利用了SPARC羧基血管生成结构域的发现。
文档编号A61P35/00GK102858362SQ201180020390
公开日2013年1月2日 申请日期2011年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者V·特里鲁, D·克瑙尔, N·德塞 申请人:阿布拉西斯生物科学有限责任公司